減壓內部沸騰法提取青蒿素工藝研究

賀敬霞，何 晨，田 茜，尹蓉莉，楊軍宣

(1.成都中醫藥大學，四川 成都 611137；5.重慶醫科大學 中醫藥學院，重慶 400016)

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減壓內部沸騰法提取青蒿素工藝研究

賀敬霞1，何 晨1，田 茜1，尹蓉莉1，楊軍宣2*

(1.成都中醫藥大學，四川 成都 611137；5.重慶醫科大學 中醫藥學院，重慶 400016)

目的：研究減壓內部沸騰法提取青蒿中青蒿素的最佳提取工藝。方法：以青蒿素得率為評價指標，考察解吸時間、解吸濃度、提取壓力、提取濃度、提取溫度、提取溶劑用量各因素對提取率的影響，優選出最佳提取工藝，并與常規提取方法進行比較。結果：減壓內部沸騰法提取青蒿素的最佳提取工藝為：取青蒿粗粉10g，加入80%乙醇溶液50mL，常溫(25℃)下解吸20min，加入35%乙醇溶液100mL，提取容器置于50℃水浴中，減壓至-0.02MPa提取30min，即可。此條件下，青蒿素提取率為84.82%。結論：減壓內部沸騰法提取青蒿素具有安全、高效、廉價、簡便等特點，與常規提取方法比較優勢明顯，適用于工業化大生產。

減壓內部沸騰法；青蒿素；青蒿

青蒿為菊科植物黃蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分，具有清熱解暑、抗瘧的功效，其主要有效成分為青蒿素，還含有青蒿酸、環氧青蒿酸、青蒿醇、雙氫青蒿素等成分。藥理研究表明，青蒿素及其衍生物具有抗瘧、抗炎、抗膿毒癥、抗腫瘤、放療增敏、抗組織纖維化等作用，目前臨床主要用于瘧疾的治療[1]。青蒿素及其類似物的分析檢測方法主要包括氣相色譜法、液相色譜法、質量法、紫外分光光度法、薄層掃描法、熒光光譜法、氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法等，提取方法主要包括室溫提取、冷浸提取、回流提取、索氏提取等，操作簡單、設備要求低，但具有提取效率低、耗能高、后處理麻煩等缺點。新型提取技術包括SFE、超聲提取、大孔樹脂提取、微波輔助萃取等，雖能減少溶劑消耗，但SFE、微波提取設備投資大，大孔樹脂提取循環利用率低，超聲提取僅適用于少量樣品[2-3]。目前關于采用減壓沸騰法提取青蒿素的文獻報道較少，故本實驗嘗試采用減壓內部沸騰法提取青蒿的有效成分青蒿素，以青蒿素得率為指標，優選最佳工藝條件。

1 材料與試劑

青蒿購于成都市荷花池藥材市場，經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定為《中國藥典》2010年版一部收載的菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分。

青蒿素對照品 (由成都曼思特生物科技有限公司提供，批號：MUST-14060203，供含量測定用)；色譜乙腈(賽默飛世爾科技有限公司)；色譜甲醇(賽默飛世爾科技有限公司),石油醚(60～90℃)；甲醇、乙醇、NaOH等均為分析純。

RE52CS旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；UV-756PC紫外可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)；超聲波清洗儀(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)；島津LC-20AT(日本島津公司)，BP211D電子天平(德國 Startorious)。

2 方法

2.1 常規提取法

2.1.1 常規石油醚回流提取法[12-13]精確稱取10g青蒿粗粉，置于圓底燒瓶中，加入3倍體積石油醚，回流提取1h，溫度為50℃，趁熱過濾，得濾渣，再加入石油醚按上述方法提取3次，合并提取液，濃縮，真空干燥得青蒿干膏，備用。

2.1.2 常規甲醇超聲提取法 參考文獻[14](分別用甲醇、乙醇、石油醚((60～90℃)超聲提取青蒿素)，甲醇提取效果最好，故以甲醇為提取溶劑。精確稱取青蒿10g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液400mL，超聲提取50min，溫度為50℃，濾過，得濾渣，加甲醇溶液按上述方法提取，共提取3次，合并濾液，濃縮真空干燥得青蒿干膏，備用。

2.2 減壓內部沸騰法

方法[15]，取青蒿粗粉10g，置于圓底燒瓶中，加入65%乙醇溶液50mL，常溫(25℃)下解吸20min，將提取容器置于50℃水浴中，然后快速加入50℃ 45%乙醇溶液，同時減壓至0.04Mpa提取10min，濾過，提取2次，合并提取液，濃縮至提取液的1/10，真空干燥得青蒿干膏，備用。

2.3 青蒿素紫外檢測[4-7]

2.3.1 提取液制備 吸取各提取液0.8mL置于50mL容量瓶中，加95%乙醇至10mL，再用0.2%NaOH定容至刻度線，置于(50±1)℃水浴中反應30min，冷卻至室溫，于292nm波長下進行紫外測定。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取青蒿素對照品2.5mg，置于25mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋并定容至刻度線，搖勻，制成0.1mg/mL的青蒿素對照品溶液，備用。

2.3.3 標準曲線制備 分別精密量取0.1mg/mL對照品溶液1、2、3、4、5mL，置于25mL容量瓶中，加95%乙醇溶液5mL，用0.2%NaOH溶液定容至刻度線，搖勻，置于(50±1)℃水浴中反應30min，取出，冷卻至室溫，以相應試劑為空白，于292nm波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，樣品含量C為橫坐標，制作標準曲線，得曲線方程為：A=2.727 5C-0.010 9，R2=0.999 7，青蒿素在0.040～0.200mg/mL濃度范圍內與其吸光度呈良好的線性關系。

2.4 青蒿素HPLC檢測[8-11]

2.4.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsilC18(4.6mm×150mm,5μL)，流動相為乙腈-水(68∶32)，檢測波長為210nm，進樣量為20μL，柱溫為30℃，流速為1mL/min。

2.4.2 供試品溶液制備 分別精密吸取石油醚回流提取溶液、甲醇超聲提取溶液、減壓內部沸騰法提取溶液10mL，置于50mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度線，搖勻，待用。

2.4.3 對照品溶液制備 精密稱取青蒿素對照品5.0mg，置于10mL容量瓶中，加色譜甲醇稀釋并定容至刻度，制成0.5mg/mL的對照品溶液，備用。

2.4.4 標準曲線制備 取0.5mg/mL對照品溶液，按照“2.4.1”色譜條件進樣分析，進樣量分別為5、10、15、20、30μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標Y，進樣量為橫坐標X，繪制標準曲線，得標準曲線方程為Y=36 463X+22 653，R2=0.999 9，結果表明青蒿素進樣量在5～30μL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

3 結果

采用減壓內部沸騰工藝提取青蒿中的青蒿素，采用單因素考察法，以青蒿素得率作為評價指標，對解析時間、解析濃度、提取溶劑濃度、提取時間、提取壓力、提取劑量六個因素進行考察，最終確定最佳提取工藝。

3.1 解吸過程影響因素

3.1.1 解吸濃度的影響 在“2.2”項提取工藝下，分別采用45%、55%、65%、80%、95%乙醇溶液進行解析，得樣品溶液，進樣分析，結果見圖1。由圖可知，溶液解吸濃度越高，解吸率越高，青蒿素得率越高。當乙醇濃度為95%時，達到最佳解吸效果?？紤]到有機試劑的污染性，因此選擇80%乙醇作為解析溶液。

圖1 乙醇濃度對得率的影響

3.1.2 解吸時間的影響 在“2.2”項下提取工藝下，確定乙醇解吸濃度為80%，分別解析5、10、20、30、40min后，進樣分析，結果見圖2。由圖可知，解析20、30、40min時，青蒿素的解吸率變化不大，為節省實驗時間，最終確定最佳解吸時間為20min。

3.2 減壓內部沸騰過程影響因素

3.2.1 提取溶劑濃度的影響 在“2.2”項提取工藝下，加入80%乙醇溶液50mL，解吸20min，提取壓力為-0.02MPa，提取用量為100mL，提取溫度為50℃，提取溶劑分別為25%、35%、45%、55%、65%乙醇，結果見圖3。由圖可知，最佳提取溶劑為35%乙醇。

3.2.2 提取溶劑用量的影響 在“2.2”項提取工藝下，采用80%乙醇解吸20min，提取溶劑分別為2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍體積乙醇，結果見圖4。由圖可知，提取溶劑為樣品用量的15倍時，提取率最佳，但考慮到溶劑用量以及環保問題，選擇10倍量乙醇為提取溶劑。

圖2 解吸時間對得率的影響

圖3 乙醇濃度對得率的影響

圖4 提取溶劑用量對得率的影響

3.2.3 提取壓力的影響 在“2.2”項提取工藝下，解吸溶劑為80%乙醇，解吸時間為20min，提取溶劑為10倍量乙醇，分別于-0.02、-0.04、-0.06、-0.08MPa壓力下進行提取，結果見圖5。結果表明，隨著壓力的降低，溶劑產生劇烈沸騰，得率降低，最佳提取壓力為-0.02MPa。

3.2.4 提取溫度的影響 在“2.2”項提取工藝下，加入80%乙醇溶液10mL，解吸20min，在-0.02MPa下減壓提取，提取溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，結果見圖6。提取溫度的升高有利于青蒿素的溶出，但溫度過高會破壞青蒿素的結構，因此最佳提取溫度為50℃。

3.2.5 提取時間的影響 在“2.2”項提取工藝下，加入80%乙醇溶液解吸20min，在 50℃、-0.02MPa下提取，提取時間分別為4、8、10、20、30、40min，結果見圖7。青蒿素得率隨著提取時間的延長而提高，當提取時間為30min時，青蒿素已基本提取完全，因此確定最佳提取時間為30min。

圖5 提取壓力對得率的影響

圖7 提取時間對得率的影響

3.3 減壓內部沸騰法與傳統提取方法比較

3.3.1 減壓內部沸騰法 由以上單因素考察結果可知，減壓內部沸騰法提取青蒿中青蒿素的最佳提取工藝為：精密稱取青蒿粗粉10g，加入80%乙醇溶液50mL，常溫(25℃)下解吸20min，加入35%乙醇溶液100mL，提取容器置于50℃水浴中，減壓至-0.02MPa提取30min，進樣測定。

3.3.2 石油醚回流提取法 精確稱取10g青蒿粗粉，置于圓底燒瓶中，加入3倍量石油醚，50℃下回流提取1h，趁熱過濾，得濾渣，再加入石油醚按上述方法再提取3次，合并提取液，濃縮，進樣測定。

3.3.3 甲醇超聲提取法 精確稱取青蒿10g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液400mL，超聲提取50min，溫度為50℃，濾過，得濾渣，加甲醇溶液按上述方法再提取2次，合并濾液，進樣測定。結果見表1。

表1 減壓內部法與常規提取方法比較

由表1可以看出，減壓內部沸騰法提取青蒿素得率比常規回流提取法、超聲提取法分別提高52.78%、22.61%，干膏得率分別提高7.18%、1.74%，提取時間也明顯縮短。綜上所述，減壓內部沸騰法提取青蒿素優于常規提取法。

4 討論

本實驗分別采用超聲法、回流法、減壓內部沸騰法對青蒿進行提取，結果表明，與常規方法相比，減壓內部沸騰法具有提取效率高、雜質含量少、溶劑毒性低等優點。本實驗對減壓內部沸騰法提取過程中的解析時間、提取壓力、解析濃度、提取時間、提取劑量、提取劑濃度進行了考察，得到青蒿素的最佳提取工藝為：取青蒿粗粉10g，加入80%乙醇溶液50mL，常溫(25℃)下解吸20min，然后加入35%乙醇溶液100mL，提取容器置于50℃水浴中，減壓至-0.02MPa提取30min。本實驗為青蒿素的開發利用提供了新途徑。

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(責任編輯：尹晨茹)

Study on Process for Extraction of Artemisinin by Decompressing Inner Ebullition

He Jingxia1,He Chen1,Tian Qian1,Yin Rongli1,Yang Junxuan2*

(1.Traditional Chinese Medicine of Chengdu University,Chengdu 611137,China;2.TCM College of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Objective:To study the best extraction process in extracting artemisinin from artemisia annua in Decompressing Inner Ebullition.Methods:Taking the yield of artemisinin as measurement,observe and study the effects on extraction yield,impacting by factors including parsing time and concentration,extraction pressure,concentration and temperature,ratio of material to liquid. Finally,the optimum extraction technology was selected to compare with conventional method.Results:The best extraction process in extracting artemisinin in Decompressing Inner Ebullition turned to be:The Artemisia annua coarse powder 10g,50mL in 80% ethanol solutionat,room temperature (25℃),the desorption of 20min,adding 35% 100mL ethanol solution,extraction water bath container at 50 DEG C,decompression to -0.02MPa from 30min,under this condition,extraction rate of artemisinin could be 84.82%.Conclusion:Compared with conventional method,decompressing inner ebullition featured by safety,efficiency,economy and handiness in extracting artemisinin.

Decompressing Inner Ebullition;Artemisinin;Artemisia Annua

2015-08-05

重慶市科技計劃項目(cstc2014yykfA110020)

賀敬霞(1990-)，女，成都中醫藥大學碩士研究生，研究方向為中藥制劑新工藝與新技術。

楊軍宣(1974-)，男，博士，重慶醫科大學副研究員，研究方向為中藥新制劑及中藥質量。E-mail:yjxhawk@sina.com

R284.2

A

1673-2197(2015)24-0033-03

10.11954/ytctyy.201524013