鄰苯三酚自氧化法測定血漿超氧化物歧化酶的方法學評價及臨床應用探討

張 凡，李興武，鐘政榮

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物體內特異性的清除自由基的首要物質，SOD 水平的高低可反映機體內自由基的含量。常用于對心、腦、肝臟等重要臟器病變引起的過氧化物損傷進行監測［1］。目前對于SOD 的研究十分活躍，SOD 測定方法有多種［2］，如黃嘌呤氧化酶法、鄰苯三酚自氧化法、腎上腺素法、核黃素－NBT 法、細胞色素C 還原法等，目前多數實驗室此項目的檢測多采用黃嘌呤氧化酶法、鄰苯三酚自氧化法。我院于2014年3月開展了血漿SOD檢測，選用了鄰苯三酚自氧化法。為探討此方法優劣及SOD 的臨床應用價值，本文特對鄰苯三酚自氧化法測定SOD 進行了實驗探討，進行了相關的方法學評價和比較，現將整個檢測過程報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 健康對照組為我院體檢中心經健康體檢合格的正常人。對照組共42 例，其中男29 例，女13 例，平均年齡42歲。疾病組:選擇與氧化應激反應相關疾病患者1580 例，其中肝臟疾病277 例，腎臟疾病281 例，消化系統疾病174 例，呼吸系統疾病133 例，心血管疾病673 例，糖尿病患者42 例。疾病組中，男940 例，女640 例，平均年齡57.9 歲。

1.2 方法(1)儀器:為日本產為Beckman Coulter AU5800全自動生化分析儀。試劑為北京華宇億康生物工程技術有限公司生產的鄰苯三酚自氧化法定量測定試劑盒;校準品和質控品為試劑配套使用，批號為131221 和20140407，均在效期內使用。(2)樣本來源:利用質控品、校準品及混合血漿配制相關方法學評價用的樣本;(3)試驗方法:有以下幾種:

1.2.1 精密度試驗 依照CLSI 的EP5-A2［3］文件要求，取高、中值質控血漿，其中20 份用于批內精密度試驗，即1 d 測定20 次;另外20 份用于做批間精密度試驗，即每天分別取高、低值質控各1 支，連續測定20 d。

1.2.2 準確性試驗 依照CLSI 的EP9-A2［4］文件的要求，檢測SOD 定值標準血清，連續測量3 d，每天測量3 次，計算絕對偏移和相對偏移，和試劑盒準確性標準的要求進行比較。

1.2.3 線性試驗 按照CLSI 的EP6 A［5］文件的要求，取批號為131221 的標準品干凍血清，按照試劑盒提供的線性范圍，對標準品進行系列濃度的稀釋或濃縮，即高(H)、低(L)濃度樣品，配制成6 管系列樣品:5L、4L+ 1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H，分別測定三次取均值。以X 表示各樣品的理論值，以Y 表示各樣品的實測值進行回歸分析，得到Y=bX+a，若r2＞0.95，則可判斷線性范圍驗證成功［5］。

1.2.4 回收試驗 在兩份新鮮血漿中按比例加入高、低不同濃度的標準液，得到4 份回收血漿，每一濃度均檢測3 次，取均值。

1.3 臨床應用評價 對氧化應激相關疾病患者及42 名健康體檢者進行比較，疾病組分為肝臟疾病組、腎臟疾病組、消化系統疾病組、呼吸系統疾病組、心血管疾病組、糖尿病患者。

1.4 統計學方法 2 組之間比較采用獨立樣本t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。計量資料以±s 表示。

2 結果

2.1 精密度試驗 按要求對標本測定后，然后對結果進行統計學處理。結果顯示:批內精密度高、中值的CV%分別為1.57%、1.82%，批間精密度高、中值的CV%分別為2.17%，2.21%，結果均小于5%的臨床要求。見表1。

表1 2 組標本的精密度測定結果(U/ml)(CV%，±s)

表1 2 組標本的精密度測定結果(U/ml)(CV%，±s)

項目批內精密度均值及標準差變異系數批間精密度均值及標準差變異系數高值202.30 ±3.181.57212.00 ±4.592.17中值150.05 ±2.741.82152.00 ±3.362.21

2.2 準確性試驗 按要求對標本測定后，計算絕對偏移和相對偏移，和試劑盒說明書準確性標準的要求1/4 的進行比較。該血清SOD 測試準確度試驗符合相關技術要求和臨床實際要求。結果見表2。

表2 SOD 準確度試驗結果(n=9)

2.3 線性 對標準品所稀釋的6 管系列濃度值做圖，理論值為X 軸，實測值為Y 軸，進行回歸分析，得出R2為0.9978，在0～250 U/ml 內具有良好線性。見圖1。

圖1 SOD 線性分析

2.4 回收試驗 將2 份基礎血清1 ml 分別加入0.1 ml 濃度為250 U/ml 和150 U/ml 的校準液進行測定，分別對基礎血清及回收樣本進行測定，計算回收率，得出其回收率為96.2%～103.4%，平均回收率為98.7%，見表3。

表3 血清標本回收試驗測定結果

2.5 臨床應用評價 對疾病組(肝臟疾病、腎臟疾病、消化系統疾病、呼吸系統疾病、心血管疾病、糖尿病患者)分別與正常對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.01)。表4。

表4 不同疾病血漿SOD 水平與正常對照組的比較(±s)

表4 不同疾病血漿SOD 水平與正常對照組的比較(±s)

組別例數SOD肝臟疾病組277120.98 ±24.27腎臟疾病組281144.79 ±37.44消化系統疾病組173118.00 ±28.22呼吸系統疾病組13395.95 ±18.46心血管疾病組673134.88 ±31.98糖尿病組42121.31 ±30.35正常對照組42178.76 ±15.42

3 討論

近年來研究表明［6-9］，SOD 用于催化超氧陰離子自由基(O2－)發生歧化反應，它對平衡機體氧化與抗氧化系統、免除自由基損傷起著主要的作用。在病理情況下，自由基產生過多，就會引起DNA、蛋白質和脂類等生物大分子的損傷，引起機體發生多種疾病。人體中自由基含量與SOD 水平呈負相關，SOD 水平的高低可反映機體內自由基的含量。SOD 常用在對心、腦、肝、腎等重要臟器病變以及炎癥、放射性損傷、藥物中毒、放化療等引起的過氧化物損傷，并運用自由基清除藥物進行治療。

我院于2014年3月開展了血漿SOD 檢測，選用了鄰苯三酚自氧化法。從本試驗方法學的原理來看，在堿性條件下鄰苯三酚能迅速自氧化，釋放出O2－，加入SOD 則抑制其自氧化速度，且減弱的程度與SOD 的濃度相關，此反應屬于酶促反應，其具有操作簡便、快速、試劑便宜且用量小，適用于自動生化分析儀。SOD 測定方法有多種，如黃嘌呤氧化酶法、腎上腺素法、核黃素－ NBT 法、細胞色素C 還原法等，有報道認為［2］，黃嘌呤氧化酶法特異性強，結果穩定，但試劑昂貴，反應時間長。而其他幾種方法干擾因素多，穩定性差。

本文遵照美國臨床和實驗室標準化協會CLSI 文件EP5－A2［3］、EP9－A2［4］和EP6－A［5］的要求對SOD 測定試劑盒進行評價，SOD 不屬于常規化學的檢測項目，因此對于此類新項目的評價和論證就顯得尤重要。從本文的試驗結果看，SOD 精密度試驗無論是批內還是批間精密度均符合要求。批內精密度為1.57%和4.8%，批間精密度為2.17 和2.21%。本次評價結果滿意，反映了實際工作中臨床該項目標本隨機分配及儀器、試劑天間誤差而帶來的不確定度。本次試驗準確性試驗的相對偏倚為:1.6%和2.4%，試劑廠商提供的1/4相對偏倚為5%，表明該試驗的準確性好。本次試驗所用的校準品是試劑配套的校準品，廠家對其進行了嚴格的定值，但是由于該項目較新，不屬于常規化學的檢測項目，所以不同實驗室及試驗方法間的可比性就有待進一步探討;本次線性試驗，在0～250 U/ml 內R2 為0.9978，表明在0～250 U/ml 范圍內該項目線性良好。對于線性試驗，關鍵在于制備高、低濃度的樣本，本試驗根據廠家提供的校準品配制。本次回收試驗的回收率為96.2%～103.4%，表明該實驗的系統誤差小，完全滿足臨床檢測的需要。本次試驗選用了2 份基礎血清分別加入2 個濃度的校準液進行測定，目的是為了得到不同醫學決定水平的樣本，試驗結果非常令人滿意。

對于本次試驗臨床應用評價方面，選用了大量的疾病組血清SOD 水平與正常對照進行對比，本次臨床標本驗證結果表明肝臟疾病、腎臟疾病、消化系統疾病、呼吸系統疾病、心血管疾病以及糖尿病患者的血清SOD 活性水平均低于健康對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，與有關報道相符［6-9］。在病理狀態下，生成過多的自由基或者清除障礙都可引起機體損傷，體內抗氧化物質平衡失調。肝臟能有效的清除體內產生的自由基，抑制或阻止脂質的過氧化反應［10］。本次研究中，肝臟疾病的SOD 活性水平顯著低于健康對照組(P＜0.01)。表明體內SOD 水平的確發生了變化，與上述論證相符。對于腎臟疾病和糖尿病患者，本次研究表明患者體內的超氧陰離子過多。另外，本次研究表明在心血管疾病中，體內SOD 水平也顯著下降。有報道表明［6］，心血管疾病以心肌缺血為主。心肌缺血時，氧氣供應不足，心肌細胞內ATP 分解加速，使黃嘌呤脫氫酶轉變為黃嘌呤氧化酶，此酶催化黃嘌呤產生尿酸和大量氧自由基，消耗抗氧化酶。使體內自由基消除劑減少或缺乏。因此，監測SOD 活性水平對與心腦血管疾病的發生、發展和治療均有積極意義。對于消化系統疾病，SOD 活性水平也顯著下降，其原因有報道認為［8］，是消化道黏膜細胞在化學刺激或者機體缺氧等情況下，產生過多的氧自由基而不能及時清除，損傷消化道黏膜細胞.導致消化道疾病組織中SOD 活性水平降低。而對于呼吸系統疾病，本次研究133 例，其中包括肺部感染、肺功能不全、肺氣腫、肺炎、肺腫物，肺栓塞等。試驗結果表明患者體內自由基含量過多，存在過度氧化情況，與現有報道一致［11］。

綜上所述，鄰苯三酚自氧化法測定血清SOD 適用于生化分析儀，方法學評價優良，對于肝臟疾病、腎臟疾病、消化系統疾病、呼吸系統疾病、心血管疾病以及糖尿病患者均有價值，對于患者病程轉歸，實時動態監測以及如何運用氧自由基清除劑等方面開辟了廣泛的前景。

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