15個雞群體IL-2基因的遺傳變異分析

趙會靜，張敬敬，文 杰，劉冉冉，鄭麥青，李慶賀，馬月輝，趙桂蘋

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

15個雞群體IL-2基因的遺傳變異分析

趙會靜，張敬敬，文 杰，劉冉冉，鄭麥青，李慶賀，馬月輝，趙桂蘋*

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

為了深入研究雞IL-2基因的多態性及為雞抗病育種提供理論依據，本研究以IL-2基因為研究對象，采用直接測序的方法對11個中國地方雞品種、3個引進雞品種和1個培育雞品種共448個個體該基因的遺傳變異進行了分析。通過DNA池和直接測序技術，共發現了13個突變位點。對所有個體的一段包含5個SNPs的區域進行分析，發現不同等位基因在15個雞群體間分布存在顯著差異，表明不同品種間IL-2基因具有豐富的遺傳變異資源，可為抗病基因的選擇提供素材；群體遺傳學指標分析表明，H系京星黃雞的遺傳多樣性最低，這與其品種形成過程一致，其他品種多樣性差異不大；單倍型分析共發現23種單倍型，其中H1(CAACG)、H2(CAATT)、H4(TGTTG)、H9(TGTTG)、H11(TATCG)和H16(CATCG)為中國地方雞品種特有或優勢單倍型，可能與抗病能力相關。

雞；IL-2基因；遺傳多樣性

一直以來，疫病是養雞業的第一大天敵，尤其是一些烈性傳染病，嚴重制約著家禽業的發展。目前我國禽病有80余種，其中傳染病占75%左右，每年造成的經濟損失十分巨大[1]。在現今集約化程度提高、飼養條件改變以及禽類疾病復雜化的背景下，家禽遺傳育種者一直在不斷的探索減少這種經濟損失的途徑。其中，選育抗病能力強的雞品種、對雞抗病力的遺傳規律進行深入的研究成為從根本上解決問題的一個重要手段。

白細胞介素2(Interleukin-2，IL-2)是由T淋巴細胞分泌的一種細胞因子，具有促進T、B淋巴細胞增殖和分化、增強單核細胞核NK細胞的殺傷活性、誘導淋巴因子激活殺傷細胞活性、促進其他細胞因子釋放的功能，在機體的免疫應答系統中具有重要的調節作用[2]。雞IL-2被認為是影響雞免疫系統的發生及免疫調節的重要因子之一[3]。Q.L.Liang等[4]發現雞胚成纖維細胞受到H5N1病毒感染后，IL-2 基因表達升高，并在整個感染過程中維持高表達狀態。Y.C.Wang等[5]報道在25 mg·mL-1的玉米赤霉烯酮感染48 h，與對照組相比雞脾淋巴細胞的IL-2 基因表達水平提高了4倍。 G.D.Raj等[6]研究發現，商品化雞在感染傳染性法氏囊病毒后，脾IL-2 基因的表達水平顯著提高。此外，IL-2 可作為免疫治療劑和免疫佐劑。李宏梅[7]用法氏囊疫苗聯合應用對雞細胞免疫水平的影響進行研究，結果表明，雞IL-2 能夠提高疫苗的免疫效果。同時，利用基因重組的方法將IL-2 基因和某種病毒基因重組獲得IL-2 抗原重組蛋白，是研制新一代基因工程疫苗的有效途徑。亓麗紅等[8]構建了雞IL-2 基因與新城疫病毒蛋白的重組質粒并用此質粒感染雞胚胎成纖維細胞，結果表明，該重組質?？商岣呒毎目贵w反應能力。H.Song等[9]將雞IL-2 基因和艾美耳球蟲遮光體抗原SO7基因分別插入pVAX1載體中制備疫苗，并用此疫苗免疫雞，發現，IL-2 基因的表達能夠明顯增強艾美球蟲疫苗的免疫原性。

對雞IL-2基因序列多態性的研究也已經逐步開展。R.S.Sundick等[10]首次克隆了雞IL-2基因mRNA序列，發現其mRNA全長747 bp，推測編碼143個氨基酸。P.Kaiser等[11]采用RACE技術獲得雞IL-2全基因序列，對其基因組結構分析發現，該基因位于第4號染色體上，由4個外顯子和3個內含子組成。此后，國內的眾多學者相繼克隆出了固始雞、蕭山雞、白羽烏骨雞等十多個地方品種的IL-2基因的mRNA序列，與R.S.Sundick等[10]公布的雞IL-2基因序列的相似性均在97%以上，證明了雞IL-2 cDNA的保守性，同時一些位于編碼區的SNPs位點也被確定[12-14]。R.Tohidi等[15]研究表明，雞IL-2 基因的變異與盲腸及脾中腸炎沙門氏菌感染顯著相關，為雞IL-2 基因在免疫性狀中的作用提供了有力的證據。這些研究大多數只是關注少數個體的mRNA序列，而忽略了內含子上的變異以及群體水平的研究。本研究以11個中國地方雞品種、3個引進品種和1個培育品種為研究對象，采用DNA池技術和直接測序方法對雞IL-2基因的SNP進行篩選，然后選擇其中遺傳變異豐富的一端DNA區域，對該區域內的5個SNPs位點的基因型、雜合度、多態信息含量等群體遺傳學屬性以及不同群體單倍型的分布情況進行分析，并尋找可能與雞抗病性相關的單倍型，為更加深刻的了解雞DNA多樣性與經濟性狀多樣性之間的關系奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以11個中國地方品種、3個引進品種和1個培育品種共448個樣品為研究對象。其中地方品種包括狼山雞(30只)、仙居雞(30只)、白耳雞(30只)、茶花雞(30只)、溧陽雞(30只)、河南斗雞(30只)、烏骨雞(30只)、油雞(30只)、絲羽烏骨雞(30只)、壩上長尾雞(29只)、河北柴雞(22只)，引進品種包括隱性白羽肉雞(30只)、科寶雞(29只)、白來航雞(30只)，培育品種為京星黃雞(38只)。以上樣本來自于中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所和江蘇家禽研究所。每只雞采集翅下靜脈血液1.5 mL，加0.3 mL抗凝劑ACD，置于2 mL離心管中-20 ℃保存。

1.2 基因組DNA提取

參考《分子克隆(第3版)》的方法提取基因組DNA[16]，經瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其純度和濃度，用滅菌超純水稀釋為50 ng·μL-1，4 ℃保存備用。

1.3 SNP檢測

對每個雞品種制備2個DNA池作為模板，每個池隨機混合10個樣本的DNA，參考雞IL-2全基因組DNA序列(GenBank登錄號：AJ224516)，利用Premier 5軟件設計覆蓋全基因序列的4對引物(表1)，對每個DNA池進行PCR擴增用以篩選雞IL-2基因的SNP位點。由于第3對引物擴增序列多態性最為豐富(包含5個SNPs)，用該對引物對15個群體共448個樣本進行PCR擴增，進一步研究不同群體間IL-2基因的遺傳多樣差異。

表1 引物序列和擴增產物

Table 1 Information of primers sequences and PCR production

引物名稱Name序列Sequence起始位置/bpStartposition片段長度/bpProductsize退火溫度/℃AnnealingtemperatureIL-2-1F:GGCATTAAGACATACGGGR:AAATCAAAGGCAGAAGTG上游調控區-67～1126119352IL-2-2F:GTTTTCCTCTATCAGTTCTTTR:TTTTACAGTGGCAATCTTC806～2234142950IL-2-3F:GTACCCATACTCAAGGTCR:TGCATTCACTTCCGGTGT2048～3248120153IL-2-4F:CCTGGGAGAAGTGGTTACR:TGGTTTGGGATTCTTTCG2700～下游調控區92121155

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s， 35個循環；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。 PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測送公司測序。

1.4 統計分析

用Mega 4.0軟件分析DNA序列的變異位點，確定等位基因；用Excel計算等位基因頻率；用SPSS軟件對各群體等位基因頻率分布差異進行卡方檢驗；用Genepop軟件包對每個位點進行Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢測以及觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、有效等位基因數(NE)等群體遺傳學指標；用PIC_CALC軟件計算各位點的多態性信息含量(PIC)；用Phase 2.0軟件對研究個體進行單倍型分析。

2 結 果

2.1 DNA提取與PCR擴增

將所提取的每個樣品的基因組DNA用0.8%瓊脂糖凝膠檢測，DNA質量較好并且比較完整，能夠滿足后續試驗要求。用分光光度計對各基因組DNA進行定量檢測，并根據檢測結果將其濃度調整到50 ng·μL-1左右備用。利用所設計的4對引物，以制備的DNA池為模板進行PCR擴增，產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測都有較好的效果，與預計的擴增片段大小一致，且沒有非特異性擴增條帶出現(圖1)，各位點的PCR產物適合進行測序分析。

1～4.IL-2-1～IL-2-4擴增產物；M.DNA相對分子質量標準1-4．PCR products of IL-2-1-IL-2-4 primers；M.DNA marker圖1 IL-2基因4對引物的PCR擴增產物Fig.1 PCR products for 4 primers of IL-2

2.2IL-2基因SNP鑒定

結合DNA池和直接測序方法，在雞IL-2 基因上共檢測到13個SNPs，其位置信息、突變方式及基因結構上的分布見表2。其中SNP1、SNP2、SNP3、SNP8和SNP13位于外顯子上，其余SNPs位點位于內含子上。位于外顯子上的SNPs中，SNP1與SNP2為非同義突變，分別引起第27位丙氨酸突變為纈氨酸和第29位精氨酸突變為甘氨酸，另外3個SNPs(SNP3、SNP8和SNP13)為同義突變。就4對引物擴增序列上SNPs的分布密度而言，引物3包含5個突變位點，擴增序列多態性最為豐富，分別為SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10，表明該區域多態性最為豐富。因此，本研究接下來將重點關注引物3擴增區域在所有樣本中的遺傳變異情況。

表2 雞IL-2基因13個SNPs的信息

Table 2 The information of 13 SNPs of chickenIL-2 gene

項目ItemSNP1SNP2SNP3SNP4SNP5SNP6SNP7SNP8SNP9SNP10SNP11SNP12SNP13位置/bpPosition7337387941002100825672582279928532890299630913813突變MutationC/TA/GC/TT/CT/CC/TA/GT/AT/CG/TC/AG/TA/G分布DistributionExon1Exon1Exon1Intron2Intron2Intron2Intron2Exon3Intron3Intron3Intron3Intron3Exon4

位置信息參考序列GenBank登錄號：AJ224516

SNPs numbered in relation to DNA nucleotide positions(GenBank accession No.：AJ224516)

2.3 5個位點的等位基因頻率與H-W平衡檢測

用第3對引物對15個雞品種的448個樣品進行擴增，獲得所有個體5個SNPs(SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10)的基因型數據，并統計各群體各位點的等位基因頻率，結果如表2所示?？梢钥闯?，15個雞群體的5個位點都發生了突變。SNP1位點在除了狼山雞以外的其他品種中，T等位基因均為優勢等位基因，尤其是在京海黃雞、白耳雞、茶花雞和絲羽烏骨雞中，T等位基因占有絕對優勢，等位基因頻率均在90%以上；SNP2位點在各群體中的等位基因頻率與SNP1位點完全一致或接近，表明這2個位點在所有群體中可能都處于緊密連鎖狀態；SNP3位點在不同群體中基因型頻率分布不同，其中京海黃雞群體突變率最低，最小等位基因頻率(等位基因T)為0.118；SNP4位點的T等位基因在大多數雞群體為優勢等位基因，而在3個中國地方品種(白耳雞、烏骨雞和油雞)、1個引進品種(隱性白羽雞)和京海黃雞中，該等位基因頻率較C等位基因頻率低；SNP5位點在各群體中等位基因頻率與SNP4位點完全一致或接近，表明SNP4和SNP5位點在所有群體中可能都處于緊密連鎖狀態?？ǚ綑z驗表明，所有位點的2個等位基因在15個雞群體中分布有極顯著差異(表3)。同時，將15個雞群體按照品種來源歸為中國地方品種、引進品種和培育品種，進行卡方檢驗，結果表明所有位點的2個等位基因在這3個類群中的分布也有極顯著差異(表3)。但由于各位點優勢等位基因在3個雞群體中沒有明顯的分布規律，因而不能確定哪個等位基因可能與較強的免疫能力有關。

H-W平衡檢測表明，所有群體的5個位點都處于H-W平衡狀態(P>0.05)。

2.4 5個位點的群體遺傳學指標分析

表4展示了各個群體5個位點的觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、有效等位基因數(NE)和多態信息含量(PIC)等群體遺傳學參數的平均值?？梢钥闯?，烏骨雞的觀測雜合度最高，為0.553，而京星黃雞觀測雜合度最低,為0.195。比較而言，溧陽雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、壩上長尾雞、科寶雞和白來航雞觀察雜合度低于期望雜合度，表明群體中純合子個體較多；而其他群體觀察雜合度都接近期望雜合度，說明這些群體受外來選擇及近交等因素的影響較小。有效等位基因數(NE)是反映群體遺傳變異的一個重要指標[17]，結果表明，京星黃雞有效等位基因數接近1，表明該雞品種突變率較低，變異度小，而其他品種接近于2，表明這些群體5個位點的2個等位基因在群體內分布較為均勻；多態信息含量分析表明，京星黃雞處于低度多態(PIC<0.25)，而其他品種則為中度多態(0.25

2.5 單倍型分析

利用Phase 2.0軟件包對15個不同雞群體進行單倍型分析，共得到23種單倍型(表5)， 表明所研究雞群體豐富的多樣性。其中單倍型H9在群體中的頻率最高，為15.7%；而單倍型H20和H22在所有群體中頻率僅為0.1%。從表5中可以看出，頻率最高的單倍型H9，被8個中國地方雞群體共享，這8個雞群體分別為狼山雞、仙居雞、茶花雞、溧陽雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、壩上長尾雞和河北柴雞，而引進品種中，只在白來航雞群體中檢測到，培育品種中不存在該單倍型。單倍型H13被3個中國地方雞品種(白耳雞、油雞和壩上長尾雞)和2個引進品種(科寶雞和白來航雞)所共享；而單倍型H5在中國地方雞品種(狼山雞、仙居雞、茶花雞、溧陽雞和河北柴雞)、2個引進品種(隱性白羽雞和白來航雞)以及培育品種京海黃雞中都有分布。

表5 單倍型頻率

Table 5 Frequency of haplotypes

單倍型Haplotype位點Loci樣本數Samplenumber頻率FrequencyH1CAACG420.047H2CAATT240.027H3CATTT20.002H4CGACT290.032H5CGATG950.106H6TATCG210.023H7TATTT690.077H8TGTCG480.054H9TGTTG1410.157H10TGTCT700.078H11TATCG910.102H12CGACG280.031H13TGTTT960.107H14CAATG420.047H15CAACG440.049H16CATCG20.002H17TGACG20.002H18TATTG350.039H19CGATT80.009H20CATCG10.001H21CGTTG20.002H22TGATG10.001H23TAACT30.003

另外，從表6中可以看出，單倍型H1、H2、H3、H4、H6、H16、H17、H19、H20、H21為中國地方雞品種特有的單倍型，在引進品種和培育品種中不存在。其中，單倍型H1、H2、H4和H16均在4個及以上地方品種中檢測到；同時，單倍型H9和H11雖不是中國地方雞品種所特有，但其只在某個引進品種少數樣品中檢測到。因此，單倍型H1、H2、H4、H9、H11及H16很有可能與中國地方雞品種較強的免疫能力相關。而單倍型H22和H23為引進品種所特有，但單倍型頻率都很低。

3 討 論

P.Kaiser等[11]通過研究8個自交系的白來航雞，發現雞的IL-2基因中長為517 bp的啟動子區域的序列和它的4個外顯子均沒有變異。陳吉剛等[12]克隆了絲羽烏骨雞的IL-2 基因，與Kestrel、Obese和SC品系的來航雞相比發現，不同品系雞IL-2 其編碼氨基酸在15、28、30、32和 133位發生了改變。王彥彬等[13]克隆了固始雞IL-2基因的cDNA序列，與已發表的序列相比發現了2個核苷酸變異。黃溢泓等[14]克隆了廣西10個地方品種雞IL-2 基因的cDNA序列，發現不同品種雞編碼氨基酸在第60位、第127位、第132位、第138位、第192位、第204位、第256位和第457位發生改變。本研究在15個雞群體中共檢測到13個SNPs(表2)，表明雞IL-2的遺傳變異非常豐富，這是為了適應多樣化的生存環境經受的選擇作用的結果。而本研究檢測到的位于第27位(SNP1)和第29位(SNP2)氨基酸序列的兩個非同義突變位點在以往的研究中沒有報道過，因此，為雞IL-2 基因的研究提供了新的重要的遺傳變異資源。同時，本研究發現了8個位于雞IL-2 基因內含子上的突變位點。事實上，內含子具有促進或抑制基因表達[18-19]的作用，因此對基因功能有重要的影響。筆者前期通過比對GenBank上的2個雞的IL-2基因組DNA序列，發現內含子中存在插入缺失位點，該位點可以將這2個DNA序列劃分為2個分支[20]，也說明了對不同遺傳背景雞群IL-2基因內含子研究的必要性。另一方面，從群體水平上對雞IL-2基因的研究也尚未見報道。

基于以上背景，以15個雞群體的448個樣品為實驗對象，對所發現的IL-2 基因的包含5個SNPs位點(SNP6、SNP7、SNP8、SNP9和SNP10)的高變異區域的遺傳多樣性進行了研究。這5個突變位點中的2個位點位于內含子2上(SNP1和SNP2)，1個位點位于外顯子3上(SNP3)，另外2個位點位于內含子3上(SNP4和SNP5)(表2)。等位基因頻率分布結果顯示，除狼山雞以外，SNP1(T>C)和SNP2(G>A)位點在所有雞群體中優勢等位基因分布大致相同，可能是由于對狼山雞某一性狀的選育造成的這2個位點受到人工選擇的影響導致的，也有可能是品種形成之初等位基因的分布就是這樣的。而另外3個SNP位點在不同群體中等位基因頻率分布及優勢等位基因分布差異較大，反映了不同雞群生長環境和選育程度的不同。

表6 23種單倍型在15個群體中的分布

Table 6 The distribution of 23 haplotypes in 15 populations

單倍型Haplotype群體PopulationLSXJBECHLYHNDWGYJSYWGBSCWHBCYXBYKBBLHHH122000080011100000H2100606009200000H3200000000000000H41000061602220000H52170414000005220229H64013000300100000H715005000001190038H81605011004616404H9119026929002812140030H100507476244203260H1102011518200121148000H12041080000130605H13003000002808002640H1400700001304006120H1500301001604011360H16000200000000000H17000001000010000H180000002700100070H19000000800000000H20000000010000000H21000000000110000H22000000000001000H23000000000003000

雜合度、有效等位基因數、多態信息含量等群體遺傳學指標是衡量遺傳多樣性雞變異水平的指標。本研究發現15個群體5個位點的平均期望雜合度在0.177～0.481波動，其中壩上長尾雞的期望雜合度最高，而京星黃雞期望雜合度最低。雜合度越高說明品種的遺傳多樣性越豐富，相反，京星黃雞是用地方品種資源為育種素材，經世代閉鎖繁育形成的培育品種，有效群體及遺傳變異有限，遺傳血統狹窄，因此雜合度較低。另一方面，溧陽雞、河南斗雞、絲羽烏骨雞、壩上長尾雞、科寶雞和白來航雞觀察雜合度低于期望雜合度，表明群體中純合子個體較多，說明這些群體中存在一定程度的近交；還可能與長期對某一性狀進行選擇，造成整體遺傳背景趨向單一相關；也可能由于群體歷史因素如瓶頸效應或奠基者效應等造成的基因純合較多現象。另外，有效等位基因數和多態信息含量分析也證明了京星黃雞的突變率較低，2個指標在京星黃雞中分別為0.124和0.158。

SNP位點通過單倍域的形式遺傳給后代，單倍域內全部的SNP類型被稱為單倍型[21]。以往的研究表明，根據單倍型可以有效的鑒定可能與疾病相關的變異[22]。本研究在15個雞群體中共發現23種單倍型(表5)，其中京星黃雞僅含有H5、H7、H8、H12 4種單倍型，其他雞群體中出現的單倍型種類為5～14個不等，以壩上長尾雞最多，表明這些雞種較培育品種雞具有更廣闊的選育空間。同時，在地方品種雞特有的單倍型中，單倍型H1、H2、H4和H16為多個雞群所共享，而單倍型H9和H11只在某個引進品種的少數樣品中檢測到，其余全部分布在地方品種中(表6)。一般認為，地方雞群體在品種形成過程中人工選擇干預的強度較小，因此其適應自然環境的能力和抗逆性較強；而引進品種和培育品種在現代高強度的選擇選育過程中，對人工環境較為依賴，因而抗逆性稍差。因此，以上6種地方品種中優勢的單倍型(H1、H2、H4、H9、H11和H16)可能與疾病抵抗能力相關。

4 結 論

本試驗對IL-2基因的SNP進行了篩選并研究了5個SNPs位點在11個中國地方雞品種、3個引進雞品種和1個引進雞品種中基因頻率分布，以及各群體平均觀察雜合度、平均期望雜合度、平均有效等位基因數、平均多態信息含量等群體遺傳學指標，并對各個樣品的單倍型進行推導，研究單倍型在不同群體中的分布。筆者發現IL-2基因在不同雞群體中多樣性有明顯差異，可作為抗病基因素材，同時，H1(CAACG)、H2(CAATT)、H4(TGTTG)、H9(TGTTG)、H11(TATCG)和H16(CATCG)可能與疾病抵抗能力相關。

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(編輯 郭云雁)

Genetic Diversity ofIL-2 Gene in 15 Chicken Populations

ZHAO Hui-jing，ZHANG Jing-jing,WEN Jie,LIU Ran-ran, ZHENG Mai-qing,LI Qing-he,MA Yue-hui,ZHAO Gui-ping*

(InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

To deeply study the genetic diversity of chicken Interleukin 2 (IL-2) gene and provide a theoretic basis for the breeding for disease resistance，the genetic variation ofIL-2 were studied in 448 individuals from 11 Chinese native，3 introduced and one cultivated chicken breeds by DNA sequencing method in this study.A total of 13 SNPs were identified by using DNA-pooling and sequencing.The results of analysis for a genome region including 5 single nucleotide polymorphisms(SNPs) among all the individuals showed that the frequencies of different alleles differed significantly among 15 populations，suggestingIL-2 had abundant genetic variations and provided promising gene resource for disease resistance.Analysis of several population genetic indexes indicated that the Jingxing Yellow chicken had the lowest level of genetic diversity,which was consistent with its breed formation and little differences of genetic diversity were observed among other breeds.Analysis of haplotypes revealed a total of 23 hapltoyepes.Among them，H1(CAACG)，H2(CAATT)，H4(TGTTG)，H9(TGTTG)，H11(TATCG) and H16(CATCG) were unique or dominant in Chinese native chicken breeds，suggesting these haplotypes may be associated with the disease-resistant ability.

chicken；IL-2 gene；genetic diversity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.006

2014-06-09

中央級公益性科研院所基本科研業務費項目(2012cj-5)；中國農業科學院創新工程(ASTIP-IAS04)

趙會靜(1978-)，女，河北石家莊人，助理研究員，碩士，主要從事畜禽遺傳資源分析研究，Tel：010-62815891，E-mail：zhhj1998927@163.com

*通信作者：趙桂蘋，研究員，E-mail:zhaoguiping@caas.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)01-0041-09