一種基于線性DNA片段同源重組的嗜鹽古菌高效基因敲除系統

王小利，姜闖，劉建華，劉喜朋

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一種基于線性DNA片段同源重組的嗜鹽古菌高效基因敲除系統

王小利，姜闖，劉建華，劉喜朋

上海交通大學生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室， 上海 200240

隨著功能基因組學研究的深入發展，基因敲除技術日益成為基因功能研究的重要手段。嗜鹽古菌易于培養，是研究古菌基因功能的良好模式菌株。雖然現已開發了多種嗜鹽古菌的遺傳操作系統，但基因敲除成功率不十分理想。這些遺傳操作方法基于篩選標記，利用攜帶同源片段的環狀質粒與基因組同源片段間的兩次同源重組，敲除目的基因。由于基于環狀質粒和篩選標記的經典同源重組敲除方法在二次重組時，普遍存在回復到野生型菌株的可能，導致二次重組子中敲除目的基因的陽性菌株比例較低。為了克服傳統同源重組技術的上述缺陷，文章建立了基于線性DNA片段的同源重組技術。該方法通過一次重組在目標基因的下游引入一段上游同源片段和標記，從而限定二次重組的發生部位只能在兩段上游同源片段之間，發生二次重組的重組子理論上都敲除了目標基因。利用該方法，文章成功敲除了嗜鹽古菌的基因，陽性克隆率達65%。這種線性DNA片段重組法為嗜鹽古菌的基因敲除提供了一種高效策略，便于嗜鹽古菌的基因改造。

嗜鹽古菌；基因敲除；同源重組；線性DNA重組

遺傳操作系統是基因敲除等分子遺傳學研究的基礎，為了研究目的基因敲除后的各種表型，首先需要獲得目的基因敲除突變株。目前已在多種生物中建立了敲除目的基因的遺傳操作系統。為了加速認識古菌的基因功能，目前成功建立了針對多種古菌的遺傳操作系統[1~4]。古菌傳統遺傳操作系統是基于尿嘧啶營養缺陷型(?)和5-氟乳清酸抗性(5-FOA)的正負篩選標記的pop-in/pop-out 基因敲除策略，環狀載體的一側同源臂與染色體上的同源區發生一次重組，導致載體整合到染色體中，即pop-in，尿嘧啶營養缺陷型菌株恢復為原養型。然后，通過分子內重組，將帶有的載體去除，即pop-out，丟掉基因的菌株可以在含5-FOA的培養基中生長。在5-FOA平板生長的菌株有兩種基因型：靶基因缺失及靶基因未缺失(即恢復到野生型)，需要通過分子雜交或PCR區分兩種基因型菌株[5,6]。目前具有相對成熟遺傳操作系統的古菌包括：沃氏嗜鹽富饒菌()[5,6]、地中海富鹽菌()[7]、西班牙鹽桿菌()[7,8]、嗜酸熱硫化葉菌()[9]、冰島硫化葉菌()[10]、激烈火球菌()[11]和棲熱球菌()[12]等。

嗜鹽古菌分離自死海，屬于古菌域廣古菌門嗜鹽富饒菌屬()，細胞為不規則的桿狀、盤狀或杯狀(1.0~3.0 μm×2.0~3.0μm)，具有鞭毛，可以運動。在實驗室環境易于培養，最適培養條件為：18%鹽水培養基、溫度45℃。由于該菌是易于培養的好氧古菌，并已完成全基因組測序[13]，便于基因敲除操作，因此是研究古菌基因功能的良好模式菌株[2]。目前，已建立成熟高效的轉化系統[14]，現有基因敲除系統具有高效標記基因[15,16]用于篩選突變株，并開發了多種表達載體[17,18]。常用的古菌基因敲除技術基于尿嘧啶營養缺陷型(?)和5-氟乳清酸抗性(5-FOA)的正負篩選標記，實現精準的基因修飾。但現有的遺傳操作系統仍存在陽性克隆率低等問題，故本文基于現有系統，通過改進用于同源重組的DNA分子形式，以敲除嗜鹽古菌的2基因為例，建立了一種基于線性DNA片段重組的嗜鹽古菌高效基因敲除系統，該技術可以促進的基因組改造。

1 材料和方法

1.1 材料

嗜鹽古菌菌株H26 (?)和基于pBluescript II質粒骨架的敲除型質粒pTA131(2+)由英國諾丁漢大學Thorsten Allers教授提供[18]，本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 線性DNA片段重組法基因敲除原理

首先構建敲除載體，然后PCR制備線性DNA片段。傳統的基因敲除法使用的敲除質粒只在篩選標記基因的任一側攜帶上下游各500 bp同源臂(圖1A)。線性DNA片段基因敲除法使用的敲除質粒在2篩選標記基因下游位置插入了目標基因上下游500 bp融合同源臂，同時在上游位置插入一段目標(target)基因3￠端500 bp序列，載體構建結果如圖1B所示。PCR擴增包含了目標基因3￠端500 bp序列、基因、上下游500 bp同源臂，共計3段DNA序列的整段線性DNA片段。該線性DNA片段轉化菌株后，由于只有在目標基因3￠端500 bp序列與下游同源片段間同時發生同源重組，標記基因和上游片段才能夠同時被整合到基因組上。其中標記基因在發生同源重組后，能夠在無尿嘧啶的平板上形成克??；在目標基因下游引入的一段上游同源片段是唯一的一段可以發生二次重組的DNA同源序列，從而限定二次重組的發生部位只能在兩段上游同源片段間，發生二次重組的重組子理論上都敲除了目標基因，如圖1C所示。

圖1 基于線性DNA同源片段的基因敲除原理

A：傳統基因敲除法的環狀載體模式圖；B：線性DNA片段基因敲除法的敲除載體模式圖；C：線性DNA片段基因敲除原理圖。

1.2.2基因敲除載體構建

用細菌基因組DNA小量提取試劑盒(購自天根生物科技有限公司)，提取H26基因組DNA，用質粒小量提取試劑盒(購自捷瑞生物科技有限公司)提取pTA131質粒載體，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組和pTA131質粒質量和濃度。利用無縫克隆試劑盒(購自上海遠見生物科技有限公司)構建敲除載體。采用重疊PCR技術獲得插入載體的上下游融合片段：即先用特異性引物擴增目的基因上、下游各自500 bp同源序列，再用兩側引物進行重疊PCR得到融合同源片段。利用克隆位點兩側的一對引物，通過PCR將pTA131載體線性化。線性化載體和待克隆DNA片段混合后，經重組酶處理5~30 min，轉化DH5α感受態細胞，涂布于含100 μg/mL氨芐的LB平板。挑取單克隆于液體LB中培養，取1 μL菌液進行菌落PCR，鑒定陽性克隆。

插入了上下游同源片段的環狀質?？梢灾苯佑糜趥鹘y基因敲除的一次重組。而用于線性化DNA片段重組法的敲除質粒在插入上下游同源片段后，需要繼續在標記基因的另一側插入目的基因3′端長500 bp的DNA片段。將構建好的敲除質粒作為模板，利用表1中引物4和9通過PCR擴增線性DNA同源片段，進行一次重組。載體構建過程中所用的KOD-plus DNA聚合酶購自Toyobo公司，寡核苷酸引物(由Invitrogen公司合成)序列見表1。

1.2.3DNA轉化

具體操作方法參照文獻[14]。在Hv-YPC培養基中，45℃培養10 mL的H26至650=0.8，25℃下，6000 r/min離心8 min收集菌體；用2 mL緩沖型原生質體化溶液(Buffered spheroplasting solution)輕柔地懸浮菌體，再次離心收集菌體；然后再次用600 μL的緩沖型原生質體化溶液輕柔地懸浮菌體，將其分成3管，分別加入0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 20 μL，翻轉混勻，在室溫下放置10 min，讓其形成球狀體。同時準備30 μL的DNA樣本溶液(10 μL DNA水溶液(線狀或環狀質粒DNA 各1~2 μg，ddH2O作為陰性對照)、15 μL非緩沖型原生質體化溶液(Unbuffered spheroplasting solution)、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)5 μL)和800 μL 60% PEG 600溶液(480 μL PEG600，320 μL非緩沖型原生質體化溶液)。將DNA樣本加入到球狀體細胞溶液，取250 μL PEG600溶液，加入球狀體細胞，溫柔水平旋轉10 min，在室溫下放置30 min。然后加入1.5 mL原生質體稀釋液(spheroplast dilution solution)，旋轉混勻后在室溫下放置2 min，25℃下，6000 r/min離心8 min棄上清；加入1 mL菌體活化溶液(regeneration solution)，不需要混勻；45℃靜置1.5~2 h后混勻，再在45℃旋轉搖動3~4 h。25℃下，6000 r/min離心8 min收集菌體，用轉化稀釋液(Transformant dilution solution)輕柔懸浮菌體，清洗2次，去除細胞中的尿嘧啶，最后用1 mL的轉化稀釋液輕柔重懸菌體；取100 μL稀釋10-0、10-1、10-2、10-3倍后涂布Hv-Ca平板，45℃培養5 d。

表1 構建H. volcanii xpd2敲除質粒的引物序列

注：酶切位點用下劃線標示，酶切位點依次為HⅠ(GGATCC)、RⅠ(GAATTC)、Ⅰ(CATATG)。

1.2.4基因敲除株鑒定

從一次重組平板上挑取3個單克隆于5 mL Hv-YPC培養基培養，用菌落PCR進一步驗證一次重組陽性克隆，將一次重組陽性克隆在Hv-YPC培養基中以1：500稀釋倍數傳代2~3次。將傳代后新鮮菌液(100 μL)稀釋10-2、10-3、10-4倍，涂布于含有50 mg/mL 5-氟乳清酸(5-FOA)和10 mg/mL 尿嘧啶(uracil)的Hv-Ca二次篩選平板。挑取20個二次篩選平板上的單克隆于5 mL Hv-YPC培養基培養，菌落PCR檢驗基因是否被成功敲除。取1 μL菌液于99 μL ddH2O中稀釋，取1 μL稀釋液作為PCR模板。PCR擴增體系為50 μL，包括：1 μL稀釋后菌液，0.3 μmol/L引物，200 μmol/L dNTPs，2 mmol/L MgCl2，1×PCR緩沖液，5% DMSO，2.5 U rDNA 聚合酶(購自TaKaRa公司)。PCR擴增條件為：95℃10 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃3 min，30個循環；最后再72℃延伸5 min。

1.2.5基因敲除株表型分析

將成功刪除基因的敲除株接種于5 mL的Hv-YPC液體培養基中，45℃過夜培養至650≈0.4；用18%鹽水培養基將菌液梯度稀釋10–1~10–7倍，取20 μL菌液置于Hv-YPC平板表面，讓其自然晾干(大約20 min左右)；將接種的Hv-YPC平板(打開平板蓋)在UV (254 nmol/L，1 J/m2/s)燈下，照射不同時間(0 s、30 s、60 s、90 s、120 s、180 s、240 s)；將Hv-YPC平板置于黑色避光塑料袋，于45℃培養5~7 d。

2 結果與分析

2.1 Xpd2基因敲除質粒的構建結果

載體具體構建過程詳見材料方法部分，結果見圖2。首先將上下游融合DNA片段插入pTA131質粒(圖2A)。首先成功擴增出了基因兩側的上、下游同源DNA片段(圖2A(a)，泳道1和2)，長度都是500 bp。通過重疊PCR，得到上、下游同源片段的融合DNA片段，長度1 kb(圖2A(a)，泳道3)。為了進行無縫克隆，在融合片段的兩側添加了15 bp的同源DNA序列，用于與線性化pTA131載體(圖2A(a)泳道4)雜交配對，形成重組DNA。上下游融合片段和線性化載體經體外DNA重組反應轉化DH5α，菌落PCR表明陽性克隆率達70%左右(圖2A(b))。插入上下游融合同源片段的載體命名為pTA131- UDxpd(可用于傳統基因敲除)。同理，在pTA131- UDxpd的基礎上再插入目標基因編碼區3￠端的500 bp序列(圖2B)。目標基因3￠端500 bp片段可以成功擴增(圖2B(a)泳道1)，并在末端引入了用于無縫克隆的15 bp同源序列(圖2B(a)泳道2)。目的基因3￠端500 bp片段與PCR線性化的pTA131-UDxpd載體無縫克隆的陽性克隆率為100%(圖2B(b))。最后，將構建好的敲除載體作為模板，用下游同源片段與目標基因3￠端片段的外側引物，在6個復性溫度梯度下PCR擴增用于基因敲除的線性化DNA片段。6個復性溫度(53、54.5、57、、60、62、64℃)下3.0 kb的目的條帶均能夠有效擴增，但存在一條短的非目標帶(圖2C)。由于雜帶長度只有1 kb左右，重組不會將基因整合到染色體上，因此，PCR產物純化后直接轉化H26感受態細胞。線性DNA重組片段含有3段DNA功能區(圖1B)，與染色體同源重組，使標記基因和上游片段同時被整合到基因組上，菌株獲得基因型。

圖2 H. volcanii xpd2基因敲除質粒構建

A：基因上下游融合同源片段的克隆。(a)：基因上下游500 bp同源序列和pTA131載體PCR結果。擴增引物對依次為1和2(上游同源片段，泳道1)、3和4(下游同源片段，泳道2)、通用引物5和6(上、下游同源片段，泳道3)，7和8(線性化載體片段，泳道4)。(b)：基因上下游融合同源片段的基因克隆菌落PCR鑒定結果。B：基因3￠端500 bp片段的克隆。(a)：基因3￠端500 bp片段和pTA131-UDxpd載體的PCR擴增結果。泳道1：基因3′端500 bp片段；泳道2：兩端附加了用于無縫克隆的15 bp同源臂的基因的3￠端500 bp片段；泳道3：pTA131-UDxpd載體PCR線性化片段。(b)：基因3￠端500 bp片段的克隆菌落PCR鑒定結果。C：用于基因敲除的線性化DNA片段制備。通過PCR(引物對9/4)制備用于轉化的線性化DNA片段，用于一次同源重組。泳道1~6是不同復性溫度(53℃、54.5℃、57℃、60℃、62℃、64℃)下的PCR擴增結果。

2.2 Xpd2基因敲除重組子的篩選

2.2.1 線性DNA片段基因敲除法一次重組篩選結果

5~7 d后，在一次重組Hv-Ca篩選平板長出克隆，如圖3A。因為線性DNA片段重組法敲除時，DNA重組反應必須同時發生在兩個同源片段之間，標記基因才能整合到基因組，Hv-Ca平板才能長出克隆，所以一次重組平板長出的克隆數目不多，與傳統的同源重組法相比，克隆數目大大減少。隨機挑取3個克隆，用引物1和4進行一次重組菌落PCR鑒定，結果見圖3B。一次重組PCR結果顯示有兩條帶，一大一小。從圖1C線性DNA片段重組的原理圖中可以看出，發生一次重組時線性同源片段和基因組同源重組后整合在一起，存在兩段上游同源臂和一段下游同源臂，由于上游引物有兩處配對區，所以PCR時會出現兩條帶：小條帶只由上下游同源片段構成，長約1 kb，產量高；大條帶包括待敲除序列、標記基因、插入的上游500 bp同源序列，長度接近3 kb，產量低。

2.2.2 二次重組篩選結果

由于基于線性DNA片段的一次重組使得目標基因下游插入了一段上游同源序列，使得二次重組的發生部位只能在兩段上游同源片段間進行。因此，發生二次重組的重組子理論上都敲除了目標基因和標記基因，都是陽性克隆。圖4A是基因二次重組平板上的菌落生長情況；圖4B是線性DNA 片段重組法20個二次重組克隆的菌落PCR鑒定結果，陽性克隆率約為65%左右。圖C為利用環狀質粒進行傳統基因敲除的菌落PCR結果，其中擴增成功了7個克隆的菌落PCR，鑒定到2個克隆刪除了目標基因，為陽性克隆，陽性克隆率為29%左右。從這一結果看出，基于線性DNA片段重組法敲除目的基因的成功率明顯增強。

圖3 xpd2基因敲除一次重組篩選結果

A：線性DNA片段基因敲除的一次重組形成的重組子平板生長情況；B：一次重組菌落PCR鑒定結果。泳道1~3代表3個獨立的一次重組子；M：DNA marker。

圖4 xpd2基因敲除二次重組篩選結果

A：二次重組子的平板生長情況；B：線性DNA片段同源重組法敲除基因的二次重組PCR鑒定結果(M：DNA marker；1~20為20個獨立的二次重組子的菌落PCR)；C：傳統同源重組法敲除基因的二次重組PCR鑒定結果(M：DNA marker；1~20為20個獨立的二次重組子菌落PCR)。

2.3 Xpd2基因敲除后的表型研究

基因位于主染色體的37234~ 39438區域，編碼一種DNA解螺旋酶，可能參與核苷酸切除修復和RNA轉錄過程[19~23]。初步實驗結果表明：刪除后，突變株的生長表型與野生株沒有明顯變化。由于嗜鹽菌菌株中有兩個()基因，分別為(, HVO_1351)和,HVO_0039)，功能上可能存在冗余效應。下一步研究將在此基礎上繼續敲除基因，獲得基因完全缺失型菌株，進而從生長表型等方面全面深入探究基因的功能。

3 討 論

目前常用的基因敲除方法都是基于環狀自殺質粒的傳統同源重組法，由于在二次重組時存在回復到野生型菌株的可能，導致二次重組子中敲除目的基因的陽性突變菌株比例很低，有時需要挑取幾十個克隆，才能篩選到陽性克隆，甚至篩選不到陽性克隆。本文建立了基于線性DNA片段的基因敲除技術，該方法一次重組時在目標基因的下游引入一段上游同源片段和標記，從而限定二次重組的發生部位只能發生在兩段上游同源片段間，使得發生二次重組的重組子理論上都敲除了目標基因，理論上的陽性克隆率達到100%。采用本文的線性DNA片段基因敲除方法，基因的敲除效率達到65%以上。目的基因敲除效率沒有達到100%的可能原因是基因自發突變或者污染了缺失型嗜鹽菌，這些突變或缺失的菌株都可以在5-FOA平板上生長，但它們的2基因并未敲除。當然，也有可能是單一基因敲除實驗的誤差所致?？傊?，該方法比基于環狀質粒的經典基因敲除方法，敲除效率提高了2.2倍(圖4)。由此可見，線性DNA片段重組法顯著提高了基因敲除突變體的陽性克隆率。由于嗜鹽菌H26生長緩慢，需要5~7 d才能夠形成克隆，有效的基因敲除及鑒定技術對快速構建突變株至關重要。本文綜合運用線性DNA片段重組法和簡單的菌落PCR鑒定技術，為快速獲得嗜鹽菌的基因敲除突變株提供了一種有效方法，對其他嗜鹽菌遺傳操作系統也具有一定借鑒作用。

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(責任編委: 何群)

An efficient genetic knockout system based on linear DNA fragment homologous recombination for halophilic archaea

Xiaoli Wang, Chuang Jiang, Jianhua Liu, Xipeng Liu

With the development of functional genomics, gene-knockout is becoming an important tool to elucidate gene functions. As a good model strain for archaeal genetics,has received more attention. Although several genetic manipulation systems have been developed for some halophilic archaea, it is time-consuming because of the low percentage of positive clones during the second-recombination selection. These classical gene knockout methods are based on DNA recombination between the genomic homologous sequence and the circular suicide plasmid, which carries aselection marker and two DNA fragments homologous to the upstream and downstream fragments of the target gene. Many wild-type clones are obtained through a reverse recombination between the plasmid and genome in the classic gene knockout method. Therefore, it is necessary to develop an efficient gene knockout system to increase the positive clone percentage. Here we report an improved gene knockout method using a linear DNA cassette consisting of upstream and downstream homologous fragments, and themarker. Gene deletions were subsequently detected by colony PCR analysis. We determined the efficiency of our knockout method by deleting thegene from thegenome, with the percentage of positive clones higher than 50%. Our method provides an efficient gene knockout strategy for halophilic archaea.

halophilic archaea; gene knockout; homologous recombination; linear DNA recombination

2014-10-24;

2015-01-12

國家自然科學基金項目(編號31371260)資助

王小利，碩士，專業方向：DNA修復。E-mail: 650914@sjtu.edu.cn

劉喜朋，博士，副教授，研究方向：微生物遺傳學。E-mail: xpliu@sjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.14-366

2015-3-11 9:17:12

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150311.0917.001.html