GPCRs二聚體:功能和藥理作用展望*

陳 京 姜云璐

(濟寧醫學院神經生物研究所，山東 濟寧 272068)

·專家論壇·

GPCRs二聚體:功能和藥理作用展望*

陳 京 姜云璐

(濟寧醫學院神經生物研究所，山東 濟寧 272068)

陳京, 2001年獲得英國華威大學(University of Warwick)博士學位。濟寧醫學院神經生物學研究所工作，現在主要從事G蛋白偶聯受體生物學和藥理學、能量代謝相關疾病的機理及診治、心臟內分泌學及生殖內分泌學等領域的研究。 在中外刊物上(包括Diabetes；Diabetes Care；Diabetologia；Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism；Molecular endocrinology；Cardiovascular Research；The Journal of Biological Chemistry等)發表論文130余篇，其中SCI收錄60篇。論文被SCI收錄雜志他引2450余次(Google scholar)。

G蛋白偶聯受體是最大的膜受體超家族之一，參與調節多種生理過程，在信號識別及轉導中具有重要作用，是醫學研究與計劃的焦點之一，但基于GPCRs單體的藥物通常療效欠佳、副作用較多。隨著GPCRs二聚體的不斷證實，二聚體不同于單體的內在療效、配體選擇及由變構調節引起的功能選擇性，在臨床疾病治療及新藥研發中倍受關注。本文基于檢測GPCRs二聚體的技術，就GPCRs二聚體形成的決定因素、功能及藥理學作用作一綜述。

G蛋白偶聯受體；變構調節；熒光相關光譜；全內反射顯微鏡

G蛋白偶聯受體 (G protein coupled receptors,GPCRs) 具有7次跨膜結構,家族成員有800～1000多個,其相關藥物占上市藥物的40%～50%，因此,GPCRs是重要的藥物靶點之一。最初認為GPCRs是以單體的形式存在的，并以單體的形式發揮作用。但在過去的20年里，越來越多的研究表明，GPCRs能夠在完整細胞中形成二聚體甚至高階寡聚體?，F已證實，GPCRs的A家族與C家族成員均可形成同源或異源二聚體及高階寡聚體。雖然GPCRs單體可激活G蛋白，但由GPCRs二聚體形成的新的配體結合位點對G蛋白具有選擇性激活的作用，如不同的GPCR二聚體選擇性的激活不同亞型的G蛋白，選擇性的激活不同的下游信號途徑，進而參與不同的生理反應。GPCR二聚體獨特的空間結構，決定了其特殊的藥理學特性。因此，對GPCRs二聚體的研究將有助于我們更深入的理解受體的生理、藥理功能與作用機制。

1 GPCRs二聚體

最初認為GPCRs以單體的形式存在。過去研究表明，它們可以在細胞中形成同源和異二聚體，如GPCRs C家族(代謝型谷氨酸受體，鈣敏感受體等)與A家族(視紫紅質受體等)，在完整的細胞中均可以形成同源或異源二聚體及高階寡聚體[1-3]。近期研究發現，視紫紅質受體-β-arrestin結合的化學計量比由1∶1變為2∶1[4-6]，這無疑證實了受體二聚化的存在。新型技術在細胞領域的成功應用,如熒光共振能量轉移(FRET)、生物發光共振能量轉移(BRET)等，從大分子水平表明了活細胞中二聚體及高階寡聚體的存在[3,7-9]。但此技術不足以闡述二聚體及高階寡聚體的動態性質及大小，因此，為進一步探明活細胞中二聚體及高階寡聚體的時空分布，全內反射熒光顯微鏡(total internal reflectance fluorescence microscopy,TIRFM)技術應運而生。

TIRFM首次用于跟蹤活細胞中熒光標記的M1毒蕈堿乙酰膽堿受體(M1 muscarinic acetylcholine receptor,M1R)與N-甲酰肽受體(N-formyl peptide receptors,FPR)，研究表明M1R-FPR二聚體的形成與解離瞬時完成，且在任何時間都有30%～40%的二聚體存在。隨后，人們在心肌細胞中檢測到M2受體，得到了與此相同的結論。近期，人們將TIRFM與蛋白質標記(SNAP-tags)技術聯合使用[10-11]，用于研究活細胞中β1、β2腎上腺素受體(β1-adrenergic receptors，β2-adrenergic receptors)與γ-氨基丁酸B型受體(γ-aminobutyric acid,GABAB)單分子的運動軌跡(其中細胞膜被熒光集團標記)。實驗數據表明，3種受體形成二聚體及高階寡聚體的量與受體的亞型及密度呈正相關。低密度時，β1腎上腺素受體主要以單體的形式存在，而β2腎上腺素受體形成二聚體，且隨著密度的增加則逐漸形成三聚體、四聚體甚至高價寡聚體。在正常組織生理狀態下的受體密度，β1、β2腎上腺素受體均以二聚體或高階寡聚體的形式存在，即便加入激動劑刺激也不會改變這種二聚體的狀態[11]。有趣的是，GABAB即使是在低密度下也主要形成三聚體、四聚體，隨著密度增加將逐步形成高階寡聚體[11-13]。TIRFM結合熒光標記能夠觀察活細胞中大分子間的相互作用，進而揭示了GPCR之間的單體和二聚體的動態平衡[14](見圖1)。

圖1 模型示意圖，顯示了GPCRs的A家族單體和二聚體之間的GPCR的動態平衡；A類GPCRs的不斷形成二聚體和分解成單體；配體結合并沒有影響動態單體～二聚體的平衡[14]。

過去幾十年主要是應用能量共振轉移、TIRFM及信號強度進行采集后的演算來分辨細胞中GPCRs二聚體/高價寡聚體的形成，而近期超高分辨率顯微鏡(super-resolution microscopy，STED)的發展打破了傳統熒光顯微鏡的分辨率，它能夠直接觀察胞內單個蛋白分子的運動軌跡，提供三維空間甚至更精細的分子水平(8nm)檢測GPCRs 單體、二聚體及高價寡聚體(蛋白質-蛋白質間)時空排布、相互作用及其功能[15]。

熒光相關光譜(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)是另一個用于探測GPCR寡聚化狀態的技術，它通過測定微區內熒光團，熒光強度的改變而評定熒光分子的數目，具有極高的靈敏度[16]。Golebiewska等[17]利用FCS檢測到μ-阿片受體(μ-opioid receptors)與δ-阿片受體(δ-opioid receptor)可以形成同源或異源二聚化，且μ-阿片受體與δ-阿片受體形成的四聚體是在形成二聚體的基礎上完成的。Herrick Davis等[18]將FCS與粒子計數直方圖的方法聯合使用，發現多巴胺受體、5-HT受體及M1、M2毒蕈堿乙酰膽堿受體等都可以形成二聚體。

2 GPCRs二聚化的作用方式

隨著GPCRs二聚體及高階寡聚體研究的不斷深入，人們對二聚體維持穩定及共同激活下游信號分子的機制產生了濃厚的興趣。研究阿片樣受體時發現：兩單體間可以以二硫鍵的方式共價連接形成二聚體，也可以通過跨膜區(TM)非共價結合，抑或兩者同時存在[19]。隨后，Huang等[20]研究二聚體的晶體結構時也發現，受體的跨膜區對二聚體的形成及穩定具有重要的作用。Wu等[21]在研究趨化因子受體4(chemokine receptor 4,CXCR4)與μ-阿片受體形成的二聚體的晶體結構時發現，盡管兩者之間僅有少數幾個氨基酸殘基相互作用，且跨膜螺旋區5、6也存在顯著差異，但TM5、TM6確是CXCR4與μ-阿片受體形成二聚體的關鍵區域，而TM3、TM4則是維持其穩定的次要區域，TM1、TM2及第8螺旋區(H8)[19]也參與其穩定。TM1-TM2-H8形成的界面除了在CXCR4與μ-阿片受體的二聚體中發揮重要作用以外，同時也是κ-阿片受體[21]、視紫紅質受體[22]、β1-腎上腺素受體[20]的二聚體形成的主要界面。

如前所述，GPCRs的跨膜區域影響二聚體的形成，而近期研究表明，GPCRs的胞內外及C末端均參與二聚體的形成過程，如我們利用BRET技術對小鼠Orexin 2型受體C末端選擇性剪接產生的兩個受體mOX2 R和mOX2 R (剪接變異體)之間的相互作用研究,發現受體C末端對兩受體間形成二聚體發揮重要作用[23]。以二硫鍵為主的參與GPCRs胞內外相互作用的靜電作用力，在二聚體的形成過程中也是不可忽視的[24-25]。研究表明，這種靜電作用力主要存在于二聚體胞內區域的不對稱及不規則結構中[25-26]。此區域具有以下特點：其中一個受體含有一系列鄰近的精氨酸殘基；另一個受體包含酸性殘基及幾個鄰近的或至少一個磷酸化的絲氨酸，而兩者相互作用形成的多聚精氨酸磷酸鹽產生極強的靜電作用力。利用表面等離子(surface plasmon resonance,SPR)技術研究發現，通過這種方式形成的二聚體具有較低的解離常數，且此結合力能夠抵擋質譜誘導碰撞解離產生的作用力[25]。如果靜電作用力在二聚體胞內區域占主導地位，比TM界面的作用力還要強，我們推測這些二聚體比其各自單體狀態還穩定。腺苷2A受體(adenosine 2A receptor,A2AR)-多巴胺受體D2(dopamine receptor 2,D2R)的異源二聚體驗證了這一觀點，D2R的N端區第3個胞內環富含精氨酸，A2AR的C末端遠端含有酸性殘基，兩者相互作用形成的靜電作用力使得A2AR-D2R二聚體具有較強的穩定性[27-28]。但是突變或肽介導會破壞靜電作用力，導致A2AR-D2R二聚體解離以及由此二聚體產生的功能消失[29]。如在腦組織中，A2AR-D2R二聚體會降低由D2R介導的紋狀體神經元放電引起的抑郁，但隨著A2AR-D2R二聚體的解離，上述抑制功能消失[30]。(見表1)。

表1 A族受體TM區功能[31]

GPCRs的A族受體劃分為1～7，每個TM區都有一個保守的氨基酸，被記做“50”，其他氨基酸由此相對位置命名。如TM1區的N位點為保守氨基酸，記做1.50，I位點在排在其后，所以記做1.51，以此類推。

3 GPCRs二聚體的功能

3.1 變構調節

變構調節是指某些小分子結合到酶活性中心以外的位點，引起酶分子構象改變，進而導致酶活性的改變，為更好地研究GPCRs二聚體的變構調節,依據變構調節劑的作用位點分為3種類型，即經典的別構調節、細胞質別構調節、細胞膜別構調節[32]。別構調節劑雖然沒有正構激動劑較強的親和力與內在功效，但其具有飽和性。如果別構調節劑結合到活性中心以外的位點，通過改變受體的空間構象而改變另一受體與正構激動劑的親和力，能在一定程度上影響它的劑量反應曲線。

如果別構調節劑與正構激動劑具有競爭性的關系，那么上述“右移”現象將會持續發生。這種經典的“天花板式”別構效應在治療成癮性疾病、抑郁、失眠等具有廣闊的前景[32]。FRET技術研究發現，受體二聚體形成過程中，某一受體空間構象的改變將通過變構調節的方式影響另一受體的活性狀態，如D1R-D2R形成二聚體時，D1R構象的改變變構調節D2R受體，使此二聚體轉向激活D1R與D2R均不介導的Gαq/11信號通路。

細胞質變構調節往往導致受體功能偏向性，這主要是由于二聚體的形成導致受體構象改變，使其偏向性的單純結合某一下游信號分子如G蛋白、GPCRs激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRKs)及β-arrestins等。通常情況下，激動劑激活GPCRs后，GRK迅速聚集在GPCRs周圍磷酸化其尾部多個位點，隨后β-arrestins募集引起GPCRs脫敏、內化。但GPCRs也可以直接作用于β-arrestins，介導由促分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein kinase,MAPK)引起的獨立下游信號通路，為既能達到治療效果又能減少副作用提供了理論依據。如卡維地洛，β-arrestins的偏向性配體，在阻斷依賴G蛋白的信號通路的同時還激活了依賴β-arrestin的信號通路，在治療心衰中發揮了重要的作用[33]。

3.2 改變配體親和力

GPCRs二聚體形成過程中會引起受體構象改變、形成性的配體結合位點及單體受體結合位點的改變等，這種改變不僅會導致受體的變構調節作用，通常也會影響受體對配體的親和力。配體親和力的改變的原因主要有以下2點[32]：首先，二聚體會形成新的結合位點。相同受體形成二聚體時產生的結合位點，且單體的配體同時能夠結合新位點時，將會產生協同效應(正協同或負協同效應，圖2[34])；若新位點的配體不是單體配體時，則會依據二聚體的不同配體產生不同的效應。膽囊收縮素受體A(cholecystokinin receptor A,CCKRA)與CCKRB形成異源二聚體時，CCKA-B二聚體對膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)的親和力比任一單體的都高，對胃泌素的親和力要比CCKRA對胃泌素的親和力高4倍左右[35]。6'-guanidinonaltrindole (6-GNTI) 可作用于DOR-KOR二聚體發揮鎮痛功效，但對任一單個受體作用無效。不同受體形成二聚體時也會產生新的結合位點，通常會增加受體的敏感性與特異性，因為受體異同可增加二聚體類型的種類。研究δ-阿片受體與μ-阿片受體的二聚體時發現，δ受體的拮抗劑會增加嗎啡或μ受體激動劑的親和力并增強由此產生的下有信號轉導途徑；只有部分μ受體的拮抗劑會增強δ受體的結合力與轉導途徑[36-37]。 Bushlin等[38]研究DOR與大麻素受體CB1(cannabinoid receptor ,CB1R)二聚體時，發現CB1R的別構調節劑會影響DOR與配體結合的能力。在共表達CB1R與DOR的體系中，低濃度的CB1R的激動劑或部分拮抗劑就會明顯增強DOR的配體結合能力及信號轉導途徑。此外還發現在神經性疼痛疾病中DOR-CB1R的表達量上調，這樣為疾病的治療提供了新的藥物靶點。

圖2 不對稱配體結合GPCRs二聚體(a)配體結合受體1(R1)誘導受體2(R2)構象變化，導致配體B結合特性改變，發生正/負協同效應(b)變構配位體C結合R1誘導R2構象變化，導致配體B結合特性改變，發生正/負協同效應[34]。

其次，二聚體發揮作用時，其中一個受體通常作為另一個受體的變構調節劑參與其中。在A2AR-D2R異源二聚體中，D2R會選擇性的修飾配體SCH-442416而影響其與A2AR的結合[39]。 Levoye等[40]發現，在褪黑素MT1-GPR50二聚體中，孤兒GPR50受體會明顯降低褪黑素與褪黑素MT1受體的結合。

3.3 影響內在功效與功能選擇

大量的實驗研究表明：當配體與二聚體中1個受體結合時，足以引起G蛋白活化并產生相應的功能；當配體與第2個受體結合時，會增強或降低其功能[41-42]。通常認為配體刺激第2個受體時會引起第1個受體內在功效的改變。Maurice等[43]研究褪黑素MT1同源二聚體發現Gαi蛋白與RDS20(能夠調節G蛋白信號轉導速度的小分子蛋白質)競爭性結合受體H8的位點，當Gαi蛋白與RDS20分別結合到MT1二聚體單體的H8相應位點時，RGS20會延長G蛋白的活化，增強G蛋白的信號轉導通路。除上述情況外，在GPCRs二聚體中，其中一個受體的配體也會引起其它受體內在功效的改變。如在α2A腎上腺素受體(α2A-adrenoceptor,α2AR)與μ-阿片受體異源二聚體中，嗎啡會抑制α2AR的信號通路。FRET檢測表明，嗎啡激活異源二聚體中的μ-阿片受體時通過變構調節作用會引起α2AR空間構象的改變，這種改變過程僅需0.4s，遠遠快于G蛋白的活化過程[44]。因此，當嗎啡作用于二聚體時會改變α2AR的下游信號途徑。二聚體中，其中一個受體的配體會引起另一受體內在功效的改變，同樣其中一個受體的配體也會引起以二聚體為單位的內在功效的改變。在代謝型谷氨酸受體2(metabotropic glutamate,mGlu2)與血清素5-HT受體(serotonin 5-hydroxy trptamine,5-HT2A)異源二聚體中，與各自單體相比，谷氨酸會增強mGlu2-5-HT2A中mGlu2的信號通路，血清素卻減弱mGlu2-5-HT2A中5-HT2A的信號轉導途徑，而5-HT2A受體的拮抗劑氯氮平則加強谷氨酸的作用，這一發現治療精神分裂癥等疾病提供了新的藥物靶點[45]。

如前所述，二聚體中的某一受體會影響另一受體的空間構象，除引起其內在功效的改變，還能導致其生理功能的改變。在正常生理狀態下，μ-阿片受體多以單體的形式存在，嗎啡主要誘導激活G蛋白信號途徑產生鎮痛作用，也會微弱激活β-arrestin介導的信號途徑產生鎮痛耐受的副作用[46]。但長期使用嗎啡治療時，會誘導δ-μ二聚體的大量生成，此時嗎啡選擇性地激活β-arrestin信號途徑產生鎮痛耐受性，而無鎮痛療效[45-47]。研究發現，利用δ受體的特異性拮抗劑優先結合δ受體或利用δ-μ二聚體的二價配體可以避免副作用而發揮鎮痛作用[48]，這樣為新藥的研發提供了新思路。

此外，二聚體選擇性的偶聯不同亞型的G蛋白也會導致其生理功能的改變。在正常肝臟中，血管緊張素1型受體(angiotensin type 1 receptor,AT1R)主要偶聯Gαq亞基；在酒精肝中，隨著CB1R表達量上調逐漸形成AT1R-CB1R二聚體，AT1R轉向激活Gαi亞基的下游信號通路，這主要是由于CB1R的拮抗劑會阻礙AT1R與Gαq亞基的結合。因AT1R-CB1R二聚體具有明顯的組織特異性，故可作為肝性疾病的評判指標及治療靶點[49]。近期研究表明，D1R-H3-σ1二聚體能有效減輕可卡因作用于D1R引起的神經毒性。生理狀態下，D1R激活Gαs亞基及β-arrestin介導下游信號通路；疾病時，D1R-組胺H3受體(histamine H3 receptor)二聚體上調，H3受體的激動劑抑制D1R偶聯Gαs亞基與β-arrestin，促進細胞凋亡。當兩次跨膜受體σ1(可卡因的特異性受體)與D1R-H3形成異源三聚體時，σ1受體能有效地阻斷H3受體對D1R的抑制作用，減輕可卡因誘導的神經毒性[50]。

綜上所述，GPCRs通過跨膜區、二硫鍵、靜電作用力等相互作用形成二聚體，二聚體間或形成新的配體結合位點或通過變構調節,進一步影響配體親和力、受體內在功效及生理功能等，這表明二聚體有望成為判斷某些疾病的指標及藥物發的新靶點。

4 藥理作用展望

當探討GPCRs二聚體藥理學作用及以此作為藥物或治療靶點時，我們不得不考慮，現有實驗數據多數是在體外培養細胞的過表達體系中獲得，在生理狀態下的正常細胞、組織或器官中,GPCRs同源/異源二聚體或高階寡聚體是怎樣工作的，在原生細胞 (native cell)正常表達水平上，受體間的天然相互作用情況又是怎樣的情況，需要我們進一步深入研究。目前應用于GPCRs領域的檢測新技術，已經在活體中發現有GPCRs二聚體的存在。如Hasbi等[51]利用原位定量FRET技術檢測到腦組織中有D1R-D2R二聚體，因此，為研發靶向于GPCRs二聚體的藥物賦予了真實的意義。

另一方面，雖然GPCRs是對生物、醫學研究和改善健康等多種疾病的主要焦點之一，但GPCRs家族成員頗多，多數激動劑不僅僅作用于單一的受體，因此,存在治療以外的副作用。Conn等[52]在研究GABAA受體介導的門控離子通道時,發現變構調節劑可以克服配體潛在的選擇性問題,這樣發現極大地促進了GPCRs二聚體在藥物研發及疾病治療中的地位，因為二聚體不僅能形成新的配體結合位點，而且大多數二聚體間存在變構調節的作用(如前所述)。Orru等[39]研究表明，與單獨表達A2AR或A1AR相比，SCH-442416(A2AR的拮抗劑)明顯降低A2AR-D2R二聚體中A2AR的親和力；而MSX-3(A2AR的拮抗劑)也會降低A2AR的親和力，但作用不強。上述通過變構調節作用引起的親和力的改變具有重要的藥理學意義，因為紋狀體中不同亞群A2AR的二聚體能夠調節紋狀體不同的生理功能[53]。A2AR-D2R二聚體主要存在于GABA能神經元突觸后膜，調節其活性[30]。A1AR-A2AR二聚體存在于紋狀體谷氨酸末端突觸前膜，調節神經遞質傳遞給GABA能神經元[54]。在這些二聚體的相互作用下，會抑制突觸后膜A2AR的自發活化，并阻礙突觸前膜A1AR對神經遞質傳遞的抑制[39-54]。突觸后膜中，由于對A2AR-D2R二聚體的變構調節作用對A2AR產生的抑制作用會直接導致帕金森病發生，而研究表明，只有A2AR的拮抗劑才能抑制此病的發展[55]。對于突觸前膜的抑制作用將會導致藥物成癮性，但伴隨著突觸后膜中A2AR抑制作用的減弱此現象會反轉[39,55]?；诖搜芯拷Y果，Justinova等[56]研究表明，SCH-442416與MSX-3等類似藥物均可用于治療藥物成癮性疾病，且SCH-442416比MSX-3療效更明顯。

此外，GPCRs二聚體特有的配體結合飽和性、偏向性配體及偏向性信號轉導通路均具有重要的藥理學意義。雖然上市藥物中存在很多靶向于GPCRs的藥物，但基于GPCRs單體的藥物往往具有副作用。研究表明，GPCRs二聚體具有不同于單體特殊的生理功能，如能差異性的在某些特定組織表達、增強配體特異性及與二價配體結合等。如果能夠找到適宜的技術并針對性的研發靶向于某特定組織中GPCRs二聚體的藥物，將會在很大程度上改善臨床療效并降低藥物副作用。本實驗室目前正展開對Apelin受體、阿片受體的同源/異源二聚體介導的下游信號通路及生理、病理功能，進行體內外細胞和組織研究，希望能為此后的研究打下堅實的基礎[57-58]。

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G protein coupled receptors oligomerization:functional and pharmacological perspectives

CHENJing，JIANGYunlu

(Department of Neurobiology,Jining Medical University,Jining 272000,China)

G protein-coupled receptors (GPCRs),one of the largest membrane receptor superfamily,which can regulate a variety of downstream signaling pathways,is one of the central issues of medical research and program.The drugs based on monomeric GPCRs usually accompany with side effects.But with the proven of GPCRs dimers and oligomers,oligomers has been gazed in clinical disease treatment and drug development because of the differences with monomer in intrinsic efficacy,ligand choice and functional selectivity which is induced by allosteric regulation.In this article,the determinants of conformation,function and pharmacological effect of GPCRs oligomers are discussed comprehensive.

G protein-coupled receptor;Allosteric regulation;Fluorescence correlation spectroscopy;Total internal reflection fluorescence microscope

* [基金項目]國家自然科學基金項目(編號：3097108，31271243，81070961)山東省自然科學基金項目(編號：ZR2011CM027，2012GSF11806)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.01.001

Q51

A

1000-9760(2015)02-001-08

2015-03-10)