牦牛Ihh基因組織表達分析、SNP檢測及其基因型組合與生產性狀的關聯分析

李天科，趙娟花，裴 杰，梁春年，郭 憲，秦 文，閻 萍*

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050;2.甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050； 3.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

牦牛Ihh基因組織表達分析、SNP檢測及其基因型組合與生產性狀的關聯分析

李天科1,2,3，趙娟花1,2，裴 杰1,2，梁春年1,2，郭 憲1,2，秦 文1,2,3，閻 萍1,2,3*

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050;2.甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050； 3.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

為了研究牦牛Ihh基因多態位點基因型組合與生產性狀間的相關性，發現與牦牛生產性狀相關的分子標記，同時進一步研究Ihh基因在牦牛和黃牛各個組織的分布和表達，試驗采用高分辨率熔解曲線分析技術(High resolution melting curve，HRM)進行基因型分型和統計等位基因頻率，同時，運用熒光定量PCR 分析Ihh基因在牦牛和黃牛不同器官的表達差異。試驗結果表明，Ihh基因在牦牛和黃牛的所有組織中均表達。然后采用SHEsis和PHASE軟件對Ihh基因多態位點進行配對連鎖不平衡和單倍型分析，采用SPSS17.0進行多態位點單倍型組合與生產性狀關聯性分析。結果檢測到牦牛Ihh基因外顯子3的 2個多態位點5855(C/T)和6383(G/A)。群體遺傳學分析顯示，2個多態位點均表現為高度多態(PIC>0.25)；χ2檢驗表明，甘南牦牛和大通牦牛群體在兩個突變位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)，而天祝牦牛在2個突變位點處未達到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)；多態位點配對連鎖不平衡分析發現，2個突變位點之間存在強連鎖平衡，有4種單倍型組合；基因型組合主要發現了3種。關聯分析表明，Ihh基因2個突變位點的3種基因型組合對牦牛體斜長、體高、胸圍、管圍和體重有顯著差異(P<0.05)，具有CTGA基因型組合的牦牛個體在體斜長、體高、胸圍、管圍和體重方面顯著高于CCGG和TTAA型(P<0.05)。因此，綜上推斷Ihh基因基因型組合與牦牛體斜長、體高、胸圍、管圍和體重存在相關性。

牦牛；Ihh基因；多態性；高分辨率熔解曲線；生產性狀；熒光定量；基因表達

骨骼是脊椎動物整個身體的支架，它們不僅保護鄰近器官，而且保證了機體的自由運動，它們的位置、形狀和尺寸基本決定了動物體格的大小。Indian hedgehog(印度豪豬因子，Ihh)是一個主要的骨發育調節因子，它對于協調軟骨細胞的增殖，軟骨細胞的分化和造骨細胞的分化等軟骨內骨發育過程是必須的[1-6]。研究發現，Ihh屬于一個非常保守的Hedgehog(Hh)分泌信號家族，在脊椎動物中存在其2種同源基因：Sonic Hedgehog(音速豪豬因子，Shh)和Desert Hedgehog(沙漠豪豬因子，Dhh)[7]。Hedgehog 信號最早是在 1980年從果蠅體內分離得到[8]， Hedgehog 的突變可使果蠅胚胎發育成毛團狀，酷似刺猬，故又被稱為刺猬基因[9]。

Ihh是細胞分泌的一種重要的多肽，由 2 個結構域組成：氨基端結構域(Hh-N)和羧基端結構域(Hh-C)，而且高度保守，具有獨特的生物活性[10-11]?；仡櫯cIhh基因相關的一些研究，可以了解到，Ihh在軟骨細胞和成骨細胞的增殖和分化中起調節作用[12]，進一步研究發現，Ihh在成骨細胞中也有表達[13]；K.K.Mak等[14-15]研究發現，Ihh 既可以單獨作用于軟骨分化，又可以協同PTHrP(甲狀旁腺素相關肽) 形成負反饋軸機制，從而維持骨的穩定生長。另也有研究表明，Ihh也在妊娠過程中介導胚胎的植入，敲除Ihh基因后小鼠不能受孕[16]。表達試驗表明，Ihh在小鼠妊娠第3.5～5.5天的子宮內膜腔上皮和腺上皮呈高水平表達[17]，且分泌期子宮內膜Ihh基因表達明顯高于增殖期[18]。Ihh基因突變方面的研究主要集中在人和小鼠上，Ihh基因突變的小鼠表現出個體矮小和典型的A1型短指/趾癥表型[19]；在人上Ihh的突變主要造成并趾和短指[20]，這都說明Ihh基因與指骨關節發育密切相關；另外，G.Lettre等研究發現Ihh基因的單核苷酸多態性也是人身高差異的主要因素[21]。

目前，對Ihh基因的相關研究主要集中在人和小鼠上，而在家畜方面，關于Ihh基因的研究尚未見報道，鑒于Ihh基因在人和小鼠中具有重要的功能，在牦牛中開展對該基因的相關研究就顯得尤為重要。鑒于此，筆者從分子水平入手，初步篩查出Ihh基因多態位點，并進行多態位點基因型組合與生產性狀的相關性分析，找到與生產性狀相關的DNA標記，為牦牛新品種的選育提供科學依據；同時，以熒光定量PCR法分析了Ihh基因在牦牛和黃牛不同器官的表達差異，為進一步研究Ihh基因在牦牛體內的分布、表達奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于表達譜分析的組織樣品采自于6頭成年甘南牦牛和6頭成年黃牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、小腸和胰，取樣后立即投入液氮中，回實驗室后-80 ℃保存。用GIBCO公司的TRIZOL Reagent 提取組織總RNA，用分光光度計測定其濃度，將RNA稀釋至1 μg·μL-1備用，cDNA第一鏈的合成參考TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行。

用于遺傳多樣性分析的全血樣品采自3個中國地方牦牛品種(包括6月齡的甘南牦牛200頭、6～9月齡的大通牦牛203頭和2～3歲的天祝牦牛208頭)，頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝(V(血液)∶V(ACD)=6∶1)，輕微震蕩混勻后，-20 ℃保存備用。利用Relax Gene血液基因組DNA提取系統(天根，北京)提取基因組DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，使用NANO DROP 2000(Thermo，美國)檢測提取的DNA濃度并抽取20 μL稀釋到18～22 ng·μL-1作為PCR擴增模板，其余母液保存于-80 ℃。實地測量4項體尺指標(體斜長、體高、胸圍、管圍)和體重。

1.2 組織表達分析

1.2.1 組織表達譜引物 根據NCBI網站中黃牛Ihh基因的 mRNA(登錄號：NM_001076870)，利用Pimer5設計定量PCR引物(表1)，內參引物選用文獻中牦牛GAPDH引物[22]，引物由TaKaRa公司合成。

表1Ihh基因定量分析引物信息

Table 1 Information of primer sequences for relative analysis within yakIhhgene

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm片段長度/bpLengthIhhF:CCAACTACAATCCAGACATCATCTTR:AGATGGCCAGCGAGTTCAG60.5102GAPDHF:CCACGAGAAGTATAACAACACCR:GTCATAAGTCCCTCCACGAT54.4120

1.2.2 熒光定量PCR 反應體系(10 μL)：2 μL RT產物，5 μL SYBR Green熒光染料，上下游引物各1 μL，1 μL ddH2O。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，退火溫度退火30 s，62 ℃ 30 s，40個循環；于60 ℃采集熒光，采用默認設置自動生成Ct值。采用2-△△Ct法[22-23]，用GAPDH作為內參基因對各樣本用實時定量PCR結果進行校正處理，并以胰腺表達量作為校正者，計算各樣本Ihh基因的相對表達水平。每個樣本3個重復，取平均值。

1.3 PCR擴增

1.3.1 SNP檢測 參考NCBI數據庫牛的Ihh基因(登錄號：NP_001070338)，并結合牦牛全基因組測序的序列，采用交叉重疊原理[24]設計4對引物對Ihh基因外顯子序列進行擴增(表2)，引物由上海生物工程股份有限公司合成。

PCR擴增體系(25 μL)：包括約20 ng·μL-1的基因組DNA 1 μL，10 pmol的上下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix(內含TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs等)(北京，天根)12.5 μL，滅菌超純水9.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，復性30 s(退火溫度見表2)，72 ℃延伸(時間見表2)，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

表2 鑒定牦牛Ihh基因突變位點所用引物信息表

Table 2 Information of primer sequences for scanning SNPs within yakIhhgene

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm片段長度/bpLength延伸時間/sTime擴增位置LocusIhh-1F:AAGGACAGGAGAACACCR:GGAGGCAGTCGGGTAGAGG54.334820外顯子1Ihh-2F:TACTGCGTGAGTTTGGATR:GCCTCTTCACCTTCTTGG59.065930外顯子2Ihh-3F:GGAATCCAAACTCCACCCAGR:CACAGCCGCAAAGCAAGA56.752530外顯子3Ihh-4F:TCTTGCTTTGCGGCTGTGR:GGGCTTTCCCTACTTATTC55.3125550外顯子3

1.3.2 DNA測序分析和HRM小片段法基因分型[24-25]PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根，北京)回收純化送往大連寶生工生物工程有限公司進行測序，測序結果通過DNASTAR軟件比對分析。針對所發現的多態位點，利用Light Scanner Primer Design Software(Idaho公司，美國)設計出用于HRM(High Resolution Melting，高分辨率熔解曲線)分析多態位點的引物(表3)，對試驗群體樣本進行基因型分析。合成1對高低溫內標[26](表4)對熔解曲線進行校正，提高分型的精確度。

HRM-PCR擴增體系(11 μL)：包括20 ng·μL-1的基因組DNA 1 μL，10 pmol的上下游引物各0.2 μL，2×Taq PCR MasterMix(內含TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs等)(北京，天根)5 μL，滅菌超純水3.6 μL，10×LC Green飽和染料(美國，Idaho)1 μL。HRM-PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，Tm(℃)(表3)退火20 s，72 ℃延伸20 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。

高低溫內標稀釋方法：1 OD內標單鏈加400 μL水，退火體系：飽和氯化鈉1 μL，內標互補雙鏈各1 μL，補水至10 μL，95 ℃水浴3 min，然后緩慢降至室溫。

HRM熒光信號采集：將稀釋好的高低溫內標各1 μL加入HRM-PCR產物單孔中，95 ℃變性30 s，放入Light Scanner 96(美國，Idaho)中收集熒光信號。

表3 HRM分析多態位點的引物信息表

Table 3 Information of primer sequences for genotyping mutations by HRM

檢測位點Loci引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm片段長度/bpLength5855(C/T)F:GCAGCTGTCTCCACGCACF:ACCACATCCTCCACCACC64.41126383(G/A)F:GTCCCAACCCAGCCAGCCF:GCAAGCCCACCCAAGAGG65.596

表4 高低溫內標序列信息表

Table 4 Information of low and high calibrator sequence

高低溫內標LowandhighcalibratorTm/℃內標序列(5'-3')CalibratorLow269.85GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-C3High287.92ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-C3

1.4 數據統計

各組織中表達量的差異用獨立樣本t檢驗進行分析。多態性根據群體遺傳學理論直接計算得到基因型和等位基因頻率，統計牦牛群體Ihh基因多態位點的純和度Ho、雜合度He、有效等位基因數Ne、多態信息含量PIC[27-29]，并進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。采用SPSS17.0軟件對Ihh基因多態性位點在不同牦牛群體中的基因型分布進行卡方檢測，考慮到品種、性別、環境和年齡因素的影響，采用固定模型分析基因型效應對生產性狀的影響。

固定模型：Yijklm=u+Gi+Sj+Ak+Bl+Em+εijklm。

式中，Yijklm為個體表型記錄，u為群體均值，Gi為標記基因型效應，Sj為性別因素，Ak為年齡因素，Bl為品種效應，Em為環境因素，εijklm為隨機誤差。

2 結 果

2.1 牦牛Ihh基因的組織表達譜分析

利用實時定量PCR對牦牛和黃牛Ihh基因在心、肌肉、小腸、肺、腎、肝、卵巢和胰各個組織的表達情況進行檢測，結果見圖1。Ihh基因在牦牛和黃牛所研究的組織中均表達，其中在牦牛肝中的表達量顯著高于黃牛(P<0.05)；在牦牛和黃牛的卵巢、肺、腎和胰組織中中度表達，在心、脾和肌肉組織中牦牛和黃牛表達量都相對低。

2.2 牦牛Ihh基因HRM方法的分型

通過DNA混合池對牦牛Ihh基因測序后，應用MEGA.5軟件對拼接得到的Ihh基因序列與黃牛序列進行比對，并結合測序峰圖可知，牦牛Ihh基因外顯子3上存在5855(C/T)和6383(G/A)的多態位點(圖2)，應用高分辨率熔解曲線對多態位點進行基因型分析，結果如圖3所示。

圖1 Ihh 基因在牦牛和黃牛不同組織器官的表達模式Fig.1 Transcript levels of Ihh gene by quantitative real-time PCR in cattle and yak

圖2 2個多態位點的測序峰圖Fig.2 The sequencing peak graph of 2 loci

圖3 2個多態性位點HRM分型曲線Fig.3 The HRM analysis at 2 loci

5855(C/T)基因型判定：擴增包含多態性位點在內的112 bp的DNA片段，然后將擴增通過Light Scanner(美國，Idaho)掃描分型，其基本原理是通過LC Green飽和染料和DNA進行結合，然后通過Light Scanner高分辨率分析系統升溫，并收集熒光信號得到熔解曲線，在熔解曲線形成過程中，由于核酸分子物理性質的不同，從而導致熔解曲線的不同，達到區分不同樣品的目的。結果表明，熔解曲線分析有3種基因型：CC、CT和TT(圖3A)。統計分析發現，CC基因型屬于優勢基因型，個體數明顯多于其他基因型。

6383(G/A) 基因型判定：擴增包含多態性位點在內的98 bp的DNA片段，然后將擴增通過Light Scanner(美國，Idaho)掃描，通過熔解曲線分析出有3種基因型，GG、GA和AA(圖3B)。 統計分析發現，GG基因型屬于優勢基因型，個體數明顯多于其他基因型。

2.3 不同牦牛群體Ihh基因多態位點遺傳多態性的分析

2.3.1 不同牦牛群體Ihh基因突變位點的基因型頻率和等位基因頻率 在Ihh基因5855(C/T)突變位點處，3個牦牛品種的優勢等位基因為C(表5)；在Ihh基因6383(G/A)突變位點處，3個牦牛品種的優勢等位基因為G(表5)，它們的等位基因頻率基本均在0.7以上。

表5Ihh基因突變位點5855(C/T)和6383(G/A)的基因型及等位基因頻率

Table 5 Genotypes and allele frequence of 5855(C/T) and 6383(G/A) in theIhhgene

位點Loci品種Breed基因型頻率Genotypicfrequency等位基因頻率Allelicfrequency5855(C/T)甘南牦牛CC(122)0.61CT(32)0.16TT(46)0.23C0.69T0.31大通牦牛CC(138)0.68CT(54)0.266TT(11)0.054C0.813T0.187天祝牦牛CC(147)0.707CT(20)0.096TT(41)0.197C0.755T0.2456383(G/A)甘南牦牛GG(149)0.745GA(18)0.09AA(33)0.165G0.79A0.21大通牦牛GG(133)0.655GA(42)0.207AA(28)0.138G0.759A0.241天祝牦牛GG(124)0.596GA(38)0.183AA(46)0.221G0.688A0.312

2.3.2 不同牦牛群體Ihh基因群體遺傳特性 多態位點5855(C/T)在甘南牦牛和大通牦牛群體中，表現為高度多態(PIC>0.5)，天祝牦牛表現為中度多態(0.50.5)，在甘南牦牛群體中表現為中度多態(PIC<0.5)(表6)。另外Hardy-Weinberg平衡檢驗發現，在多態位點5855(C/T)和(6383(G/A)處，甘南牦牛和大通牦牛均未達到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，天祝牦牛達到了Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表6Ihh基因突變位點5855(C/T)和6383(G/A)的遺傳多態性

Table 6 Genetic diversity of 5855(C/T) and 6383(G/A) of theIhhgene

位點Loci品種Breed純合度Homozygosity雜合度Heterozygosity有效等位基因數Effectiveallelenumbers多態信息含量PolymorphicinformationcontentHWE卡方χ2P值Pvalue5855(C/T)甘南牦牛0.4250.5752.3530.5360.073P<0.01大通牦牛0.4650.5352.1510.5320.436P<0.05天祝牦牛0.5390.4611.8550.4222.404P>0.056383(G/A)甘南牦牛0.5820.4181.7180.3881.679P<0.05大通牦牛0.4480.5522.2320.5360.657P<0.05天祝牦牛0.4040.5962.4750.5612.674P>0.05

2.4 不同牦牛群體Ihh基因不同基因型組合與體尺性狀的關聯性分析

對各牦牛群體Ihh基因各多態位點進行HRM分型統計后，運用SHEsis軟件進行位點間的連鎖不平衡分析，2個位點間可能存在強連鎖不平衡(D’>0.75，r2>0.33)；同時，在3個牦牛群體中發現了4種單倍型組合(表7)。參照鮑斌等[30]研究方法從基因型組合角度出發，選取3個牦牛群體中共同的基因型組合CCGG、TTAA和CTGA(表8)運用SPSS17.0軟件分析這3種基因型組合與生長性狀的相關性。由表9可知，甘南牦?；蛐徒M合對體重有顯著影響(P<0.05)，對體長、體高、胸圍和管圍差異不顯著(P>0.05)；由表9可知，大通牦?；蛐徒M合對體長、體高、胸圍、管圍和體重都有顯著影響(P<0.05)；由表9可知，天祝牦?；蛐徒M合對胸圍和體重有顯著影響(P<0.05)，而在體長、體高和管圍方面差異不顯著(P>0.05)?？傮w比較發現CTGA基因型組合在各個牦牛群體中都具有較高的生產性狀。

表7 牦牛Ihh基因多態位點的分布及頻率

Table 7 The haplotype frequencies and distribution of SNPs inIhhgene

品種Breed單倍型組合HaplotypecombinationCGTACATG甘南牦牛286(0.688)71(0.177)26(0.064)0大通牦牛303(0.748)102(0.245)28(0.067)4(0.010)天祝牦牛274(0.685)82(0.205)2(0.005)42(0.105)

表8 牦牛Ihh基因突變位點5855(C/T)和6383(G/A)基因型組合

Table 8 Genotype at theIhhgene for the 5855(C/T) and 6383(G/A) SNPs in yak populations

表9 甘南牦牛、大通牦牛和天祝牦牛Ihh基因不同基因型組合與生產性狀關聯分析

Table 9 Association of differentIhhgenotypes combinations with production traits in Gannan，Datong and Tianzhu yaks

品種Breed基因型Genotype體長/cmBodylenghth體高/cmBodyheight胸圍/cmChestgirth管圍/cmTubegirth體重/kgWeight甘南牦牛CCGG(122)83.91±0.81985.54±0.998106.79±1.09911.66±0.13786.74±3.133aCTGA(5)83.60±0.66885.57±0.727107.49±1.74111.59±0.11285.66±1.622aTTAA(32)82.77±1.13884.46±0.090104.18±1.79111.78±0.13978.05±1.715b大通牦牛CCGG(119)85.86±0.971a85.32±0.725a113.97±1.186a11.88±0.047a72.71±1.238abCTGA(15)86.96±0.621a86.61±0.604b109.87±1.006b11.91±0.066ab76.60±2.023aTTAA(41)84.10±0.758b85.77±0.691a109.56±1.145b12.06±0.057b70.92±1.531b天豬牦牛CCGG(139)113.50±0.391110.4±0.654145.42±0.558A13.64±0.393210.48±1.455abCTGA(36)117.57±1.426114.08±0.753156.86±0.791C14.07±0.701223.42±1.126aTTAA(7)115.87±0.419109.43±1.485150.75±0.8865B13.55±0.202196.37±0.871b

同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

The same letters within the same column show no significant difference(P>0.05)，the different letters show significant difference(P<0.05).The same as below

3 討 論

在長骨發育過程中，Ihh主要表達在肥大軟骨細胞區域。Ihh基因敲除的小鼠顯示出軟骨細胞增殖減少，肥大軟骨細胞增加和造骨細胞缺失等多方面的骨發育異常[31-32]。本試驗研究的牦牛和黃牛的8個組織中，均檢測到Ihh基因mRNA的表達，說明Ihh基因是黃牛和牦牛很多組織細胞功能所必需。

牛的生長性狀屬微效多基因控制的數量性狀，常規的表型選擇，精確性較差，遺傳進展緩慢。而且關于調控牛生長的機理目前還不清楚，主效基因還沒有確定，目前可能與生產性狀有關的候選基因主要有GH[33]、GHR[34-35]和IGF[36-37]等,而牛的Ihh基因位于2號染色體107722665～107728939位置，通過與牛2號染色體上的 QTL數據(http://www.animalgenome.org/QTLdb/pubs.php)庫進行比對發現，在包括Ihh基因在內的106.5～115.4 cm的QTL區域主要與體尺性狀、產犢、結核病和乳房炎等性狀有關，而且研究發現Ihh基因突變的小鼠(E95K突變)表現出個體矮小和典型的A1型短指/趾癥表型—第2～第4 指中指節嚴重縮短，第5指中指節缺失[19]，在人上Ihh基因的突變主要造成并趾和短指[20]，這都證明Ihh基因與指骨關節發育密切相關。因此把Ihh基因作為影響牛生產性狀的候選基因進行研究。

本試驗通過DNA混合池測序得到甘南牦牛Ihh基因2個多態位點，均位于外顯子3上，在群體中均存在3種基因型和2種等位基因， TT和AA分別為其優勢基因型，其優勢等位基因頻率都達到了0.7以上，這可能與樣本的品種、家系和自然環境有關系。按照D.Botstein等[29]提出衡量基因變異程度高低的多態信息含量指標(PIC)的標準，本試驗中所檢測到的2個多態位點雜合度及PIC值都在高等水平，故這2個多態位點均為高度多態，遺傳變異高，選擇余地大。 Hardy-Weinberg平衡檢測表明，在2個突變位點處，甘南牦牛和大通牦牛均未達到哈代-溫伯格平衡(P<0.05)，這可能是因為甘南牦牛和大通牦牛較長期的人工選育，人為的因素為其不處于Hardy-Weinberg平衡的主要因素；而2個突變位點在天祝牦牛中均達到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，可能因牦牛種群是一個較為原始的封閉種群，長期處于閉鎖繁育狀態，從而處于動態平衡。

試驗中對不同牦牛品種2個突變位點進行連鎖不平衡分析后，發現2個突變位點有強連鎖不平衡，統計發現了4種單倍型組合，發現了主要的3種基因型組合，對3種基因型組合與生產性狀間的相關性分析表明，CCGG、CTGA和TTAA的3種基因型組合可能與牦牛的生產性狀相關，而在這3種組合中，CTGA具有較高的生產性能，但在群體中數目少，需要加大人工選育。同時，這種相關性分析降低了單個突變位點受環境、其他位點和其他相關微效基因的影響[38]，得到較可靠的基因型效應估計值，在評估品種和種群的遺傳改良時更準確。

4 結 論

Ihh基因2個突變位點的3種基因型組合對牦牛體斜長、體高、胸圍、管圍和體重均有不同程度的影響，具有CTGA基因型組合的牦牛個體可能體型更大，因此，Ihh基因可以作為主效候選基因或與主基因緊密連鎖的分子標記，將來可以嘗試通過人工干預，擴大有利基因型組合個體的數目。

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(編輯 郭云雁)

Tissue Expression，SNP Detection and Association of Genotype Combination ofIhhGene with Production Traits in Yak

LI Tian-ke1,2,3，ZHAO Juan-hua1,2，PEI Jie1,2，LIANG Chun-nian1,2， GUO Xian1,2，QIN Wen1,2,3，YAN Ping1,2,3*

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730050，China;2.KeyLaboratoryofYakBreedingEngineering，Lanzhou730050，China;3.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The objective of this study was to identify the polymorphisms ofIhhgene and their correlation with production traits，then to detect the molecular markers related to production traits，and investigate distribution and expression in tissues detected in yak and cattle.At the same time，RT-PCR method was used to detect the expression ofIhhgene in different tissues in yak and cattle.BLAST and Chromas were used to screen the SNPs inIhhgene by the wave height of sequencing map.The genotypes were determined by high-resolution melting curve(HRM) and the alleles frequency was estimated.The PHASE and SHEsis softwares were used to analyze matching chain disequilibrium and haplotype，respectively.The SPSS17.0 software was used for association analysis.Two SNPs(5855(C/T) and 6383(G/A)) ofIhhgene were indentified in the population，which were on exon 3.Through population genetics analysis，the results showed that 2 loci were at high polymorphic status(PIC>0.25).The χ2tests showed that the 2 loci were in the status of Hardy-Weinberg equilibrium(P<0.05) in Gannan and Datong yaks; the 2 loci were not all in the status of Hardy-Weinberg equilibrium(P>0.05) in Tianzhu yak.Analysis of matching chain disequilibrium and haplotype showed that there was a strengh linkage equilibrium between the 2 loci with 4 haplotype combinations and 3 genotype combinations.Analysis of association of polymorphism with body measurement traits at all mutation loci showed that 3 genotype combinations had significant effects on body height，body length，weight，tube girth and herrt girth(P<0.05).Yak with CTGA genotype combination had higher body height，body length，weight，tube girth and herrt girth than individuals with CCGG and TTAA.The result of expression showed thatIhhgene was expressed in 8 different tissues.The results suggest thatIhhgene may have potential effects on production traits in the above mentioned yak populations and could be used for marker-assisted selection.

yak；Ihhgene；polymorphism；HRM；production traits；RT-PCR；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.007

2014-01-25

甘肅牧區生產生態生活優化保障技術集成與示范(2012-2016)(2012BAD13B05)；甘肅省科技重大專項計劃(1102NKDA027)

李天科(1987-)，男，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:litianke1987@163.com

*通信作者：閻 萍，研究員，博士生導師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:pingyan@sohu.com

S832.85；S813.3

A

0366-6964(2015)01-0050-10