雞KLF3基因的表達規律及其對脂肪細胞分化的影響研究

王海霞，張志威,2，賀 綦，王 寧，王宇祥，曹志平，李 輝*

(1.東北農業大學動物科學技術學院，農業部雞遺傳育種重點實驗室，黑龍江省普通高等學校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030； 2.石河子大學醫學院，石河子 832000)

雞KLF3基因的表達規律及其對脂肪細胞分化的影響研究

王海霞1，張志威1,2，賀 綦1，王 寧1，王宇祥1，曹志平1，李 輝1*

(1.東北農業大學動物科學技術學院，農業部雞遺傳育種重點實驗室，黑龍江省普通高等學校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030； 2.石河子大學醫學院，石河子 832000)

為研究雞KLF3(GallusgallusKrüppel-like factor 3，gKLF3)基因的表達規律及其對脂肪細胞分化的影響，利用qRT-PCR檢測了其在肉雞脂肪組織和脂肪細胞中的表達特點，并利用基因過表達技術研究gKLF3基因對脂肪細胞分化的影響。結果顯示，gKLF3在2～10周齡肉雞腹部脂肪組織中持續表達，10周齡高脂肉雞腹部脂肪組織gKLF3表達量顯著高于低脂肉雞(P<0.05)；gKLF3在雞成熟脂肪細胞的表達量低于前脂肪細胞(P<0.01)；體外培養的雞前脂肪細胞經油酸誘導分化后，gKLF3基因表達量均有低于對照組的趨勢；過表達gKLF3基因有抑制脂肪細胞分化，以及抑制C/EBPα、FAS基因表達(P<0.01)的趨勢。研究結果表明，gKLF3基因在雞腹部脂肪組織生長發育過程中發揮重要作用，其可能是通過抑制C/EBPα、FAS基因表達進而抑制脂肪細胞分化實現的。

雞；KLF3基因；脂肪細胞分化；基因表達

Krüppel-like factor 3(KLF3)具有3個典型的C2H2鋅指結構，是Sp1/KLFs蛋白家族的一個成員，早在1996年，從小鼠紅細胞(Murine erythroid cells)中克隆得到[1]。因為在其N端具有較多的堿性氨基酸，所以KLF3又被稱為堿性KLF因子(Basic Krüppel like factor，bKLF)[1]。目前，KLF3已經被證實在哺乳動物的紅細胞生成[2]、免疫反應[3]、自噬作用[4]、心肌細胞分化[5]和脂肪細胞分化[6]中發揮重要作用。

KLF3基因敲除小鼠(KLF3-/-)比正常小鼠擁有較少的白色脂肪組織，并且附睪脂墊中的脂肪細胞無論是數量，還是體積都小于正常小鼠[6-7]。細胞水平的研究證實KLF3在脂肪細胞分化中發揮作用。3T3-L1前脂肪細胞系的研究表明，KLF3基因的表達量隨著脂肪細胞的分化而下降，強制表達KLF3基因抑制3T3-L1脂肪細胞的分化[6]，進一步的機制研究顯示，KLF3通過抑制C/EBPα基因的表達抑制脂肪細胞分化。在秀麗隱桿線蟲中的研究表明，KLF3通過調控脂肪酸去飽和途徑基因的表達水平，參與調控維持正常脂肪酸復合物的形成[8]； 此外，KLF3是調控脂蛋白組裝、分泌和脂肪酸β-氧化的重要基因[9]。

目前還沒有關于KLF3基因在鳥類中的研究報道。本研究以東北農業大學肉雞高、低脂系為試驗材料，利用qRT-PCR的方法檢測gKLF3基因在2～10周齡高低脂系肉雞腹部脂肪組織、12日齡Arbour Acres(AA)仔雞成熟脂肪細胞和前脂肪細胞，以及脂肪細胞分化過程中的表達特點；同時，通過基因過表達試驗研究了gKLF3基因對雞前脂肪細胞分化的影響，為進一步研究gKLF3基因調控脂肪分化的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

東北農業大學肉雞高低脂選擇系第11世代2～10周齡公雞[10]。每個時間點，高脂系、低脂系各取3只為試驗材料，采集新鮮的腹脂樣品于-80 ℃保存備用。12日齡的AA肉仔雞由本課題組飼養。雞KLF3基因過表達質粒(pCMV-myc-gKLF3)由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 雞前脂肪細胞和成熟脂肪細胞分離 取12日齡AA肉仔雞公雞，超凈臺中取腹部脂肪組織(腹部及肌胃周圍脂肪組織)放入裝有磷酸鹽緩沖液(PBS)的平皿中；用PBS將脂肪組織洗2遍，盡量除去血管和筋膜，用眼科剪剪碎組織，大約剪到1 mm3體積大??；用0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液消化組織，37 ℃消化65 min(每5 min搖勻1次)；消化完畢，加入全培養基終止消化，吸管吹打，靜置分層，取上層油狀物下的絮狀物即為成熟脂肪細胞，其余部分分別經100和600目不銹鋼篩網過濾，濾液分裝入離心管中，2 000 r·min-1離心10 min；棄去上清，加入紅細胞裂解液重懸細胞，室溫靜置10 min后，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，獲得的沉淀即前脂肪細胞[11]。

1.2.2 雞前脂肪細胞的培養和誘導分化 將分離的雞前脂肪細胞沉淀加入適量的全培養基重懸、吹勻，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2 d換液1次，一般4～5 d長滿，即可傳代；當傳代培養的雞前脂肪細胞匯合至80%左右時，加入誘導培養基(含有160 μmol·L-1油酸濃度的培養基)進行誘導分化，每2 d換1次誘導培養基繼續培養。

1.2.3 總RNA提取及反轉錄 按照TRIzol 試劑(Invitrogen)說明書提取雞脂肪組織、成熟脂肪細胞和前脂肪細胞的總RNA。

1.2.4 油紅O提取比色 在雞前脂肪細胞誘導分化后的24、72、120 h，分別棄去培養基，用PBS洗3次，用10%甲醛固定30 min；然后用PBS洗3次，蒸餾水洗3次，再用0.5%的油紅O染色液染色40 min；棄去多余的染色液，用PBS沖洗3次，室溫干燥；加入100%異丙醇溶解細胞中的油紅O，15 min后用分光光度計(510 nm)記錄光吸收值。

1.2.5半定量PCR 根據NCBI數據庫gKLF3基因預測序列XM_427367，利用Primer premier 5.0結合UCSC雞基因組數據庫跨內含子設計gKLF3基因表達分析引物，以gGAPDH基因為內參，半定量PCR用到的引物詳見表1。擴增片段大小gKLF3基因為276 bp，gGAPDH基因為185 bp。循環次數分別為28和25。以脂肪組織和脂肪細胞的cDNA為模板，擴增片段，瓊脂糖凝膠電泳獲得電泳圖片，利用Quantity one Bio-rad軟件檢測基因電泳條帶的積分光密度IOD(Integrated option density，IOD)值?；虻南鄬Ρ磉_量：

表1 用于PCR的引物

Table1PrimersusedforPCR

基因Gene引物(5'-3')PrimergKLF3F:CCAGCCAGTTCCTTTCATR:ACTTCCTGCGGAGACAATC/EBPαF:AGCTCGACCCGCTGTACR:TGTCTTTTTGGATTTGCFASF:AAGGAGGAAGTCAACGGR:TTGATGGTGAGGAGTCGβ-actinF:TCTTGGGTATGGAGTCCTGR:TAGAAGCATTTGCGGTGGgGAPDHF:CTGTCAAGGCTGAGAACGR:GATAACACGCTTAGCACCA

1.2.7 Western blot 待細胞培養至預定時間，棄培養基，室溫下用PBS清洗細胞。然后向6孔板中加入細胞裂解液(RIPA Buffer)(每孔0.15 mL)，放置于冰上，輕輕搖動，作用15 min。裂解完成后，將含有細胞的裂解液移至1.5 mL離心管中。10 000 r·min-14 ℃離心10 min后，將上清(細胞總裂解物)轉至新的離心管，與等體積凝膠加樣緩沖液(2×)混合，在100 ℃加熱3～5 min使蛋白質變性。每個樣品取10～20 μL，采用BIO-RAD 的Mini-PROTEAN3電泳系統進行常規SDS-PAGE電泳。電泳結束后，采用BIO-RAD的Mini Trans-Blot將樣品轉移至PVDF膜，將膜置于封閉液(5%脫脂乳的PBST)，室溫反應1 h，或4 ℃過夜。洗去膜上的封閉液，將膜孵育在含一抗(Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody)的PBST溶液，置于搖床上，室溫反應1 h；洗膜后將膜孵育在含二抗(Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated)的PBST溶液；再次洗膜后常規ECL顯色。

1.2.8 細胞轉染 細胞轉染按照羅氏FuGENE HD轉染試劑操作說明書進行。

1.2.9 數據分析 數據分析采用Student-t，數據表示為“平均數±標準差(Mean±SD)”，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1gKLF3基因在高低脂系11世代2～10周齡肉雞脂肪組織的表達分析

利用半定量PCR分析了gKLF3基因在東北農業大學肉雞高、低脂系11世代2～10周齡肉雞脂肪組織中的表達。結果顯示，gKLF3在2～10周齡肉雞腹部脂肪組織的生長發育過程中持續表達，10周齡時，高脂肉雞腹部脂肪組織gKLF3表達水平顯著高于低脂肉雞(P<0.05，圖1)。

2.2 雞脂肪細胞中gKLF3基因的表達規律分析

利用qRT-PCR方法分析AA肉雞前脂肪細胞和成熟脂肪細胞中gKLF3基因的表達水平，結果顯示，gKLF3基因在雞前脂肪細胞(Stromal-vascular cell，SV)中的表達量高于成熟脂肪細胞(Fat cell，FC)(P<0.01， 圖 2A)。此外，本研究發現，體外培養的雞前脂肪細胞經油酸誘導分化后，gKLF3基因的表達量在4個時間點(24、48、72和96 h)均有低于對照組(未經油酸誘導)的趨勢，但沒有達到顯著水平(圖 2B)。

2.3 過表達gKLF3對雞前脂肪細胞分化的影響

為了進一步研究gKLF3基因在雞前脂肪細胞分化過程中的作用，本研究利用過表達技術分析了gKLF3基因對雞前脂肪細胞分化的影響。在雞前脂肪細胞中轉染質粒pCMV-myc-gKLF3和pCMV-myc(Empty Vector，EV)，48 h后回收細胞，用myc標簽抗體進行Western blot，結果顯示pCMV-myc-gKLF3質粒能在前脂肪細胞中成功表達蛋白(圖3A)。將雞KLF3基因過表達質粒(pCMV-myc-gKLF3)轉染到原代培養的雞前脂肪細胞中，培養24 h后，加入油酸誘導細胞分化，油紅O提取比色結果顯示，在誘導后的24、72和120 h，與轉染空載體的對照組細胞相比，過表達gKLF3基因的雞前脂肪細胞中脂滴沉積出現減少的趨勢，但沒有達到顯著水平(圖3B)。

柱狀圖表示gKLF3的相對表達量(平均數±標準差)，*表示差異顯著(P<0.05)The diagrams show the relative expression of gKLF3 gene(Mean±SD).* means significant difference(P<0.05)圖1 gKLF3基因在脂肪組織發育過程中的表達Fig.1 Tissue expression pattern of gKLF3 gene in abdominal fat tissue during development

A.KLF3基因在原代分離(未經培養)的雞前脂肪細胞和成熟脂肪細胞中的表達規律；B.KLF3基因在油酸誘導分化的前脂肪細胞和對照組(未經油酸誘導分化)中的表達規律。**.差異極顯著(P<0.01)。下同A.KLF3 mRNA expression in chicken preadipocytes(SV) and mature adipocytes(FC) were detected；B.KLF3 mRNA expression in preadipocytes which induced into differentiation by oleate and control group(which not induced into differentiation) was detected .** indicates significant difference(P<0.01).The same as below圖2 gKLF3基因在雞前脂肪細胞和成熟脂肪細胞中表達特性Fig.2 Expression characteristics of gKLF3 gene in chicken preadipocytes and adipocytes

2.4 過表達gKLF3基因對雞前脂肪細胞分化標志基因的影響

為了分析gKLF3基因對雞前脂肪細胞分化的影響，利用qRTPCR檢測了脂肪細胞分化過程的標志基因(FAS、C/EBPα)的表達變化。結果發現，過表達gKLF3基因，在24 h顯著抑制C/EBPα基因的表達(P<0.01)，在72 h顯著抑制FAS、C/EBPα基因的表達(P<0.01，圖4)。

3 討 論

KLF家族的成員在哺乳動物脂肪發育中發揮著重要作用[12-14]。在3T3-L1細胞系中的研究顯示，KLF3是脂肪細胞分化的負調控因子，但是KLF3基因敲除小鼠的脂肪組織減少[6]，表明了KLF3在脂肪組織生長發育過程中具有多個調控功能，目前還沒有關于鳥類KLF3的研究報道，本研究結果顯示，gKLF3基因在高低脂系2～10周齡肉雞腹部脂肪組織中均有表達(圖1)，暗示了與小鼠KLF3相似，gKLF3基因在雞脂肪組織生長發育過程中具有調控作用；在10周齡時，高脂肉雞gKLF3基因表達水平顯著高于低脂肉雞(P<0.05，圖1)，暗示gKLF3的表達水平可能是影響肉雞腹部脂肪組織沉積的一個因素。

A.Western blot檢驗pCMV-myc-gKLF3在前脂肪細胞中的過表達效果；B.油紅O提取比色分析過表達gKLF3基因對脂肪細胞脂滴沉積的影響A.Western blot analysis of gKLF3 overexpression in chicken preadipocytes transfected with pCMV-myc-gKLF3 or EV；B.The lipid content of chicken preadipocytes which were transfected with pCMV-myc-gKLF3 and pCMV-myc，induced into differentiate by oleate，and absorbance was measured at 510 nm圖3 過表達gKLF3基因對雞前脂肪細胞分化的影響Fig.3 Effects of gKLF3 gene over-expression on chicken preadipocyte differentiation

圖4 過表達gKLF3基因對雞前脂肪細胞分化標志基因的影響Fig.4 Expression analysis of differentiation marker genes in gKLF3-overexpressing chicken preadipocytes induced into differentiation by oleate

進一步分析gKLF3基因在前脂肪細胞和成熟脂肪細胞中的表達發現，gKLF3基因在前脂肪細胞中的表達量高于成熟脂肪細胞(P<0.01，圖2A)，并且在油酸誘導分化的雞脂肪細胞中，gKLF3表達水平有普遍低于對照組的趨勢，暗示與哺乳動物相似[6]，gKLF3基因在脂肪細胞分化中可能具有負調控作用。為了進一步研究gKLF3基因對雞脂肪細胞分化的作用，筆者在雞前脂肪細胞中過表達gKLF3基因，油紅O提取比色顯示，在油酸誘導后的24、72和120 h，過表達gKLF3基因的脂肪細胞呈現脂滴形成減少的趨勢(圖3B)，進一步暗示gKLF3基因與小鼠KLF3類似[6]，在體外具有抑制前脂肪細胞分化的作用。

C/EBPα是哺乳動物和鳥類脂肪形成的重要調控因子[12，14-16]。C/EBPα基因敲除小鼠的研究表明，C/EBPα表達是白色脂肪組織發育的必須條件[17]。此外，C/EBPα在脂肪細胞終末分化中發揮重要調控作用[18-20]。FAS基因在動物體脂沉積中發揮了重要的作用[21]，它可以將碳水化合物合成脂肪酸，并以甘油三酯的形式儲存[22]。本研究發現，過表達gKLF3基因，在72 h會顯著抑制FAS、C/EBPα基因的表達，在24 h顯著抑制C/EBPα基因的表達(圖4，P<0.01)。筆者推斷，與哺乳動物相似[6]，gKLF3基因可能通過抑制C/EBPα基因的表達抑制脂肪細胞分化。而gKLF3對FAS具有轉錄抑制作用，則暗示了與線蟲KLF3[8]相似，KLF3可能具有抑制脂肪酸從頭合成和調控脂類沉積的功能。

綜上所述，本研究結果顯示gKLF3和已經報道的哺乳動物及線蟲中KLF3相似，在肉雞脂肪組織生長發育中至少具有2個功能，即抑制脂肪細胞分化和調控脂類合成代謝。此外，gKLF3是否直接調控C/EBPα、FAS基因的表達等具體作用機制，還有待熒光素酶活性檢測、染色質免疫共沉淀等試驗的進一步分析和驗證。

[1] CROSSLEY M，WHITELAW E，PERKINS A，et al.Isolation and characterization of the cDNA encoding BKLF/TEF-2，a major CACCC-box-binding protein in erythroid cells and selected other cells[J].MolCellBiol，1996，16(4)：1695-1705.

[2] FUNNELL A P，MALONEY C A，THOMPSON L J，et al.Erythroid Krüppel-like factor directly activates the basic Krüppel-like factor gene in erythroid cells[J].MolCellBiol，2007，27(7)：2777-2790.

[3] ULGIATI D，SUBRATA L S，ABRAHAM L J.The role of Sp family members，basic Krüppel-like factor,and E box factors in the basal and IFN-gamma regulated expression of the human complement C4 promoter[J].JImmunol, 2000，164(1)：300-307.

[4] GUO L，HUANG J X，LIU Y，et al.Transactivation of Atg4b by C/EBP beta promotes autophagy to facilitate adipogenesis[J].MolCellBiol，2013，33(16)：3180-3190.

[5] HIMEDA C L，RANISH J A，PEARSON R C，et al.KLF3 regulates muscle-specific gene expression and synergizes with serum response factor on KLF binding sites[J].MolCellBiol，2010，30(14)：3430-3443.

[6] SUE N，JACK B H，EATON S A，et al.Targeted disruption of the basic Krüppel-like factor gene(Klf3) reveals a role in adipogenesis[J].MolCellBiol，2008，28(12)：3967-3978.

[7] BELL-ANDERSON K S，FUNNELL A P，WILLIAMS H，et al.Loss of Krüppel-like factor 3(KLF3/BKLF) leads to upregulation of the insulin-sensitizing factor adipolin(FAM132A/CTRP12/C1qdc2)[J].Diabetes，2013，62(8)：2728-2737.

[8] ZHANG J，YANG C，BREY C，et al.Mutation in Caenorhabditis elegans Krüppel-like factor，KLF-3 results in fat accumulation and alters fatty acid composition[J].ExpCellRes，2009，315(15)：2568-2580.

[9] ZHANG J，HASHMI S，CHEEMA F，et al.Regulation of lipoprotein assembly，secretion and fatty acid beta-oxidation by Krüppel-like transcription factor，klf-3[J].JMolBiol，2013，425(15)：2641-2655.

[10] GUO L，SUN B，SHANG Z，et al.Comparison of adipose tissue cellularity in chicken lines divergently selected for fatness[J].PoultSci，2011，90(9)：2024-2034.

[11] ZHANG Z，WANG H，SUN Y，et al.Klf7 modulates the differentiation and proliferation of chicken preadipocyte[J].ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)，2013，45(4)：280-288.

[12] ROSEN E D，MACDOUGALD O A.Adipocyte differentiation from the inside out[J].NatRevMolCellBiol，2006，7(12)：885-896.

[13] LEFTEROVA M I，LAZAR M A.New developments in adipogenesis[J].TrendsEndocrinolMetab，2009，20(3)：107-114.

[14] FARMER S R.Transcriptional control of adipocyte formation[J].CellMetab，2006，4(4)：263-273.

[15] WANG Y，MU Y，LI H，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma gene：a key regulator of adipocyte differentiation in chickens[J].PoultSci，2008，87(2)：226-232.

[16] LIU S，WANG Y，WANG L，et al.Transdifferentiation of fibroblasts into adipocyte-like cells by chicken adipogenic transcription factors[J].CompBiochemPhysiolAMolIntegrPhysiol，2010，156(4):502-508.

[17] LINHART H G，ISHIMURA-OKA K，DEMAYO F，et al.C/EBPalpha is required for differentiation of white，but not brown，adipose tissue[J].ProcNatlAcadSciUSA，2001，98(22)：12532-12537.

[18] EL-JACK A K，HAMM J K，PILCH P F，et al.Reconstitution of insulin-sensitive glucose transport in fibroblasts requires expression of both PPARgamma and C/EBP alpha[J].JBiolChem，1999，274(12)：7946-7951.

[19] LIN F T，LANE M D.CCAAT/enhancer binding protein alpha is sufficient to initiate the 3T3-L1 adipocyte differentiation program[J].ProcNatlAcadSciUSA，1994，91(19)：8757-8761.

[20] MACDOUGALD O A，HWANG C S，FAN H，et al.Regulated expression of the obese gene product(leptin) in white adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes[J].ProcNatlAcadSciUSA，1995，92(20)：9034-9037.

[21] SMITH S，WITKOWSKI A，JOSHI A K.Structural and functional organization of the animal fatty acid synthase[J].ProgLipidRes，2003，42(4)：289-317.

[22] CHIRALA S S，WAKIL S J.Structure and function of animal fatty acid synthase[J].Lipids，2004，39(11)：1045-1053.

(編輯 郭云雁)

Expression Pattern of Chicken Krüppel-like Factor 3 Gene and Its Effect on Adipocyte Differentiation

WANG Hai-xia1，ZHANG Zhi-wei1，2，HE Qi1，WANG Ning1， WANG Yu-xiang1，CAO Zhi-ping1，LI Hui1*

(1.KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreedingofMinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductionatEducationDepartmentofHeilongjiangProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China； 2.SchoolofMedicine，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China)

This experiment was conducted to study the expression pattern of Krüppel-like factor 3(GallusgallusKLF3，gKLF3) gene，and its effect on adipocyte differentiation.The expression pattern ofgKLF3 in the adipose tissue and adipocytes of broilers were analyzed by using qRT-PCR.The effect ofgKLF3 on adipocyte differentiation was analyzed by over-expression technology.The result showed thatgKLF3 was consecutively expressed during the chicken adipose tissue development from 2- to 10-week-old.At 10-week-old，thegKLF3 expression in the abdominal fat tissues was significantly higher in fat line chicken than that in lean line chicken(P<0.05).Additionally，the significantly highergKLF3 expression level was observed in preadipocytes in contrast to that in mature adipocytes(P<0.01).The expression levels ofgKLF3 in preadipocytes induced by oleate were lower than that in control.Moreover，over-expression ofgKLF3 inhibited adipocyte differentiation and down-regulated expression ofFASandC/EBPα(P<0.01).The result indicate thatgKLF3 play an important role in the growth and development of chicken abdominal adipose tissue，and might restrain adipocyte differentiation by inhibiting the expression ofC/EBPαandFAS.

chicken；KLF3 gene；adipocyte differentiation；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.004

2014-05-07

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102501)；國家肉雞產業技術體系建設項目(CARS-42)；黑龍江省高等學?？萍紕撔聢F隊建設項目(2010td02)

王海霞(1987-)，女，山東煙臺人，碩士生，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：haixiawang1025@126.com

*通信作者：李 輝，教授，E-mail：lihui@neau.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)01-0026-06