日糧不同蛋白質水平對綿羊IGF-1和GH分泌及基因表達的影響

閆云峰，楊 華，楊永林，潘曉亮，鄒云龍

(1．新疆農墾科學院 兵團綿羊繁育生物技術重點實驗室，石河子 832000；2.石河子大學動物科技學院，石河子 832001； 3.西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730000)

日糧不同蛋白質水平對綿羊IGF-1和GH分泌及基因表達的影響

閆云峰1,2，楊 華1*，楊永林1，潘曉亮2，鄒云龍3

(1．新疆農墾科學院 兵團綿羊繁育生物技術重點實驗室，石河子 832000；2.石河子大學動物科技學院，石河子 832001； 3.西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730000)

本研究旨在探討不同蛋白質水平日糧對綿羊胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和生長激素(GH)分泌及基因mRNA表達量的影響，為科學配置肉羊飼料及研究肉羊生長發育提供基礎。選擇6月齡體重相近的多胎薩?？斯?8只，隨機分為3組，分別飼喂不同蛋白質水平的日糧(低蛋白日糧、中蛋白日糧和高蛋白日糧)。采用ELISA方法和SYBR Green Real-time PCR方法檢測日糧不同蛋白質水平對不同生長發育階段(30、60 、90 和120 d)羔羊外周血中IGF-1、GH濃度和皮膚組織中基因表達的影響。結果顯示，日糧蛋白質水平顯著影響綿羊平均日增重、外周血中IGF-1和GH的濃度以及皮膚組織IGF-1基因的表達豐度，而未顯著影響GH基因的表達豐度。結果提示，隨著日糧蛋白質水平的升高，綿羊生長發育快，外周血中IGF-1濃度增加，GH濃度降低，IGF-1基因表達量增加。

綿羊；蛋白水平；IGF-1；GH；分泌；基因表達

動物的生長發育受神經內分泌生長軸的調控，即“下丘腦-垂體-靶器官”途徑，胰島素生長因子(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)和生長激素(Growth hormone，GH)處于生長軸的中心環節，對動物生長發育起著重要的調控作用[1-2]。IGF-1也稱生長介素，是一種含有70個氨基酸的細胞增殖調控因子，由肝和骨髓基質細胞分泌，動物體內約90% 的IGF-1來源于肝，其主要通過GH對GHR作用而使IGF-1進入血液[3]，促進骨骼增長、加速蛋白質合成和降解脂肪[4]。GH 也稱促生長激素，由垂體嗜酸性細胞產生，是動物垂體前葉合成和分泌的具有種屬特異性的一種單鏈多肽激素，普遍存在于各種脊椎動物中[5]。GH有兩種作用方式：一是作用于靶器官上的相應受體，產生的IGF-I以內分泌的方式進入循環血液，通過與結合蛋白(IGFBPs)結合最終對動物的生長發育發揮調節作用。二是GH直接作用于靶器官相應受體，通過自分泌或者旁分泌IGFs，或直接影響細胞代謝而對動物器官的生長發育進行調節。研究表明GH和IGF-1基因在綿羊多種組織中廣泛表達，其中在皮膚組織中呈中豐度表達[6-8]。

營養物質對動物體的某些基因表達起著重要的調控作用，其作用主要發生在轉錄或翻譯前水平，而對翻譯后的影響較小。大多數的研究主要以豬、雞和大鼠為研究對象，以綿羊為研究對象的試驗較少，營養物質影響基因表達及分泌是否存在種屬特異性值得探究。本試驗以新疆農墾科學院培育的多胎薩?？诵缕废禐樵囼灢牧?，采用ELISA方法分析日糧不同蛋白質水平影響綿羊外周血中IGF-1和GH的分泌，應用實時熒光定量PCR方法分析日糧不同蛋白質水平影響綿羊IGF-1和GH基因表達，旨在探討營養物質與內分泌及生長軸基因表達的關系，為肉羊新品系培育和高效養殖提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及日糧

選用新疆農墾科學院種羊場 6月齡生長發育正常、平均體重33.65 kg的多胎薩?？斯?8只(P>0.05)，按照中國肉羊飼養標準(NY/T816-2004)設計日糧，采用單因子試驗設計，隨機分為3組(15%為低蛋白組；18%為中蛋白組；21%為高蛋白組)，每組均以6只羔羊為研究對象，各組除日糧蛋白質水平不同外，能量及其他營養指標基本保持一致。根據新疆當地飼養綿羊的主要飼料成分及營養價值得出飼料配方及營養水平見表1。

1.2 樣品采集

每組羔羊單獨舍飼，每天飼喂 2 次，自由飲水，羔羊經預飼期7 d，試驗期120 d，分為0、30、60、90和120 d 5個時間點，采樣當天于清晨08:00稱量空腹狀態下的羔羊體重，并采集頸靜脈血液2 mL及體側部皮膚組織。靜脈血于4 ℃靜置1 h，900×g離心15 min，分離血清，取上清分裝，-20 ℃凍存；從低蛋白組、中蛋白組和高蛋白組中各隨機選取3只羔羊，在5個時間點采集每只羔羊的皮膚組織樣本，皮膚組織立即放入液氮中速凍，-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3 主要儀器與試劑

酶標儀(Model 550，美國Bio-Rad公司)、實時熒光定量PCR儀(Light Cycler 2.0，美國Roche公司)，Precellys 24 組織勻質器(法國Bertin公司)，微量紫外可見分光光度計(NanoPhotometer，德國Implen公司)。

綿羊GH、IGF-1的ELISA檢測試劑盒購自上海藍基生物科技有限公司，E.Z.N.A.TMTotal RNA KitⅠ購自美國Omega生物技術公司，Primer ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自寶生物工程(大連)有限公司、FastStar DNA Master SYBR Green I購自美國Roche生物科技公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 綿羊外周血中IGF-1、GH的ELISA檢測 取分裝5個時間點的羔羊血清，共計90份，根據ELISA檢測試劑盒說明書進行綿羊外周血中IGF-1和GH濃度的測定。

1.4.2 綿羊IGF-1和GH基因的引物設計 以3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH)作為持家基因，從GenBank數據庫檢索綿羊IGF-1(NM-001009774)、GH(NM-001009315)mRNA序列，用Primer premier 5.0軟件設計定量PCR引物，GAPDH引物參考楊華等[9]報道的序列，引物序列見表2，由上海立菲生物技術有限公司合成。

表1 日糧組成與營養水平(干物質，%)

Table 1 Compositions and nutrient levels in diet (air dry basis，%)

項目Item低蛋白組Lowproteingroup中蛋白組Mediumproteingroup高蛋白組Highproteingroup日糧組成Ingredient玉米Corn26.010.00.0苜蓿干草Alfalfa30.025.050.0棉籽殼Cottonshell32.027.013.0番茄渣Tomatopomace10.020.010.0食鹽Salt0.50.50.5精料補充料Feedsupplement0.016.025.0石粉Limestone1.01.01.0緩沖劑Bufferingagent0.50.50.5合計Total100.0100.0100.0營養水平Nutrientlevel消化能/(MJ·kg-1)DE15.215.015.4粗蛋白質/(g·kg-1)CP150.0180.0210.0鈣/(g·kg-1)Ca4.14.24.3總磷/(g·kg-1)TP2.02.02.1

營養水平除代謝能、鈣、磷為計算值外均為實測值

The nutrient levels are measured values，except ME，calcium and phosphorus are calculated values

表2IGF-1、GH和GAPDH引物參數

Table 2 Parameters of oligo-nucleotide primer pairs for theIGF-1，GHandGAPDH

目的基因Targetgene引物序列(5'-3')Primersequence產物大小/bpProductsize退火溫度/℃AnnealingtemperatureIGF-1F:CCAGTCACATCCTCCTCGR:TACATCTCCAGCCTCCTCA251(76～326)54GHF:TGTTTGCCAACGCTGTGCR:CTGGGTGTTCTGGATGGAGTA119(107～325)56GAPDHF:CTGACCTGCCGCCTGGAGAAAR:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTGTT149(766～914)60

1.4.3 總RNA提取 皮膚組織總RNA提取按照E.Z.N.A.TMTotal RNA KitⅠ試劑盒說明書，用微量紫外可見分光光度計測定總RNA濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量。

1.4.4 RT-PCR 按照Primer ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書對總RNA進行反轉錄。GAPDH、IGF-1和GH基因的PCR反應體系為25 μL，包括1.5 μL cDNA模板，12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，上游和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。

1.4.5 PCR 產物克隆及序列分析GAPDH、IGF-1和GH基因RT-PCR產物應用天根生化科技(北京)有限公司膠回收試劑盒進行純化，按照寶生物工程(大連)有限公司pMD18-T Vector Cloning Kit操作說明將目的基因與pMD18-T載體連接，轉化入DH5α感受態細胞，挑選單個白色菌落進行PCR鑒定，陽性重組質粒的菌液送上海立菲生物技術有限公司測序，測序后的序列應用DNAMAN6.0軟件和BLAST進行同源性分析。

1.4.6IGF-1和GH基因熒光定量分析 通過測序分析驗證引物擴增片段為目的基因片段，應用FastStar DNA Master SYBR Green I試劑盒對各組綿羊皮膚組織cDNA進行IGF-1和GH基因的熒光定量分析。將含有GAPDH、IGF-1和GH基因片段的質粒用雙蒸水以10倍梯度連續稀釋，即100、101、102、103，得到熒光定量PCR標準品，每個基因4個梯度，制作熒光定量PCR標準曲線。

熒光定量PCR反應體系為20 μL，其組成為2 μL RT產物，2.4 μL MgCl2(3 mmol·L-1)，目的基因引物(10 μmol·L-1)各1 μL，2 μL FastStar DNA Master SYBR Green I(10×)，補加ddH2O至終體積。反應程序：95 ℃ 預變性10 min；95 ℃ 變性10 s，退火溫度退火10 s，72 ℃ 延伸10 s，45個循環；72 ℃ 延伸5 min。熔解曲線用于檢驗擴增產物的特異性，其反應程序：95 ℃ 0 s；65 ℃ 15 s；95 ℃ 0 s(溫度變化速率為0.1 ℃·s-1)。5個時間點每組3只羔羊的所有樣品進行3次平行檢測，并在每批次熒光定量PCR反應時設陰性對照，記錄各樣品的Ct值。

1.4.7 數據分析 采用2-△△Ct方法[10]分析GH和IGF-1基因相對表達量，應用SPSS 19.0統計分析各試驗組羔羊的平均日增重、GH和IGF-1基因相對表達量及外周血中GH和IGF-1濃度數據。采用數學模型：yij=μy+αi+β(xij-μx)+eij進行單因素協方差分析，其中，αi為第i種飼料蛋白含量固定效應，xij為個體體重，μy為基因相對表達量均值或濃度均值；μx為體重均值；β為y隨x變化的回歸系數；eij為隨機誤差。各飼養階段的羔羊平均日增重、基因相對表達量及濃度均以“平均值±標準差”表示，并用Duncan對各組平均數進行顯著性檢驗。

2 結 果

2.1 不同蛋白質水平日糧對綿羊平均日增重的影響

從表3結果可見，整個飼養期間，3個試驗組羔羊隨著飼養天數的增加體重增加，低蛋白組、中蛋白組和高蛋白組平均日增重依次187.50、220.83和251.33 g·d-1，60～120 d高蛋白組羔羊平均體重顯著高于低蛋白組(P<0.05)，0～120 d高蛋白組平均日增重顯著高于低蛋白組63.83 g·d-1(P<0.05)，料肉比優于低蛋白組，雖然3組間料肉比無顯著差異，但高蛋白組較低蛋白組更具有潛在的生長優勢。飼養期間羔羊增重所消耗的飼料總量即料肉比以高蛋白組最低，中蛋白組次之，低蛋白組最高，表明日糧蛋白水平越高，羔羊的增重越快，飼料報酬越高。說明日糧中蛋白水平能夠影響羔羊增重效果，供給合適的高蛋白水平日糧可促進羔羊快速生長。

2.2 不同蛋白質水平日糧對綿羊外周血中IGF-1和GH含量的影響2.2.1 不同蛋白質水平日糧對綿羊外周血中IGF-1含量的影響 經ELISA檢測分析，綿羊外周血中IGF-1濃度標準曲線(y=-0.494 4x+3.094 5，R2=0.972 6)的相關系數R2大于0.97，結果良好，可以進行后續試驗。單因素協方差分析可見(表4)，整個飼養期間，各試驗組均以飼養0 d時水平為基線(P>0.05)，低蛋白組IGF-1含量在飼養0～90 d呈下降趨勢，但在飼養120 d表現上升趨勢，總體水平較0 d時含量下降；中蛋白組IGF-1含量在飼養0～120 d呈上升趨勢；高蛋白組IGF-1含量在飼養30 d上升較快，之后變化波動較小，呈平穩上升趨勢。各試驗組羔羊外周血中IGF-1在0 d時含量均無顯著差異(P>0.05)；60～120 d高蛋白組IGF-1含量均顯著高于低蛋白組(P<0.05)，2組與中蛋白組差異均不顯著(P>0.05)，與羔羊0～120 d的生長發育一致。說明綿羊生長發育過程中，日糧蛋白水平和外周血中IGF-1含量呈正相關，隨著蛋白水平的增加，外周血中IGF-1含量也相應增加。

2.2.2 不同蛋白質水平日糧對綿羊外周血中GH含量的影響 經ELISA檢測分析，綿羊外周血中GH濃度標準曲線(y=-0.428 5x+2.668 2，R2=0.991 3)的相關系數R2大于0.99，結果良好，可以進行后續試驗。單因素協方差分析可見(表4)，整個飼養期間，各試驗組均以飼養0 d時水平為基線(P>0.05)，低蛋白組GH含量在飼養0～120 d呈平穩上升趨勢；中蛋白組GH含量在飼養0～120 d 呈下降趨勢；高蛋白組GH含量以飼養0 d時水平最高，為1.59 ng·mL-1，飼養期間GH含量呈下降趨勢。在飼養60 d時，低蛋白組GH含量達到最高，為2.48 ng·mL-1，中蛋白組和高蛋白組GH最高含量為飼養0 d時含量，即1.74和1.59 ng·mL-1；飼養90 d的低蛋白組GH含量顯著高于高蛋白組(P<0.05)；飼養120 d的低蛋白組GH含量顯著高于中蛋白組和高蛋白組(P<0.05)。說明綿羊生長發育過程中，日糧蛋白水平和外周血中GH含量呈負相關，隨著蛋白水平的增加，外周血中GH含量降低。

表3 不同蛋白水平條件綿羊平均日增重、料肉比的變化分析

Table 3 The analysis of average daily gain and efficiency feed utilization under different protein levels

指標Index低蛋白組Lowproteingroup中蛋白組Mediumproteingroup高蛋白組Highproteingroup始重/kgInitialweight33.75±2.2733.42±2.4833.78±1.9930d體重/kg30dweight37.15±1.0937.96±1.1438.17±2.1860d體重/kg60dweight42.95±1.58a44.32±1.73ab46.32±1.68b90d體重/kg90dweight49.67±1.49a52.75±2.21ab55.36±2.15b120d體重/kg120dweight56.25±1.67a59.92±1.34ab63.94±1.97b120d平均日增重/(g·d-1)120daveragedailygain187.50±16.88a220.83±13.52ab251.33±9.30b料肉比①Efficiencyfeedutilization①9.20±2.037.84±2.127.14±1.34

同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。①.飼料為TMR混合日糧

Values with different lowercase letter in the same row indicate significant difference(P<0.05).The same as below.①.Feed for the total mixed ration

表4 不同蛋白質水平條件下IGF-1和GH的含量變化

Table 4 The analysis of IGF-1 and GH concentrations change under different protein levels

ng·mL-1

2.3 不同蛋白質水平日糧對綿羊IGF-1和GH基因表達的影響

2.3.1 RNA電泳結果 總RNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖1)表明，28S和18S兩條帶清晰，灰度比值接近2∶1，且OD260 nm/OD280 nm比值為1.8～2.0，證明所提取的 RNA 結構完整，可用于下一步合成cDNA。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 The agarose gel electrophoresis of total RNA

2.3.2 目的基因PCR擴增結果及序列分析 以綿羊cDNA 為模板，以IGF-1、GH和GAPDH基因引物分別進行 PCR 擴增，目的基因片段的長度分別為 251、119和149 bp，經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預期結果一致(圖2)。經序列測定和序列分析，證明所克隆的基因分別為IGF-1、GH和GAPDH基因片段。

1～5.IGF-1基因PCR產物； 8～12.GH基因PCR產物； 13～18.GAPDH基因PCR產物；M.DNA相對分子質量標準DL2000；6，7，19.空白1-5.IGF-1； 8-12.GH； 13-18.GAPDH； M.DL2000 marker；6，7，19.Control圖2 綿羊IGF-1、GH和GAPDH基因的RT-PCR電泳圖Fig.2 RT-PCR of IGF-1，GH and GAPDH gene of sheep

2.3.3IGF-1和GH基因熒光定量PCR檢測 通過熔解曲線分析，發現IGF-1基因在90 ℃ (圖3)，GH基因在87 ℃ (圖4)，GAPDH基因在90 ℃(圖5)，均為單一峰，3個基因擴增時均無非特異性PCR產物、引物二聚體和污染的存在，表明其被特異擴增。通過實時熒光定量PCR，獲得了S型動力學曲線圖。每個基因的指數擴增期和平臺期都比較明顯，從11～32個循環均能檢測出，線性范圍較廣，擴增曲線較理想，表明此次實時熒光定量PCR試驗數據能夠用于目的基因的相對定量分析。

2.3.3.1IGF-1基因的相對表達量分析：經單因素協方差分析可見(表5)，整個飼養期間，各試驗組均以飼養0 d時IGF-1基因相對表達量水平為基線(P>0.05)，低蛋白組IGF-1基因相對表達量隨飼養天數增加而呈下降趨勢，在飼養90 d時其表達量維持穩定；中蛋白組IGF-1基因相對表達量較為平穩，總體呈上升趨勢；高蛋白組IGF-1基因相對表達量隨飼養天數增加呈上升趨勢。在飼養60和120 d時，高蛋白組IGF-1基因相對表達量顯著高于中蛋白組和低蛋白組(P<0.05)。說明綿羊生長發育過程中，日糧蛋白水平和IGF-1基因的表達量呈正相關，隨著蛋白水平的增加，IGF-1基因的表達豐度增加。

圖3 IGF-1基因的擴增曲線與熔解曲線Fig.3 The amplification and dissociation curves of IGF-1 gene

圖4 GH基因的擴增曲線與熔解曲線圖 Fig.4 The amplification and dissociation curves of GH gene

圖5 GAPDH基因的擴增曲線與熔解曲線Fig.5 The amplification and dissociation curves of GAPDH gene

2.3.3.2GH基因的相對表達量分析：經單因素協方差分析可見(表5)，整個飼養期間，各試驗組均以飼養0 d時GH基因相對表達量水平為基線(P>0.05)，低蛋白組、中蛋白組和高蛋白組GH基因相對表達量較為平穩；整個飼養期間3個試驗組GH基因表達量都沒有顯著變化(P>0.05)。低蛋白組GH基因相對表達量在飼養120 d最高，達到1.42；中蛋白組GH基因相對表達量在飼養60 d最高，為1.45；而高蛋白組則以飼養0 d時GH基因相對表達量最高。綿羊生長發育過程中，日糧蛋白水平沒有顯著影響GH基因的表達豐度。

3 討 論

近年來，隨著分子生物學的不斷發展，人們已認識到作為外部因子的營養物質與基因表達之間存在著廣泛的互作，這種互作是動物體內、外因子互作的一個重要方面。研究表明，日糧中主要營養物質如碳水化合物、蛋白質、氨基酸和脂肪對動物體內許多基因，如豬生長激素受體(GHR)[11]、綿羊IGF-1[12]、人IGFBP-1[13]等的表達都有影響。營養與基因表達調控已成為當今動物營養學的研究熱點之一，如何通過改變日糧組成調節體內相關基因的表達，從而使動物體處于最佳生長狀態已成為動物營養學研究的重點。

3.1 不同蛋白質水平日糧對綿羊外周血中IGF-1和GH含量的影響

動物生長是一個極其復雜的過程，受營養水平、遺傳、內分泌調節、環境及飼養管理等眾多因素影響，其中，營養水平、環境及飼養管理等外在因素最終是通過體內神經內分泌激素的變化而影響動物的生長發育。研究證實，豬[14]和牛[15]等動物血液中IGF-1含量與體重及增重呈正相關。李光玉等[16]報道日糧中消化蛋白質與梅花鹿和東北馬鹿外周血中IGF-1 含量呈顯著正相關(P<0.05)，與血清GH濃度無顯著相關(P>0.05)；張勇等[17]也指出日糧中蛋白質水平的提高能夠增加豬血液中IGF-1的含量。當營養不良時，導致血液中GH分泌增加，肝中生長激素受體(GHR)和血液IGF-1的含量降低[18]。本研究發現，中蛋白組和高蛋白組IGF-1含量及日增重隨日齡增加而表現上升趨勢，但高蛋白組IGF-1含量和平均日增重要高于中蛋白組，差異不顯著(P>0.05)；低蛋白組0～120 d平均日增重則低于高蛋白組(P<0.05)和中蛋白組，且IGF-1含量表現出降低趨勢。在0～120 d飼養期，外周血中IGF-1含量變化趨勢與羔羊的生長發育趨勢一致。研究結果與J.M.Pell等[12]結論一致，證明了日糧蛋白水平和綿羊外周血中IGF-1含量呈正相關，日糧蛋白水平的增加，導致外周血中IGF-1含量也相應增加。

表5 不同蛋白水平IGF-1和GH基因表達量變化

Table 5 The relative express analysis ofIGF-1 andGHgenes under different protein levels

基因Gene飼養天數/dDay低蛋白組Lowproteingroup中蛋白組Mediumproteingroup高蛋白組HighproteingroupIGF-101.83±0.331.65±0.341.71±0.33301.77±0.251.71±0.262.56±0.25601.67±0.21a1.69±0.22a2.59±0.22b901.61±0.371.78±0.392.54±0.371201.61±0.07a1.72±0.07a2.45±0.07bGH01.37±0.111.29±0.111.38±0.11301.39±0.161.30±0.171.33±0.16601.38±0.111.45±0.121.23±0.11901.37±0.061.33±0.061.28±0.061201.42±0.091.30±0.091.27±0.09

研究表明，動物的促生長效應主要依賴 GH 刺激產生IGF-1，IGF-1再作用于靶細胞而發揮作用。而GH的合成與分泌受生長激素釋放激素(GHRH)和生長激素釋放抑制激素(SS)的雙重控制，GHRH 除促進分泌GH 外，還可以增加細胞內的mRNA；SS能抑制GHRH 的合成產生，與GHRH 共同調節GH。J.N.Mao等[19]試驗證明生長速度慢的肉雞，其血液中GH含量較生長速度快的要高。P.J.Godowski等[20]證明患有Laron型侏儒癥的病人，其血液中GH水平要高于正常人，但比正常人的IGF-1水平要低。趙茹茜等[21]也在伴性侏儒雞上發現類似的情況。本研究證明，綿羊生長發育中，日糧蛋白水平和外周血中GH含量呈負相關，蛋白水平的增加導致外周血中GH含量降低。針對綿羊的研究結果與雞和哺乳動物的結論相同，營養狀況影響外周血中IGF-1和GH濃度，動物營養不良導致的生長受阻，其血液中GH水平往往是升高而并非下降，而血液中IGF-1含量降低。

從本試驗結果可見，IGF-1和GH含量在各個飼養階段表現出負反饋調節，在高蛋白組和低蛋白組尤其明顯，這也說明羔羊在應對各種不同蛋白水平的應激時，垂體中GH會刺激肝臟中IGF-1的合成和分泌，隨后擴散到機體各個組織中，其通過抑制肝糖釋出，增加葡萄糖攝取和轉化，抑制脂肪分解，促進脂質和糖原及蛋白質的合成而調節羔羊的生長。與中蛋白組相比，高蛋白組羔羊IGF-1含量增加，其GH合成和分泌就會受到抑制，從而形成一個負反饋調節回路[22]，使動物的生理水平維持在一個相對穩定狀態。盡管GH控制著IGF-1的水平，但血液中IGF-1的水平也受其他因素的調控，如甲狀腺和胰島素等激素也能夠調節GH的合成，從而調節IGF-1的分泌。同時，機體組織本身也可以產生IGF-1，或IGF-1可通過自分泌以一種局部生長因子促進細胞增殖，增加動物體重[23]。

3.2 不同蛋白質水平日糧對綿羊IGF-1和GH基因表達的影響

動物的生長發育是由多個基因控制、整合的一個極其復雜的生理調節過程。營養對基因表達主要是通過營養物質的成分和攝入量影響蛋白質合成來進行調控；其次是基因表達后其能夠對動物代謝產生作用，重新分配動物生長需要的物質。一般認為營養不良時，因肝中GH受體基因表達豐度的下降致使IGF-1基因的表達下降，但蛋白質和能量的作用機制有所不同。J.M.Brameld等[24]認為，蛋白質對IGF-1基因的表達主要以氨基酸的形式調控，而能量則主要以葡萄糖的形式調控GH受體基因的表達，進而影響IGF-1基因的表達。

不同學者先后報道，用低蛋白質或無蛋白質的日糧飼喂小鼠，其肝中IGF-1 mRNA 的表達量呈明顯的下降趨勢[25-26]。此外，在蛋白質和能量比例不同的日糧下，綿羊肝IGF-1 mRNA 的表達量也存在同樣的結果，表明IGF-I基因的轉錄水平與營養不良密切相關[27]。研究表明，豬的IGF-1 mRNA的表達量在豬脂肪組織中隨著蛋白質水平的升高而增加，營養不良直接抑制IGF-1基因表達，其主要原因是GH作用受阻[11]。本研究通過熒光定量PCR分析GH和IGF-1基因的相對表達量，結果表明，日糧中蛋白質水平對IGF-1 mRNA 表達量存在顯著的影響，其中低蛋白組IGF-1 mRNA表達量較試驗的飼養0 d時IGF-1表達量水平有所下降，在60和120 d低蛋白組與中蛋白組的IGF-1表達量均顯著低于高蛋白組(P<0.05)，這也預示著羔羊營養供給匱乏時，生長發育受到限制，隨著日糧蛋白質水平的降低，綿羊IGF-1 mRNA表達呈下降趨勢，該規律與劉景云等[28]和張玲等[29]的研究結果相同，同樣，當日糧中蛋白質水平增加時，IGF-1 mRNA表達有上升的趨勢。

GH基因表達受到生長發育相關基因的雙向調控。趙茹茜等[30]報道，蛋雞cGHmRNA隨營養限制其表達量升高，相反，過度攝取營養則cGHmRNA表現下降。周其偉等[31]研究表明，羔羊GHRHR基因表達可能影響GH基因表達，且GHmRNA基因有先升高再下降的表達變化模式。本研究結果發現低蛋白組GHmRNA基因表達量高于高蛋白組，但差異不顯著(P>0.05)，與趙茹茜等[30]結論一致。針對綿羊不同飼養階段GHmRNA表達規律，低蛋白組GHmRNA表達呈上升趨勢，高蛋白組則呈下降趨勢，該結論與R.Q.Zhao等[32]在雞研究中的結果一致。眾所周知，GH首先與細胞表面特異性受體(GHR)結合形成配體受體復合物，再由受體介導激發一系列生化反應，最終啟動GH的目標基因(IGF-1)轉錄；而外周血中GH分泌和合成受GHRH和SS的調節，GHRH、SS和GHR調控作用在生長發育中可能并不協同，是導致本試驗中綿羊外周血中GH分泌和皮膚組織中該基因的表達存在差異的原因之一。此外由于GHmRNA的表達依賴于其受體的表達，但這是否引起羔羊GH受體的表達變化，或者是調控采食的相關基因以及內分泌系統與基因表達間的相互作用有待進一步研究。

4 結 論

低蛋白質日糧減緩綿羊生長發育，促進GH分泌，減少IGF-1分泌，下調IGF-1基因表達豐度；高蛋白質日糧促進綿羊生長發育，降低GH分泌，增加IGF-1分泌，上調IGF-1基因表達豐度。

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(編輯 郭云雁)

Effects of Different Dietary Protein Levels on the Secretion and mRNA Expression of IGF-1 and GH in Sheep

YAN Yun-feng1,2，YANG Hua1*，YANG Yong-lin1，PAN Xiao-liang2， ZOU Yun-long3

(1.TheBreed&BiotechnologyKeyLaboratoryofSheepinBingtuan，XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationSciences，Shihezi832000，China； 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832001，China； 3.LifeScienceandEngineeringCollegeofNorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730000，China)

The objective of this study was to discuss the effects of different dietary protein levels on insulin-like growth factor-1(IGF-1) and growth hormone(GH) secretion and mRNA expression in sheep，to provide a theoretical basis for scientific preparation of feed and study the growth in sheep.Eighteen 6-month-old prolific Suffolk rams were randomly allocated into 3 treatments with different dietary protein levels(low protein，medium protein and high protein).The concentrations in peripheral blood and mRNA expression levels in skin of IGF-1 and GH were detected at different growth stages(30，60，90 and 120 d) with different dietary protein levels by ELISA and SYBR Green Real-time PCR methods.The results showed that the average daily gain，the concentrations of IGF-1 and GH in peripheral blood，the mRNA expression ofIGF-1 in skin were significantly affected by dietary protein levels.However，mRNA expression ofGHgene did not change significantly.With the increased protein intake，the growth of sheep was faster，the concentration of IGF-1 was increased，but the concentration of GH was decreased in peripheral blood，mRNA expression ofIGF-1 gene was up-regulated.

sheep；protein levels；IGF-1；GH；secretion；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.011

2014-05-05

國家自然科學基金項目(31360541)；兵團博士資金專項(2011BB015)；兵團農業科技攻關項目(2011BA006)

閆云峰(1986-)，男，河北張家口人，碩士生，主要從事動物營養調控研究，E-mail:xjnkyxms@126.com

*通信作者：楊 華，副研究員，E-mail：yhxjcn@sina.com

S826；S816.4

A

0366-6964(2015)01-0085-11