大鼠基底外側杏仁核組蛋白乙?；瘜岱瘸砂a記憶的調控作用

喬曉孟，殷芳圓，李云肖，魏曙光，賴江華

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大鼠基底外側杏仁核組蛋白乙?；瘜岱瘸砂a記憶的調控作用

喬曉孟，殷芳圓，李云肖，魏曙光，賴江華

西安交通大學法醫學院 ， 西安 710061

為了探索組蛋白乙?；瘜岱瘸砂a記憶相關分子表達調控機制，文章選取健康成年雄性SD大鼠34只，隨機分為正常對照組(n = 6)及基底外側杏仁核(Basolateral amygdala, BLA)顱內定位手術組(n =28)。在條件性位置偏愛(Conditioned place preference, CPP)訓練階段，大鼠BLA內給予組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹(Trichostafin A, TSA)并且腹腔注射嗎啡溶液(10.0 mg/kg)，對照組給予相同體積的10%二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)或鹽水。應用蛋白質印記方法，檢測嗎啡誘導大鼠CPP建立后BLA內組蛋白H3K14乙?；湍X源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白表達水平。結果顯示，腹腔注射10 mg/kg嗎啡能成功建立CPP。嗎啡、TSA聯合給藥組大鼠比單純嗎啡給藥組大鼠表現出更強烈的CPP(<0.0001)。嗎啡和TSA都能使BLA內的組蛋白H3乙?；胶虰DNF的表達顯著增高(< 0.0001)，同時二者之間具有協同作用。結果表明，大鼠BLA內組蛋白乙?；脚c嗎啡成癮記憶形成有關，抑制BLA內組蛋白去乙?；?Histone deacetylases, HDACs)的活性可強化嗎啡誘導的線索記憶的形成；大鼠BLA內BDNF參與了嗎啡誘導的線索記憶的形成并可能受到組蛋白乙?；恼{控。

嗎啡；條件性位置偏愛；基底外側杏仁核；組蛋白乙?；?/p>

藥物成癮是一種慢性、復發性腦疾病，其主要特征為對藥物的耐受、強烈渴求、強迫性覓藥行為，以及中斷用藥后出現戒斷癥狀[1]，不僅會給成癮者自身造成嚴重的精神和軀體危害，還會引起嚴重的社會經濟和公共衛生問題?！?013年中國禁毒報告》顯示，截至2012年底，我國登記在冊的吸毒人數有209.8萬余，其中濫用阿片類毒品者有127.2萬人，占60.6%。目前對以嗎啡為代表的阿片類藥物成癮的發生、發展機制仍知之甚少，并且對阿片類藥物成癮的臨床防治也缺乏理論指導。因此，對嗎啡成癮的神經生物學機制進行研究就顯得十分緊要和迫切。

研究提示，表觀遺傳變異的長時穩定性可能是成癮記憶長期存在的一個重要機制[2]。組蛋白乙?；潜碛^修飾的重要方式之一，越來越多的證據表明，組蛋白的乙?；?去乙?；{控機制在許多重大腦功能中發揮著至關重要的作用，如神經元分化[3]、神經退行性變[4,5]、晝夜比率[6]、癲癰發作[7,8]、記憶形成及藥物成癮[9~11]。組蛋白去乙?；?Histone deacetylases, HDACs)可通過催化組蛋白殘基末端的去乙?；磻獊碚{節下游基因的表達，從而產生持久的神經生物學改變并最終影響個體行為調控。然而，HDACs在嗎啡成癮記憶形成中的作用及其對記憶相關重要基因的表達調控尚不清楚。腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)已經被證明對學習記憶、突觸可塑性以及維持多巴胺能神經元的存活和功能起到十分重要的作用[12]，然而在慢性嗎啡作用下這些分子的具體變化尚未見報道。本研究通過觀察大鼠嗎啡成癮條件性位置偏愛(Conditioned place preference, CPP)建立后大鼠BLA內組蛋白H3K14的乙?；胶虰DNF的蛋白表達水平，探索組蛋白乙?；瘜τ洃浵嚓P分子的表達調控。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠34只，8周齡左右，體重230~250 g，由西安交通大學動物實驗中心提供。隨機分為正常對照組(即homecage組，不參與任何手術及訓練；= 6)、基底外側杏仁核(Basolateral amygdala, BLA)顱內定位手術組(= 28)。BLA顱內定位手術根據造模后的不同給藥方案分為4個亞組，分別為：鹽水+二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)組(saline + DMSO,= 7)，鹽水+曲古抑菌素A(Tri-chostafin A，TSA)組(saline + TSA,= 7)，嗎啡+DMSO組(morphine + DMSO,= 7)，嗎啡+TSA組(morphine + TSA,= 7)。各組分籠飼養，自由飲水、進食。

1.2 BLA顱內定位術

大鼠用20%戊巴比妥鈉，按50 mg/kg腹腔注射麻醉。俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技公司)上，沿顱頂正中線切開皮膚，暴露頭骨，按照G. Paxinos大鼠腦立體定位圖譜第五版[13]定位：前囟?2.9 mm；中線兩側旁±5.0 mm；距顱骨表面高度?7.5 mm，用標記筆標記，用牙科鉆在標記處鉆孔，在顱骨表面固定2顆微型螺釘，去除進樣器，先左后右，分別插入套管至BLA注射區，用玻璃離子體水門汀(粉：水=1 : 1)覆蓋整個腦切面待干燥后抹一層牙托粉(義齒基托樹脂Ⅱ型)進一步固定。每次BLA內微量給藥時，用尖端突出于引導套管1.0 mm、容量為1.0 μL的微量注射器，抽吸1.0 μL的TSA(美國Sigma-Aldrich公司)溶液，將注射器經引導套管插入BLA上方，用同一速度緩慢推注藥物注射入BLA，注射用時大于60 s。藥物全部推進完畢后針頭原位停留60 s以促進藥物在腦組織中的擴散，并防止外溢。對照組大鼠雙側給予10%DMSO(美國Sigma-Aldrich公司)作為對照。

1.3 嗎啡CPP模型的建立與測試

自然偏愛測試(1~2 d)：建立CPP前，第1 d上午8: 00將實驗箱(上海吉量軟件科技公司)隔板取走，讓大鼠自由在實驗箱兩側適應觀察15 min，第2 d讓大鼠在箱子內自由走動15 min，并記錄其在兩側各停留的時間，確定大鼠偏好傾向，以非天然偏愛箱(白箱)為嗎啡伴藥箱。嗎啡CPP建立：第3 d，嗎啡組大鼠BLA核團內微量注射165mmol/L的TSA溶液(溶于DMSO中)或等體積的10%DMSO，30 min后腹腔注射10 mg/kg嗎啡(沈陽第一制藥廠)溶液，然后將其放置于白箱，用隔板封閉CPP箱，使大鼠在白箱中訓練30 min；同時，鹽水組BLA內注射TSA或DMSO，隨后腹腔注射生理鹽水，然后將其放置于白箱，用隔板封閉CPP箱，使大鼠在白箱中訓練30 min。第4 d，所有大鼠BLA內給藥后均腹腔注射生理鹽水，然后將其放置于黑箱，用隔板封閉CPP箱，使大鼠在黑箱中訓練30 min。條件性測試：第5 d，所有大鼠均不給予任何藥物，將CPP箱中間的隔板打開，使大鼠可在兩箱中自由穿梭，測試時間為15 min (900 s)，記錄大鼠在各箱中的停留時間、活動路程及穿梭次數。

為更好地觀察TSA對嗎啡CPP建立過程的影響，本研究共經歷4個訓練循環(3~4 d、6~7 d、9~10 d、12~13 d)和4次條件性測試(5 d、8 d、11 d、14 d)，如圖1所示。

1.4 蛋白檢測

CPP測試結束后即刻以頸椎脫臼法處死大鼠，剝離大腦，分離BLA組織，每20 mg加入1.0 mL預冷的RIPA裂解液(預先加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，提取蛋白質。加入樣品緩沖液，沸水浴5 min，離心后取上清，進行12%SDS-PAGE電泳，采用半干法將蛋白轉移至PVDF膜。用5%的牛血清蛋白封閉液室溫封閉PVDF膜2 h。將抗乙?；M蛋白H3K14兔多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)、抗BDNF兔多克隆抗體(美國Abcam Technology公司)、抗GAPDH小鼠多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)用封閉液稀釋至1:1000濃度，4℃冰箱孵育過夜。TBS-T洗膜3次，每次10 min，將相應的二抗用TBS-T稀釋至1：10000，室溫下孵育1.5 h。TBS-T洗膜4次，每次10 min，進行化學發光檢測。采用美國Bio-Rad公司的Quantity One軟件分析條帶結果，計算條帶的光密度，進行相對定量分析。計算檢測的目的蛋白與內參蛋白(GAPDH)條帶的光密度比值來表示檢測蛋白的相對表達水平。

圖1 嗎啡CPP流程圖

M: 嗎啡; S: 鹽水。

1.5 數據處理與統計分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件對數據進行統計分析，實驗結果均使用均值±標準誤(mean±SEM)來表示。大鼠總活動距離、總穿梭次數以及CPP評分均采用重復測量的雙因素方差分析并采用Tukey’s post hoc 檢驗進行兩兩比較。BLA內BDNF表達量以相對于各組中Sal+DMSO組的相對倍數表示，采用雙因素方差分析研究嗎啡和TSA對蛋白表達的影響。以< 0.05為顯著性檢驗水準。

2 結果與分析

2.1 大鼠體重變化

2.1.1 手術恢復期

手術結束后，大鼠經歷連續5 d的恢復期，以消除因手術應激、傷痛、感染等因素影響總體代謝，從而對行為學實驗造成干擾。在恢復期，本文測量了大鼠的體重變化，如圖2所示。雙因素方差分析表明，在整個恢復期手術組(experimental，n = 28)大鼠體重與Hc組(homecage，n = 6)相比沒有明顯區別(Ftime (4, 150)= 0.9523，= 0.4357；Fexperimental (1, 150)= 0.03969，= 0.8424)。在恢復期結束時，手術組大鼠平均體重為252.2±18.3 g，Hc組大鼠平均體重為256.5±16.7 g，說明手術組大鼠經歷5 d的恢復期后，其基礎代謝水平與對照組無顯著差異。這一結果提示，手術或可能造成的疼痛、應激等因素并未對大鼠進食和能量代謝造成嚴重影響。

圖2 大鼠恢復期體重變化

2.1.2 CPP實驗期

本文分別測量了前測階段(1 d、2 d)和4次CPP測試(5、8、11、14 d)時的大鼠體重，見圖3。雙因素方差分析表明，在為期14 d的CPP訓練和測試階段，所有大鼠的體重皆有顯著增長(Ftime(5,162)=16.18，<0.0001)，各個藥物處理組大鼠的體重變化與Hc組相比沒有明顯區別(Ftreatment (4, 162)= 1.615，= 0.3066)。在CPP實驗結束時，Hc組大鼠平均體重為213.3± 12.2 g，Sal(Saline)+DMSO組為215.2±15.0 g，Sal+ TSA組為329.4±13.1 g，Mor(Morphine)+DMSO組為293.6±12.6 g，Mor+TSA組為304.2±16.0 g。這說明大鼠BLA內給予TSA(165mmol/L)并且腹腔注射10.0 mg/kg嗎啡溶液不會顯著影響大鼠基礎代謝，也可以排除總體代謝差異對腦內分子變化的干擾。

2.2 CPP行為測試

CPP行為測試結果如圖4所示。Pre-test的CPP評分表明4個實驗組大鼠之間基礎偏愛值沒有差異，所有大鼠皆自然偏愛黑箱且在黑箱中的停留時間基本相同，CPP評分在?46.0~?149.6 s之間。Sal+ TSA組大鼠在整個實驗過程中均未產生顯著的CPP，表明BLA內給165mmol/L TSA本身不具有獎賞效應，不能誘導位置偏愛的形成。Mor+DMSO組大鼠在Test 3(< 0.01)和Test 4(< 0.0001)中表現出顯著的伴藥箱(白箱)偏愛，表明腹腔注射10 mg/kg嗎啡可成功誘導大鼠建立CPP。Mor+TSA組大鼠在接受第一個循環的條件性訓練后(Test 1，<0.05)即表現出顯著的位置偏愛，而這種強烈的位置偏愛一直持續至實驗結束(Test 4，<0.0001)依然存在。

2.3 BLA內組蛋白乙?；癇DNF的表達變化

2.3.1 組蛋白H3乙?；淖?/p>

雙因素方差分析表明，嗎啡和TSA對BLA內組蛋白H3K14乙?；骄哂酗@著影響(Fmorphine(1,28)= 68.1，< 0.0001；FTSA (1, 28)= 134，<0.0001)，如圖5所示。Mor+TSA聯合給藥后，BLA內的組蛋白H3乙?；奖萐al+DMSO組增高4.82倍，與Mor+ DMSO組相比也明顯增高(<0.05)。以上結果提示，腹腔注射嗎啡或BLA內給予TSA(165mmol/L)皆能顯著提高BLA內組蛋白H3(K14)乙?；?，且二者具有協同作用。

2.3.2 BDNF表達改變

油茶病蟲害較少，主要是油茶炭疽病、油茶軟腐病、油茶煤污病和油茶尺蠖（又叫量步蟲）。均造成一定程度的落果、落葉和枝枯，造成減產，但不會死樹毀林。這幾種病都與油茶林經營管理水平密切相關。林內通風透光，樹體健壯，肥、水、土條件好，病枝、病葉、病果、過密枝得到及時剪除和深埋，發病就輕，反之就較重。品種的抗病能力也有差異，造林前可以選擇抗性強的品種。發病期，可自配波爾多液控制病情。實在有必要可噴施退菌特800倍液防治。量步蟲幼蟲身體光滑無毛，行動遲緩，可以直接人工捕殺。

對BLA內BDNF蛋白進行檢測發現，嗎啡和TSA皆對BDNF表達具有顯著作用(Fmorphine(1,28)= 76.44，<0.0001；FTSA (1, 28)= 28.82，<0.0001)，同時二者之間具有顯著的交互作用(Fmorphine×TSA (1, 28)= 5.71，<0.05)，如圖6所示。Mor+TSA聯合給藥后，BLA內BDNF表達比Sal+DMSO組增高3.03倍(<0.0001)。

圖3 大鼠CPP實驗期間體重變化

圖4 大鼠CPP評分

與各次測試中Sal + DMSO組比較，*< 0.05，**< 0.01，***< 0.0001；線段所指示的兩組相互比較，#< 0.05，###< 0.0001。

圖5 乙?；M蛋白H3(aceH3K14)蛋白表達

與Sal + DMSO組比較，**< 0.01，***< 0.0001；線段所指示的兩組相互比較，#< 0.05。

圖6 BDNF蛋白表達改變

與Sal + DMSO組比較，**< 0.01，***< 0.0001。

3 討 論

隨著表觀遺傳學在后基因時代迅速發展，近年來，對表觀遺傳學的大量研究發現，基因表觀事件的發生與精神活性物質的濫用和成癮有著密切的關系[14]。介導表觀遺傳現象的分子機制主要集中在DNA 甲基化和組蛋白乙?；揎梼煞N方式，其中組蛋白乙?；诮鼛啄晏岢龅谋碛^遺傳學理論中占有重要地位，在精神活性物質所致的成癮記憶和行為敏化中也發揮著重要作用。

本研究對BLA內組蛋白H3K14位點的總體乙?；竭M行了檢測，首次證明連續的嗎啡全身給藥可使BLA內H3K14位點的乙?；皆龈?，TSA也可顯著增高H3K14位點的乙?；?，且二者對組蛋白H3K14乙?；哂袇f同作用。然而在BLA內TSA和嗎啡對組蛋白H3K14的協同作用是否是導致TSA能強化嗎啡相關線索記憶的直接原因？H3K14乙?；c藥物相關記憶的一致性變化僅僅是一種巧合還是有必然的因果聯系呢？盡管從我們目前的實驗結果上尚不能直接得出確切結論，然而一種可能的解釋是：BLA這一腦區負責了獎賞相關(正性獎勵和無/負性獎勵)線索記憶的形成，而組蛋白乙?；赏ㄟ^某種機制促進并加強了新記憶的形成過程。未來尚需運用更具特異性的干預手段對這一問題進行更深入的研究。

記憶的形成和存儲涉及神經元的許多適應性改變，包括神經突觸的功能和結構變化，而這些變化都需要相關基因的表達發生相應變化[15]。BDNF已經被證明對學習記憶、突觸可塑性以及維持多巴胺能神經元的存活和功能起到十分重要的作用[12]。在本實驗中，嗎啡所誘導的組蛋白乙?；黾幽茱@著提高BLA內BDNF蛋白表達，提示BLA內BDNF可能參與了嗎啡誘導的線索記憶的形成。這一結果顯示，成癮性藥物可以通加強組蛋白乙?；瘉碓黾愚D錄因子活性，從而提高轉錄效率并促進突觸可塑性改變。

本研究成功建立了嗎啡誘導的CPP模型，并在BLA內給予TSA對組蛋白乙?；竭M行干預，實驗結果證實在TSA本身不影響CPP的狀態下，能加強嗎啡誘導的CPP形成。此外，分子結果提示嗎啡所引起的組蛋白乙?；黾訉ο掠位駼DNF的表達可能有一定的調控作用，同時說明BDNF在線索相關獎賞記憶的形成中具有重要作用。根據我們目前的研究結果，要闡明嗎啡誘導記憶改變所涉及的表觀遺傳學機制，將來尚需從以下幾個方面進行深入研究：

(2)本研究僅觀察了BLA內總體水平的組蛋白H3K14乙?；淖?，由于BLA內BDNF和DFosB與HDACs存在復雜的交互作用，未來應采用染色質免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技術觀察BDNF和DFosB基因啟動子區H3乙?；躁U明這一問題。

(3)由于大腦復雜的神經信號傳遞通路和基因表達的調節，雖然組蛋白乙?；呀涢_始用于研究藥物濫用引起的行為反應，但是還不能用來準確的解釋藥物依賴的發病機理和成癮行為的形成，在將來的研究中，從組織、細胞等多個水平結合藥物、基因等多種干預方法進行成癮行為、線索記憶及其分子機制的研究，將是進一步明確藥物成癮發生發展機制的重要內容。

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(責任編委: 方向東)

The role of histone acetylation in the basolateral amygdala in morphine-associated memory in rats

Xiaomeng Qiao, Fangyuan Yin, Yunxiao Li, Shuguang Wei, Jianghua Lai

To examine the regulatory effect of histone acetylation on memory related molecules, 34 healthy male SD rats were randomly divided into control and basolateral amygdala (BLA) intracranial positioning operation groups. In the process of conditioned place preference (CPP) training, Trichostafin A (TSA) was administrated by the route of BLA and morphine was injected into enterocoelia with dimethyl sulfoxide or saline as control. Expression levels of H3K14 acetylation and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in BLA were evaluated by Western blotting.The results showed that CPP could be established by intraperitoneal injection of morphine. Compared with control groups, a stronger place preference was established and expression of H3K14 acetylation and BDNF was significantly increased in the group treated with TSA and morphine. In addition, there was a synergistic effect between morphine and TSA. Our results suggested that the level of histone acetylation in BLA is associated with the formation of morphine memory in rats. Inhibition of the activity of histone deacetylases in BLA can promote the formation of cue-associated memory induced by morphine and the involvement of BDNF in BLA maybe was regulated by histone acetylation.

morphine; conditioned place preference; BLA; histone acetylation

2014-11-20;

2015-03-01

國家自然科學基金項目(編號：81172910)資助

喬曉孟，博士研究生，專業方向：法醫物證學。E-mail: xiaomeng416520@126.com

賴江華，教授，研究方向：藥物成癮分子機制研究。E-mail: Laijh1011@mail.xjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.14-406

2015-3-11 9:19:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150311.0919.003.html