胰腺癌特異相關長鏈非編碼RNA靶基因的篩選驗證及分析**

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胰腺癌特異相關長鏈非編碼RNA靶基因的篩選驗證及分析**

徐勝前秦勇葉冠雄吳成軍王世潘德標

溫州醫科大學附屬第六醫院麗水市人民醫院肝膽胰外科,浙江省麗水市323000

長鏈非編碼RNA(1ncRNA)是一類轉錄本長度超過200nt的RNA，其本身不編碼蛋白，而是以多種形式調控基因的表達[1]；它不僅在表觀遺傳學修飾、轉錄與轉錄后調控、維持正常組織的發育和分化中發揮重要作用，而且通過調控細胞周期與凋亡影響腫瘤細胞的生長、遷移與侵襲，有望成為潛在的診斷標志物與治療的靶點。Tahira[2]等通過cDNA轉錄組芯片技術發現胰腺癌組織篩選的335個lncRNA中,3個內含lncRNA與胰腺癌轉移及凋亡密切相關，分別轉錄于MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1位點，并運用熒光定量RT-PCR等技術證實這3個lncRNA為編碼蛋白基因。筆者通過熒光定量RT-PCR技術在60例胰腺癌及癌旁組織中篩選出表達量最高的胰腺癌特異相關長鏈非編碼RNA靶基因，為后續進一步揭示胰腺癌發生發展的新機制提供靶基因。

1資料與方法

1.1一般資料Trizol試劑、lncRNA提取試劑、熒光定量RT-PCR試劑盒、SYBR Green Ⅰ熒光染料購自美國Invitrogen公司。標本收集：60例胰腺癌組織及癌旁組織標本，來源于2012年6月-2014年12月于我院行手術治療的患者，術前未行放療或化療，術后病理確診為胰腺癌的腫瘤組織(T)和癌旁正常組織(N)的液氮凍存標本。標本采集均經過患者家屬同意并簽屬知情同意書，并經醫院倫理委員會審核通過。

1.2總RNA的提取與RT-qPCR經Trizol試劑(Invitrogen公司)抽提組織總RNA，焦磷酸二乙酯(DEPC)水復溶后，用核酸蛋白分析儀測定總RNA濃度，根據A260/A280比值和1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳RNA條帶完整性鑒定總RNA質量。取2ng總RNA加入逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)進行逆轉錄反應，得到cDNA溶液，加80μl DEPC稀釋后，置-20℃保存。用SYBR Green I PCR檢測試劑盒對5μl cDNA溶液進行熒光定量PCR，MAP3K14引物序列：上游為5’-ATTTGCTCCTGCTCCTCCAGA-3’，下游為5’-CCAGCCTCCTCCCAGTCTTTC-3’；PPP3CB引物序列:上游為5’-AAAGAGCTCTCTTCCCTCTTGCG-3’，下游為5’-CTGTGAATGTGGGAAGGTGCATTG-3’；DAPK1引物序列：上游為5’-GGTTCTCGCTCTTGTTGCGTG-3’，下游為5-TACTGACGGAA-ACACTGGCGG-3’；內參照GAPDH引物序列：上游為 5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，下游為 5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’；PCR反應條件為：95℃預變性2min；然后95℃變性110s，60℃退火30s，70℃延伸30s，共40個循環；解鏈曲線分析：95℃ 1min，55℃ 30s；然后緩慢升溫至95℃，升溫速率為0.2℃/s，最后得到擴增曲線圖和解鏈曲線圖。本研究采用2-△△Ct法分析目的lncRNA的相對表達水平，以上具體操作依試劑盒說明書進行。

2結果

長鏈非編碼RNA MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 3種基因在胰腺癌及胰腺癌旁組織中均有表達，其基因的表達量詳見表1。三組基因在胰腺癌組織的基因表達量兩兩比較有差異(P<0.01，F=32.37)，在胰腺癌旁組織的表達兩兩比較差異顯著(P<0.01，F=296.6)，三組基因在胰腺癌組織中的表達水平均低于在各自的胰腺癌旁組織的表達水平，其中DAPK1基因在胰腺癌及癌旁基因中表達量最高。

3討論

胰腺癌是世界上惡性程度及死亡率最高的常見腫瘤之一，由于其起病隱匿，臨床上缺乏有效的早期診斷手段及有效的治療方案[3，4]，盡管手術切除能夠起到一定程度的治療作用，但是胰腺癌患者的5年生存率仍然低于5%[5]，目前在這方面的臨床研究及腫瘤實驗學有較大的進步，但胰腺癌的預后仍然不盡如意[6];因此，尋找高特異性的早期分子標志物，進一步深入研究胰腺癌的發生發展機制對于胰腺癌的早期診斷、治療意義重大。

表1　三組基因在胰腺癌及癌旁組織的

筆者利用熒光定量RT-PCR技術檢測長鏈非編碼RNA MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 3組基因在60例胰腺癌及胰腺癌旁組織中均有表達(P<0.05)，且在胰腺癌組織的表達水平低于胰腺癌旁組織(P<0.05)；而Tahira等的研究也發現MAP3K14、PPP3CB、 DAPK1 三組基因在胰腺導管腺癌(PDAC)腫瘤組織和非腫瘤組織中存在表達差異，這說明筆者檢測的結果與Tahira等的研究一致；Tahira等發現胰腺導管腺癌(PDAC)或轉移癌的發生與胰腺組織中基因間區lncRNA的豐度有相關性，提示這類轉錄產物與胰腺癌的生物進程、惡性轉化和轉移有潛在的關系，而在筆者的檢測結果中發現三組基因在胰腺癌組織及癌旁組織兩兩對比差異顯著(P<0.05)，其中DAPK1基因在胰腺癌組織及癌旁組織中表達水平最高，且在胰腺癌組織中表達低于癌旁組織，說明DAPK1基因可能與胰腺癌的發生發展、生物進程、惡性轉化和轉移有潛在的關系，是胰腺癌的一種可能的抑癌基因。

近年研究表明，lncRNA與人類多個腫瘤發病關系密切，可在多個水平廣泛參與基因表達調控網絡的構成，調控腫瘤發生、發展，并與腫瘤的侵襲、轉移及患者預后密切相關[7,8]，然而，DAPK1是否在胰腺癌的發生發展中也扮演著重要的角色，是否是胰腺癌高特異性的早期分子標志物，仍有待深入探討。

參考文獻

[1]Jia H，Osak M，Bogu GK，etal．Genome-wide computational identification and manual annotation of human long noncoding RNA Genes〔J〕.RNA,2010,16(8):1478-1487.

[2]Tahira AC,Kubrusly MS,Faria MF,etal.Long noncoding intronic RNAs are differentially expressed in primary and metastatic pancreatic cancer〔J〕.Mol Cancer,2011,13(10):141.

[3]Shrikhande SV,Gupta S,Ostwal V.Metastatic pancreatic cancer:another-option?〔J〕.Natl Med J India,2011,24(6)356.

[4]Tajiri T,Tate G,Matsumoto K,etal.Diagnostic challenge: intraductal neoplasms of the pancreatobiliary system〔J〕.Pathol Res Prac,2012,208(11):691-696.

[5]Hezel AF,Kimmelman AC,Stanger BZ,etal.Genetics and bi-

ology of pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Genes Dev,2006,20(10):1218-1249.

[6]Mardin WA,Haier J,Mees ST.Epigenetic regulation and role of metastasis suppressor genes in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.BMC Cancer,2013,29(13):264.

[7]邵永富,蔣孝明,等.長鏈非編碼RNA在消化系統腫瘤發生中的作用〔J〕．中國細胞生物學學報，2013,35(9):1357．

[8]鄭清盛,王守銘,吳大慶，等.長鏈非編碼RNA在肝細胞肝癌組織中的表達及臨床意義〔J〕．中華實驗外科志,2014,31(4):840-842．

(編輯落落)

摘要目的：篩選并明確胰腺癌特異相關長鏈非編碼RNA(lncRNA)在胰腺癌及癌旁組織中的表達差異，并對其進行初步分析。方法：采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測篩選驗證胰腺癌特異相關長鏈非編碼RNA MAP3K14、PPP3CB、DAPK1 3種靶基因在60例胰腺癌組織及配對癌旁組織表達差異最強的目標lncRNA，為胰腺癌特異相關lncRNA的功能研究做鋪墊。結果：長鏈非RNA MAP3K14,PPP3CB, DAPK1在各自的胰腺癌及癌旁組織中的表達水平均有意義(P=0.000，t=17.32；P=0.000，t=15.045；P=0.013，t=34.55)；在胰腺癌組織的表達量兩兩比較有差異(P<0.01，F=32.37)，三組基因在胰腺癌旁組織的表達水平兩兩比較差異顯著(P<0.01，F=296.6)，其中DAPK1基因在胰腺癌及癌旁基因中表達量最高。結論：三種長鏈非編碼RNA在胰腺癌及癌旁組織中明確表達，其中DAPK1基因表達量最高，說明DAPK1與胰腺癌的發生發展有關，且在胰腺癌組織中表達低于癌旁組織，說明DAPK1是胰腺癌一種可能的抑癌基因。

關鍵詞胰腺癌長鏈非編碼RNA篩選驗證

Screening Verification and Analysis of Specific Long Non-coding RNA Relevant Target Genes of Pancreatic Cancer

XU Shengqian,QIN Yong,YE Guanxiong,etal.DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeopleHospitalofLishuiCity,ZhejiangProvince323000

ABSTRACTObjective:To screen and identify the differentially expressed of specific long non-coding RNA relevant target genes of pancreatic cancer between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues,and analysis it preliminary.Methods:To screen the differentially expressed of specific long non-coding RNA MAP3K14,PPP3CB, DAPK1 of pancreatic cancer between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues in 60 cases by RT-qPCR,which was prepared for the functional study of pancreatic cancer specific relevant lncRNA.Results:The expression levels of MAP3K14,PPP3CB, DAPK1 were significance between pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues respectively (P=0.000，t=17.32；P=0.000，t=15.045；P=0.013，t=34.55);the expression of three genes are different in pancreatic tissue,(P<0.01，F=32.37),the expression of three sets of gene in adjacent pancreatic tissue of pairwise comparisons were significant (P<0.01,F=296.6),which the expression of DAPK1 was highest in pancreatic cancer and paracancerous tissues.Conclusion:Three long non-coding RNAs in pancreatic cancer and adjacent pancreatic cancer tissue were expressed clearly, which DAPK1 expressed highest, this shows that DAPK1 was related to the occurrence and development of pancreatic cancer, and the expression level of DAPK1 in pancreatic cancer tissues was lower than that in the adjacent tissues, indicating that DAPK1 is a possible tumor suppressor genes of pancreatic cancer.

KEY WORDSPancreatic cancer，Long non-coding RNA，Microarray

收稿日期2015-04-27

中圖分類號：R735.9

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)17-2288-03

基金項目：麗水市科學技術局公益性應用技術項目(2012jyzb13)。通訊作者：秦勇