施馬倫貝格病毒病焦磷酸測序檢測方法的建立

張永強，吳曉東，趙永剛，王志亮

(中國動物衛生與流行病學中心，青島 266032)

施馬倫貝格病毒病焦磷酸測序檢測方法的建立

張永強，吳曉東，趙永剛，王志亮*

(中國動物衛生與流行病學中心，青島 266032)

擬建立施馬倫貝格病毒(SBV)S基因焦磷酸測序檢測方法，用于施馬倫貝格病毒病的快速檢測和確診。通過對公開發表的SBVS基因序列與布尼病毒科其他11種病毒S基因進行比對，找出不同病毒變異區域集中且變異區域兩側保守的序列片段，基因合成，體外轉錄，作為基因擴增模板。在特異性變異序列兩端的保守區域設計擴增引物，進行RT-PCR擴增。在保守區域設計雙向測序引物，對RT-PCR產物進行雙向焦磷酸測序。通過比對測序結果，確定是否為SBV核酸序列；優化條件，確定檢測方法的敏感性、特異性和重復性，建立SBVS基因焦磷酸測序檢測方法。結果：建立的施馬倫貝格病毒病焦磷酸測序檢測方法擴增基因片段長度為166 bp；敏感性為可檢測到104個拷貝；每一條測序引物可準確測出50 bp左右核酸序列，雙向測序可準確測出100 bp左右核酸序列，具有較好特異性，完全滿足施馬倫貝格病毒病確診要求；重復測序3次，均能準確測出100 bp左右核酸序列。本研究建立的施馬倫貝格病毒病焦磷酸測序檢測方法，可用于施馬倫貝格病毒病的檢測和確診，整個檢測過程可在1 d內完成，大大縮短了確診時間。

焦磷酸測序；施馬倫貝格病毒；S基因

施馬倫貝格病毒病是由施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)引起的蟲媒病毒性傳染病，因最早于2011年11月在德國西部施馬倫貝格小鎮被發現而得名。SBV是有囊膜的單股負鏈RNA病毒，屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)[1]。SBV主要感染綿羊、牛(包括野牛)和山羊等反芻動物，不感染人[2]。該病毒可經蠓等吸血昆蟲叮咬而傳播[3]，成年牲畜感染后表現為發熱、腹瀉、乏力等癥狀，產奶量降低；而懷孕期動物感染后往往導致流產、早產和死產，新生幼畜發生關節彎曲積水性無腦綜合征(arthrogryposis hydranencephaly syndrome， AHS)，表現為畸形、大腦發育不全、脊柱彎曲、關節無法活動等病癥[4-5]。該病自2011年發現以來，不斷有新的疫情報告，現已蔓延至歐洲中部、北部大部分國家，引起了歐盟和OIE等國際組織的高度重視。

傳統的病原學診斷技術包括病毒分離與鑒定、RT-PCR、實時PCR等方法，這些方法都具有較好的敏感性和特異性，在疫病的診斷上發揮了巨大的作用，但同時也具有自身的一些缺陷。病毒分離和鑒定，耗時長，對檢測人員和檢測設備要求高；RT-PCR、實時PCR可能出現假陽性，需要通過測序進行確診，延長了確診時間。

在分子生物學領域，最精確的診斷方法是基因測序。自1985年，焦磷酸測序技術(pyrosequencing technology，PSQ)[6]逐漸應用于病原的快速確診，它通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發酶的級聯反應，促使熒光素發光而實現檢測，其最大優點是可以實現高通量、快速，自該技術發明以來，已廣泛應用于單核苷酸多態性分析、細菌、真菌和病毒的分型、突變位點的檢測等。但其也有局限性，由于該項技術能測出的序列較短，要求目的序列變異區域相對集中，以便于測出完整變異區域；變異區域兩側需高度保守，以便于設計測序引物并確?？梢耘c所有基因型結合。本研究針對SBVS基因，比對包括SBV在內的布尼病毒科12種病毒近千條序列，找出了符合上述要求的區域，建立SBVS基因的焦磷酸測序檢測方法，為該病的快速確診提供了技術儲備。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Transcriptor One-Step RT-PCR Kit，T7 Transcription Kit購自Roche公司，膠回收試劑盒、DNA Marker購自大連寶生物有限公司、引物由大連寶生物有限公司合成，Pyro Gold SQA Reagents 1×96 Pyromark ID購自Biotage AB公司，PyroMark Q96 MD儀器購自QIAGEN。

1.2 引物設計

根據GenBank BLAST結果，與SBVS片段具有較高同源性的病毒有Simbu virus、Shamonda virus、Sathuperi virus、Sango virus、Sabo virus、Peaton virus、Douglas virus、Aino virus、Oropouche virus、Akabane virus和Rift valley fever virus。下載上述病毒所有S片段基因序列，應用Mega5.0軟件進行比對，找出符合焦磷酸測序擴增和測序引物設計要求的區域，運用PSQ Assay Design軟件設計SBV S擴增引物以及正向和反向測序引物，并在相應的擴增引物5′端標記生物素。詳見表1。

表1 引物名稱及序列

Table 1 Name and sequence of primers

焦磷酸測序引物TypeofPyrosequencing引物名Primer序列(5'→3')SequenceForwardPyrosequencingSBV-FFGCATATGTGKCATTTGASBV-FR(Biotin)Biotin-GGRAAATGGTTATTAACCSeq-FGAGTCTTCTTCCTYAAReversePyrosequencingSBV-RF(Biotin)Biotin-GCATATGTGKCATTTGASBV-RRGGRAAATGGTTATTAACCSeq-RTTRAGGAAGAAGACTC

1.3 模板制備

合成選取的SBVS基因片段，體外轉錄制備RNA，分裝后-80 ℃凍存備用。

1.4 RT-PCR條件優化

以制備的RNA為模板，以不同退火溫度進行RT-PCR反應，優化反應條件。RT-PCR產物一式兩份，一份送交公司測序，一份用于焦磷酸測序反應。

1.5 焦磷酸測序反應

1.5.1 測序單鏈模板的制備 根據Gene Company Limited公司的焦磷酸測序反應操作說明制備測序單鏈模板。將45 μL RT-PCR單鏈模板分別加入到PSQ 96板的孔中，并加入測序引物，并在85 ℃的烘箱中放置2 min，取出冷卻后就可進行焦磷酸測序。

1.5.2 測序反應 根據PSQTM 96MA System儀器的軟件說明在試劑艙中分別加入的底物APS、dNTPs和酶混合物(DNA聚合酶、熒光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)；然后將試劑艙和PSQ 96板放入PSQ TM 96 MD Sys tem儀器中，進行Pyrosequencing反應。

1.6 敏感性試驗

分別用Roche、Invitrogen和TaKaRa公司生產的RT-PCR試劑盒，以10倍稀釋的RNA為模板進行RT-PCR反應，確定最優反應試劑和敏感性。

1.7 特異性試驗

優化測序反應，提高準確測出的堿基序列，使測出的序列長度滿足待測樣品是否為SBVS基因序列的確診要求。

1.8 重復性試驗

將擴增的RT-PCR產物分別進行3次焦磷酸測序，比較每次測得的序列結果，確定試驗的重復性和穩定性。

2 結 果

2.1 RT-PCR反應

采用優化的RT-PCR反應條件以體外轉錄的

RNA為模板，用SBV擴增引物進行RT-PCR檢測。結果顯示，擴增出與目的條帶大小相符的特異性條帶，沒有非特異性擴增產物，滿足進行焦磷酸測序反應的需要(圖1) 。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1.SBV S 基因片段；2.陰性對照M.DL2000 DNA marker；1.SBV S gene segment；2.Negative control圖1 SBV S基因RT-PCR擴增結果Fig.1 RT-PCR amplification of SBV S gene

2.2 焦磷酸測序反應

對SBVS基因片段焦磷酸測序反應正向和逆向測序均能準確測出50 bp左右，雙向測序能準確測出100 bp左右，完全滿足確診需要。靶序列的焦磷酸測序結果與普通測序結果完全一致，符合率為100%，證明該試驗具有很好的特異性(圖2)。

縱坐標：峰的高度(光信號強度)用來判斷堿基的數目；橫坐標：每個循環的堿基種類；正向測序結果顯示，共測出58個堿基，其中48個堿基完全可信，另外10個堿基比較可信；反向測序結果顯示，共測出51個堿基，其中49個完全可信，另外2個比較可信Y-axis is indicate the peak value of sequencing (optical signal strength) in order to identy the DNA base amount.X-axis is indicate the gene sequence.The forwarcl pyrosequencing result shows that 58 base were sequencing,48 base among them were confirmed correctly and the other 10 bases were relatively confirmed.The reverse pyrosequening result shows that 51 bases were sequencing,49 bases among them were confirmed correctly and the other 2 bases were relatively confirmed圖2 焦磷酸測序技術檢測SBV病毒S基因Fig.2 Detection molecular marker of S gene in SBV

2.3 敏感性試驗結果

以合成基因制備的RNA為模板，10倍系列稀釋后，分別用不同試劑盒進行RT-PCR反應。結果顯示，Invitrogen公司RT-PCR試劑盒最為敏感，為102，經計算其最低檢測出的拷貝數為104，其它兩種試劑盒最低檢測敏感性為103個拷貝。見圖3。

1～9分別為以109、108、107、106、105、104、103、102、101拷貝的RNA為模板；A.Invitrogen公司RT-PCR試劑盒；B.Roche公司RT-PCR試劑盒；C.TaKaRa公司RT-PCR試劑盒1-9 is 109，108，107，106，105，104，103，102，101 copies RNA templates.A.The results of RT-PCR kit made in Invitrogen Company；B.The results of RT-PCR kit made in Roche Company;C.The results of RT-PCR kit made in TaKaRa Company圖3 敏感性試驗結果Fig.3 Sensitivity of the method

2.4 重復性試驗結果

對每個RT-PCR產物進行3次重復性檢測，檢測的結果均一致，證明該方法有很好的重復性與穩定性。

2.5 特異性試驗結果

通常情況下，該測序反應準確和較準確測出的堿基數為20～30 bp。作者經優化測序反應后，提高了準確測出的堿基序列，使正向和逆向測序反應中準確和較準確測出的序列分別達到50 bp左右(圖2)，因此準確測出序列可達100 bp左右，完全滿足證明待測樣品是否為SBVS基因序列的確診要求，證明該方法具有很好的特異性。

3 討 論

SBV主要感染綿羊、牛(包括野牛)和山羊等反芻動物[7]，主要經蠓等吸血昆蟲叮咬傳播[8]，成年牲畜感染后表現為發熱、腹瀉、乏力等癥狀，產奶量降低；而懷孕期動物感染后往往導致流產、早產和死胎，新生幼畜發生AHS[9-10]，與赤羽病具有相似的臨床癥狀[11]。該病自2011年底發現以來，不斷有新的疫情報告，截止目前已在二十幾個國家發生[12]。中國目前尚無相關疫情，但隨著國際交流的進一步深入，該病有傳入的風險，因此急需建立必要的檢測技術。

焦磷酸測序技術是1985年發展起來的一種能夠通過對基因序列測定實現檢測和確診的新型檢測技術，具有高通量、快速、敏感等特點[13]，其基本原理是設計帶有生物素標記的擴增引物，通過PCR反應生成含有生物素標記的目的基因片段，然后制備測序單鏈模板。將待測單鏈模板與測序引物雜交結合，放入PSQTM96MD System中進行測序反應。與普通RT-PCR和real-time RT-PCR等檢測技術相比，該技術無需將PCR產物送交公司測序以便確診，從而大大減少了病原確診時間。同時，該項技術也有嚴格的應用要求，首先片段不能太長，最好在100～200 bp；其次該項技術能準確測出的序列較短，需要待測核酸的特異性變異區域比較集中，同時在該變異區域前面或后面的序列高度保守，以便于設計擴增和測序引物。

布尼病毒科的成員通常利用S基因建立核酸檢測方法，如A.A.Chengula等建立了RVFS基因分子生物學檢測方法并進行了應用[13]，Y.Stram等建立了赤羽病和艾諾病毒的RT-PCR檢測方法[14]。本研究通過對GenBank中發表的布尼病毒科十余種病毒千余條S基因序列的比對分析，找出S基因67—233區域符合焦磷酸測序設計要求，S片段67—80 bp、217—233 bp區域在布尼病毒科中為高度保守區域，可以設計上下游擴增引物，提高方法擴增環節的敏感性；119—134 bp區域高度保守，用于設計正向和逆向測序引物，而79—118和135—181 bp區域在布尼病毒中高度變異，測出該區域的核酸序列即可確定待測病原為何種病毒。

總之，本研究所建立的SBV焦磷酸測序方法準確性高、重復性和穩定性好、特異性強等優點，為SBV的快速檢測和確診提供了一種可行方法，為防止施馬倫貝格病毒病傳入中國奠定了防控基礎。

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(編輯 白永平)

Establishment of Detection and Identification Method for Schmallenberg Virus by Pyrosequencing

ZHANG Yong-qiang，WU Xiao-dong，ZHAO Yong-gang，WANG Zhi-liang*

(ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032,China)

The aim of the present study was to establish a pyrosequencing method targetingSgene for detection and identification of schmallenberg virus (SBV).In alignment with published more than 10 virusesSgene sequences which belong to Bunyaviridae and are highly homogenous with SBV.Adaptive sequence for pyrosequencing was synthesized andinvitrotranscripted to cRNA as the RT-PCR templates.After RT-PCR reaction，the products were detected with forward and reverse pyrosequencing and identified by genomic alignment.Results showed that the RT-PCR products were 166 bp.The sensitivity of the method that the minimum copies could be detected was 104 copies.The specificity that sequencing length by pyrosequencing was around 100 bp which could make a definite diagnosis for SBV.The results presented here demonstrate that the detection and identification method for SBV by pyrosequencing was established.The method can be used in fast diagnosis for SBV.

pyrosequencing；schmallenberg virus;Sgene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.022

2014-05-26

現代農業產業技術體系(奶牛)(NYCYTX-0305)

張永強(1977- )，男，山東鄒平人，博士，助理研究員，主要從事病毒分子生物學研究，Tel：0532-87839922，E-mail:zhangyq_l@163.com

*通信作者：王志亮(1966-)，研究員，博士生導師，E-mail：zlwang111@163.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)01-0174-05