拉莫三嗪及L-硝基精氨酸對顳葉癲癇一氧化氮合酶活性、一氧化氮含量及nNOS陽性神經元形態結構的影響

李猛猛，尹遜河，邱建華，王憲龍，李 囡

(山東農業大學動物科技學院，泰安 271018)

拉莫三嗪及L-硝基精氨酸對顳葉癲癇一氧化氮合酶活性、一氧化氮含量及nNOS陽性神經元形態結構的影響

李猛猛，尹遜河*，邱建華，王憲龍，李 囡

(山東農業大學動物科技學院，泰安 271018)

通過測得家兔顳葉癲癇模型中一氧化氮合酶(NOS)的活性和一氧化氮(NO)的含量，研究L-NNA和拉莫三嗪對其含量變化的影響，探討NO在顳葉癲癇中的發作機制及這兩種藥物對腦部神經元的保護作用。選取2.0～2.5 kg健康哈白兔60只，隨機分為正常對照組、癲癇模型組、拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組，應用硝酸還原法測定癲癇發作后不同時間腦組織中海馬及顳葉NO的含量及NOS的活性。結果顯示：發現模型組腦海馬及顳葉內NOS 的活性從6 h開始迅速升高，1 d達到峰值，隨后逐漸降低，7 d后基本恢復正常水平，但仍高于其他各組(P<0.05)。L-NNA治療組和拉莫三嗪治療組在各時間點極顯著或顯著低于模型組(P<0.01或P<0.05)，L-NNA在6 h～1 d時對NOS的降低程度顯著好于拉莫三嗪組(P<0.05)。NO的變化規律與NOS變化規律基本一致且成正相關；利用SABC免疫組化染色檢測腦海馬內神經性NOS(nNOS)陽性神經元，發現模型組海馬內CA3區nNOS陽性神經元密度增加，胞質著色加深，胞體的截面積和突起變??；拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組的神經元密度有所降低，胞體的截面積和突起長度顯著變大(P<0.05)。結果顯示：NO參與了顳葉癲癇發作的始動過程，高濃度的NO對神經元有損傷作用；L-NNA和新型治療藥拉莫三嗪能明顯抑制癲癇發作后NO的濃度，對腦部神經元有一定的保護作用，從而對癲癇發作有較好的治療作用。

L-硝基精氨酸； 癲癇；海馬；一氧化氮；拉莫三嗪

顳葉癲癇(tempora lobe epilepsy，TLE)是常見的難治性癲癇，其發病機制及病因復雜，也是近十年有關難治性癲癇研究的熱點[1]。氯化鋰-匹羅卡品(LiCl—PILO)誘導的癲癇模型，在癲癇持續狀態下行為、病理等特性極其相似，成功的復制了人類顳葉癲癇發作。其主要病變表現為海馬組織神經元缺失，星型膠質細胞增生以及苔蘚纖維發芽，因而廣泛應用于國內外的癲癇研究中。

NO是一種生物信使分子，由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide Synthase，NOS)作用下生成，其含量與NOS的活性呈正相關[2]。一氧化氮合酶在腦部有神經元型(nNOS)、誘導型(iNOS)和內皮型(eNOS)3型。一氧化氮(NO)是兼有細胞內和細胞間信使和神經傳遞作用的氣體物質，它既具有通過多種途徑傳遞神經元信息，調節腦血流量，保護神經元的功能，在過量情況下又有廣泛的細胞毒作用。有研究表明，在各種腦病時，由于Ca2+大量內流，通過鈣調蛋白(CaM)激活iNOS，引起NO合成增加，大量的NO反過來又加重腦神經元損傷[3]。

拉莫三嗪[4](lamotrigine，LTG)因其控制發作效果較好，對認知損傷較輕，廣泛應用于難治性癲癇的治療。LTG的抗癲癇機制包括抑制電壓依賴性鈉通道，穩定細胞膜防止異常放電，抑制突觸前膜谷氨酸鹽釋放等[4]，但它是否抑制NOS的活性，減少NO的產生，從而對腦神經元發揮保護作用，目前尚未見報道?，F在，NOS抑制劑已開始用于醫療事業，應用NOS選擇性抑制劑(L-NNA)將成為一種新的神經保護方法，但在抗癲癇藥物的研究應用中未見有相關報道。作者采用氯化鋰-匹羅卡品誘導的兔顳葉癲癇模型，通過測得顳葉及海馬中NOS活性和NO含量的變化，揭示其變化規律，探討拉莫三嗪和L-NNA對癲癇的神經保護作用及機制，為癲癇藥物的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 3月齡健康哈白兔60只，體重2.0～2.5 kg，雌雄各半，購自山東省泰安市北集坡種兔場，兔接種免疫適應1周后開始試驗。

1.1.2 主要儀器、試劑與藥物 UV-2800A型紫外可見光分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)，一氧化氮測試盒(硝酸還原酶法)、一氧化氮合酶活性測試盒(分型)、考馬斯亮藍測試盒，均購自南京建成生物工程研究所；拉莫三嗪(LTG)購自英國葛蘭素史克投資有限公司；L-硝基精氨酸(L-NNA)、匹羅卡品(PILO)、氯化鋰(LiCl)購自Sigma公司；nNOS一抗、SABC試劑盒、DAB顯色試劑均購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 癲癇模型制作及動物分組

1.2.1 匹羅卡品模型的制作 健康哈白兔腹腔注射氯化鋰(LiCl)125 mg·kg-1， 18～24 h后注射阿托品1 mg·kg-1，30 min后腹腔注射匹羅卡品(PILO)，匹羅卡品的首劑量為20 mg·kg-1，若無癲癇性發作或發作未達到 Racine制定的癲癇性發作標準Ⅲ～Ⅴ級者，每隔30 min可重復腹腔注射匹羅卡品 10 mg·(kg·次)-1，直至出現癲癇性發作。發作程度按R.J.Racine[5]制定的標準進行分級，達到Ⅲ～Ⅴ級的兔進入癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)，歸于模型成功組；未達到Ⅲ～Ⅴ級的兔繼續注射 PILO 直至次數達到 6 次，其間達Ⅲ級以上的動物也歸到模型成功組；6 次后仍未達到標準的淘汰。癲癇模型成功后從第一次大發作開始 SE 50 min以上者，以10%水合氯醛 3 mL·kg-1終止。對試驗用兔給予正常飼養，室溫控制在25 ℃左右。造模成功后24 h內給藥(劑量參照治療方法)。

R.J.Racine[5]的等級標準：0級:無驚厥；Ⅰ級:面肌抽動、咀嚼；Ⅱ級:面部陣攣伴節律性點頭；Ⅲ級:面部陣攣、節律性點頭、前肢陣攣；Ⅳ級:前肢陣攣、后肢站立；Ⅴ級:失平衡、跌倒、四肢抽動、全身陣攣。1.2.2 分組及藥物治療方法 將試驗用兔分為正常對照組、癲癇模型組、 癲癇拉莫三嗪治療組、癲癇L-NNA治療組，每組14只。拉莫三嗪治療組于造模成功后每天9：00給予拉莫三嗪13 mg·kg-1灌胃；L-NNA治療組每天早晨9:00按照20 mg·kg-1L-NNA懸濁液進行灌胃治療，直到宰殺；正常對照組以0.9%的生理鹽水代替阿托品、氯化鋰和匹羅卡品進行腹腔注射，用 100 mg·kg-1生理鹽水代替藥物灌胃，其他條件與上述條件一致。

1.3 腦組織取材及處理

各組各時間點行頸總動脈放血處死，一部分迅速取出完整腦，取海馬及顳葉立即放入4%的多聚甲醛固定液中，以備SABC免疫組織化學染色及HE染色；另一部分迅速取出完整腦組織，取海馬及顳葉低溫研磨后加冰生理鹽水制備10%的腦組織勻漿，4 ℃下3 500 r·min-1離心10 min，取上清液于-20 ℃保存待測。

1.4 一氧化氮含量和NOS活性的測定

采用南京建成生物工程研究所NO測試盒(硝酸還原酶法)和NOS活性試劑盒(分型)，應用UV-2800型分光光度計測定海馬及顳葉腦組織中 NO含量及NOS的活性。

1.5 SABC免疫組織化學染色

參照武漢博士德生物工程公司SABC免疫組化試劑盒說明書進行染色。

1.6 切片觀察、測量

每個樣本取10張切片，在Olympus顯微鏡下觀察nNOS陽性神經元的形態、結構，并用網形和尺形測微尺計數、測量nNOS陽性神經元的密度、胞體截面積、第一級突起數及最長突起長度。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組家兔海馬及顳葉NOS活性

從圖1可看出，模型組海馬及顳葉中NOS的活性比正常對照組在各時間點均極顯著或顯著升高(P<0.01或P<0.05)，NOS的活性從6h開始迅速升高，1d達到峰值，隨后逐漸降低，7d后基本恢復正常水平，但仍高于其他各組(P<0.05)。拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組均顯著低于模型組(P<0.05)，在6h～7d內顯著或極顯著高于正常對照組(P<0.01或P<0.05)，在其他時間差異不顯著(P>0.05)。拉莫三嗪治療組與L-NNA治療組相比，在6h～1d前者顯著高于后者(P<0.05)，從3d開始兩組之間的差異不顯著(P>0.05)。

圖1 NOS活性在各組兔海馬和顳葉中的變化Fig.1 The change of NOS activity in hippocampus and temporal lobe of the four group rabbits

2.2 各組家兔海馬及顳葉NO含量

從圖2可看出，顳葉癲癇模型組海馬及顳葉腦組織NO含量于6 h后迅速升高，在1 d達到峰值，2～3 d含量有所降低，7 d后含量仍高于正常對照組，但差異不顯著(P>0.05)，與NOS活性的變化規律基本一致。與顳葉癲癇模型組相比，L-NNA治療組和拉莫三嗪治療組NO含量在6 h～3 d各時間點均顯著或及顯著降低(P<0.01或P<0.05)，7 d后差異不顯著(P>0.05)。L-NNA治療組在6 h～1 d NO含量顯著低于拉莫三嗪組(P<0.05)，從3 d開始兩者之間的差異不顯著(P>0.05)。從圖2中還知，前期L-NNA治療組比拉莫三嗪治療組對NO的降低程度大。

圖2 NO的含量在各組兔海馬和顳葉中的變化Fig.2 The changes of NO content of hippocampus and temporal lobe at the four groups of rabbit

2.3 各組家兔海馬nNOS陽性神經元的變化

經SABC免疫組織化學檢測(圖3)可知：正常對照組nNOS陽性神經元主要散布在齒狀回和海馬的分子層及多形層，錐體細胞層大部分未著色，只有較少部分呈陽性反應。海馬的CA3區著色明顯。陽性細胞輪廓清晰，細胞體大且染色深，突起多而長。胞體形態主要有錐體形和圓形2種。免疫反應產物呈棕褐色，主要位于細胞質內，染色均勻，細胞核不著色。

模型組與正常對照組相比，海馬CA3區nNOS陽性神經元密度增加，胞體的截面積變小，突起的長度和第一級突起數量減小，二者差異顯著(P<0.05)；拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組與模型組相比，陽性神經元密度顯著降低(P<0.05)，胞體截面積增大，突起的長度與第一突起的數量增加。兩個治療組相比陽性神經元密度L-NNA組顯著低于拉莫三嗪組(P<0.05)，其他指標差異不顯著(P>0.05)。

A.癲癇模型組10 d CA3區 nNOS陽性神經元的分布；B.拉莫三嗪治療組10 d CA3區nNOS陽性神經元的分布；C.L-NNA治療組10 d CA3區nNOS陽性神經元的分布；黑色箭頭表示nNOS陽性神經元A.The distribution of nNOS positive neurons in the epilepsy after 10 days in CA3 region of hippocampus；B.The distribution of nNOS positive neurons in the treatment group of lamotrigine in CA3 region of hippocampus；C.The distribution of nNOS positive neurons in the treatment group of L-NNA in CA3 region of hippocampus圖3 兔顳葉癲癇中CA3區nNOS 陽性神經元的分布(比例尺：50 μm)Fig.3 The distribution of Nnos positive neurons in CA3 region of hippocampus in the temporal lobe epilepsy rabbits (Bar=50 μm)

3 討 論

3.1 顳葉癲癇不同時間NOS活性、nNOS陽性神經元及NO含量的變化

癲癇發作后各組NO的含量變化與NOS的活性變化規律相一致，且成正相關。在癲癇發作后6 h血清中NO的含量迅速升高，2～3 d含量有所降低，但仍明顯高于正常對照組，7 d后則基本恢復正常。NO的這種含量變化與張映琦等[6]的研究結果相一致，說明在NOS作用下產生的NO參與了癲癇發作的始動過程。拉莫三嗪治療組和L-NNA治療組在各時間點NOS的活性及NO含量與模型組相比顯著降低(P<0.05)，免疫組織化學也顯示，海馬CA3區nNOS陽性神經元密度顯著降低，胞體截面積增大，突起的長度與第一級突起的數量增加，這些與姚君茹等[7]在大鼠海馬的研究和施溯筠等[8]測得小鼠血清的結果相類似。說明這兩種藥物能降低海馬內NOS的活性，減少NO的產生量，從而減輕了癲癇發作后過量的NO導致的神經毒性作用，具有保護腦神經元的作用。

3.2 NO參與顳葉癲癇機制

NO是在NOS的催化下由L-Arg生成，NOS在腦內廣泛存在。NO屬于一種自由基，分子中有一個未配對電子，容易與氧、超氧化物自由基發生反應，很快被氧化成硝酸和亞硝酸鹽而失去生物活性[9]。NO 的產生過程與N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDAR)有密切的關系。有研究[10]認為NO不僅通過NMDAR介導谷氨酸的神經傳遞，而且當NO大量產生、細胞內鈣超載時，還介導著谷氨酸的神經毒性作用導致細胞死亡。谷氨酸(Glu)與NMDA受體結合可引起Ca2+內流，在癲癇發病機制中起重要作用[11]。在正常生理條件下NO失去其不成對電子時形成氧化型亞硝酸離子(NO+)，它能與NMDA受體結合氧化還原調節部位的巰基反應，使其亞硝酸化而形成二硫鍵，這一作用既調節了NMDA受體調控的離子通道，避免了細胞內Ca2+超載所致的毒性，也防止了NO與超氧陰離子反應所致的神經毒性作用。

而NO的大量產生使得細胞內鈣超載，過量的鈣離子與鈣調蛋白結合，激活iNOS進而使NO合成增加，氧自由基也會隨著Ca2+的升高而增多。病理狀態下NO易得到一個電子時形成還原型的NO-，能夠與超氧陰離子迅速反應，生成過氧化亞硝基陰離子(ONOO-)。ONOO-質子化后進一步生成過氧化亞硝酸，并在酸性環境中進一步分解成具有很強毒性的羥自由基及二氧化氮自由基，進而導致膜功能失調，影響膜離子通道，從而引起膜的電生理紊亂而出現癲癇發作[12]。

3.3 匹羅卡品誘導的顳葉癲癇機制

研究表明，匹羅卡品致癲癇模型中可導致海馬區的特異性損傷，表現為海馬神經細胞損失、星形膠質細胞增生，海馬齒狀回和CA3區苔蘚纖維發芽，這些神經網絡的改變導致神經興奮異常通路成為癲癇晚期的病變基礎。神經元是電興奮的主體，匹羅卡品致癲癇形成后，海馬的門區和CA3區以γ-氨基丁酸(GABA)為主的抑制性中間神經元減少，興奮性的齒狀回顆粒細胞增多，使得興奮-抑制平衡破壞，進而促成癲癇發作[13]。同時癲癇發病機制也與星形膠質細胞與神經元之間建立的信號網絡有關，癲癇使得信息交流抑制影響了突觸的調節功能。星形膠質細胞還參與細胞外離子和神經遞質的調節以及分泌細胞外基質分子和生長因子，后兩者影響神經元的存活以及軸突、樹突的出芽，與癲癇時興奮性回路的形成和反復有關[14]。

苔蘚纖維出芽是人類顳葉癲癇的典型病理學特征[15]。海馬齒狀回顆粒細胞的軸突稱為苔蘚纖維(MF)， 苔蘚纖維與齒狀回(DG)門區中間神經元及CA3 區錐體細胞的樹突可以建立神經聯系，進而傳導神經沖動。癲癇發作CA3區錐體細胞損傷，導致苔蘚纖維與靶細胞斷離，阻礙了苔蘚纖維正常出芽和與顆粒細胞的樹突建立正常的突觸聯系。 李國良等[16]在匹羅卡品誘導的顳葉癲癇的研究中也發現，在SE后 3～7 d時，海馬齒狀回內分子層未見明顯的苔蘚纖維出芽，從第15天開始，海馬齒狀回內分子層有明顯的苔蘚纖維出芽，到第30天及第60天時出芽更加明顯，而對照組卻未見苔蘚纖維出芽。

3.4 拉莫三嗪和NOS抑制劑L-NNA在顳葉癲癇中的作用

拉莫三嗪(LTG)是一種新型抗癲藥，其作用機制為:抑制電壓依賴式Ha型鈉通道，穩定細胞膜防止異常放電的產生，抑制前膜谷氨酸鹽釋放[17]。本次試驗還得知，拉莫三嗪治療組顯著降低了癲癇模型腦組織中NOS的活性和NO含量，使海馬CA3區nNOS陽性神經元胞體截面積增大，突起的長度與第一級突起的數量增加，對海馬神經元有保護作用。

L-NNA是一種NOS抑制劑，它可抑制腦組織內的NOS的活性，使NO的合成量減少，進而減輕了癲癇發作后由于NO的濃度升高而導致的神經毒性作用，具有保護腦神經元的作用。

4 結 論

NO參與了癲癇發作的過程，高濃度的NO對腦部神經元有神經毒性作用。由于NO的含量與NOS活性呈正相關，所以NO和NOS在癲癇發作中發揮了重要作用。拉莫三嗪在中后期能顯著降低癲癇發作后腦海馬及顳葉的NOS活性及NO含量，減輕高濃度的NO對海馬神經元的神經毒性作用，從而發揮保護作用。NOS抑制劑L-NNA能夠直接抑制NOS的活性，進而降低腦部NO的含量，從而降低了癲癇發作后NO對腦部的神經毒性作用，具有保護腦神經元的作用。因此，拉莫三嗪和L-NNA均能用作癲癇發作后的治療藥物，然而用藥的劑量、劑型和療程等需作進一步研究。

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(編輯 白永平)

The Influence of Lamotrigine and L-NNA on the Content of Nitric Oxide and the Activity Nitric Oxide Synthase and nNOS Positive Neurons Morphology in the Temporal Lobe Epilepsy Rabbit Induced by Pilocarpine

LI Meng-meng,YIN Xun-he*，QIU Jian-hua，WANG Xian-long，LI Nan

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

By measuring the content of Nitric Oxide and the Activity of Nitric Oxide synthase， this experiment was conducted to study the influence of lamotrigine and L-NNA on the change and investigate the mechanism of the action of NO on the cerebral hemorrhageand the protective effect of those two pharmaceuticals in the temporal lobe epilepsy rabbit induced by pilocarpine.Sixty healthy Haerbin rabbits，2.0-2.5 kg，were divided into the group of physiological saline，the epilepsy model group，and the treatment group of lamotrigine and L-NNA.Nitric Oxide (NO) content and the activity of NOS in the hippocampus and temporal lobe after epilepsy were determined by using nitrate enzyme reduction method.We found that the activity of NOS increased at 6 hours after epilpsy， and increased to the highest at 1 day， then decreased gradually and basically returned to normal level after 7 days，but it was still higher significantly than that of other groups (P<0.05).The level of NOS in two therapy groups between L-NNA and lamotrigine were lower than that in model group at every time extremely notable difference or notable difference (P<0.01 orP<0.05)，and the decreasing level of NOS in L-NNA group was lower than that of group of lamotrigine between 6 h to 1 day (P<0.05).The change of the NO content and the activity of NOS were accordant primitively and directly correlation.SABC immunohistochemical method was used to detect the neuronal NOS positive neurons in hippocampus，the density of neuronal NOS positive neurons in hippocampus’ CA3 region increased，and the cytoplasm stained darker， soma-sectional area and the length of tuber became smaller; After the treatment of lamotrigine and L-NNA，the density of neuron decreased，and the soma-sectional area and the length of tuber became significant longer (P<0.05).The results indicate that NO is involved in the initiating process of the temporal lobe seizures，and the high concentration of NO can damage the neurons；L-NNA and the novel therapeutic drug lamotrigine can inhibit the concentration of NO after epilepsy seizures，which have a better therapeutic effect on the epilepsy seizures.

N-nitro-L-arginine；epilepsy；hippocampus；nitric oxide(NO)；lamotrigine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.018

2014-05-23

國家自然科學基金項目(30671498)；山東省自然科學基金項目(Y2003D04)

李猛猛(1988-)，女，山東淄博人，碩士，主要從事神經解剖與神經生物學研究，E-mail：limengmengshannong@126.com

*通信作者：尹遜河(1955-)，教授，E-mail：xhyin@sdau.edu.cn，xhyin@163.com

R742.1

A

0366-6964(2015)01-0138-06