不同形態磷源對具槽帕拉藻(Paralia sulcata)生長和磷酸酶活性的影響*

于 倩 王 清 袁澤軼 吳惠豐 趙建民①

(1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所 中國科學院海岸帶環境過程與生態修復重點實驗室 煙臺 264003;2. 國家海洋信息中心 天津 300171; 3. 中國科學院大學 北京 100049)

浮游植物是海洋生態系統中最主要的初級生產者, 其生長通常受到氮、磷等營養元素的限制(Huanget al, 2005)。傳統的觀點認為, 氮是近海浮游植物生長的主要營養鹽限制因子(Rytheret al, 1971; Zehret al, 2011; Hoet al, 2013), 但初級生產的磷限制也相繼在地中海、紅海、馬尾藻海和北大西洋等海區被發現(Thingstadet al, 1998; Wuet al, 2000)。

近年來, 由于陸源氮輸入的增加和磷輸入量的減少, 已導致我國近海磷潛在限制的趨勢愈發嚴重(Xuet al, 2010)。在海洋環境中, 溶解態磷主要以溶解無機磷(Dissolved inorganic phosphorus, DIP)和溶解有機磷(Dissolved organic phosphorus, DOP)兩種形式存在?，F有研究發現, 浮游植物對不同形態磷源的利用能力存在差異, 且這種差異可能影響到種群在生態系統中的競爭地位(Hoppe, 2003; Kruskopfet al,2004; Xuet al, 2010)。通常來說, DIP可被多數浮游植物直接吸收利用, 而 DOP則需要通過一系列酶的水解作用轉化為DIP后再被利用(Ohet al, 2002; Huanget al, 2005; 張清春等, 2005)。例如, 在DIP限制條件下,浮游植物可通過胞外堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)分解水體中的 DOP, 釋放磷酸根供細胞吸收利用(Hoppe, 2003; 唐洪杰等, 2006)。此外, 浮游植物也可以利用胞內酸性磷酸酶(Acid phosphatase, AcP)水解儲存于胞內的磷, 以維持細胞的正常生長(趙艷芳等,2009)。

具槽帕拉藻(Paralia sulcata)隸屬于中心硅藻綱、帕拉藻屬, 是一種廣泛分布在溫帶半咸水沿海區域的底棲硅藻(McQuoidet al, 2003; Gebühret al, 2009)。研究發現, 具槽帕拉藻的生長狀態和外界環境緊密相關(Gebühret al, 2009); 同時, 該物種具有易沉降、難降解的特性, 使其能夠在沉積物中得以較好地保存, 因此常被用作海洋環境的指示物種(McQuoidet al, 2003)。目前, 國內外學者已針對具槽帕拉藻的生態特征開展了相關研究(Hobsonet al, 1997; Zong 1997), 但關于其對不同磷源利用能力的研究尚未見報道。本文通過比較不同形態磷源對具槽帕拉藻生長及磷酸酶活力的影響, 可為探討浮游植物對不同形態磷源的吸收利用特征提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 藻種及試劑

實驗所用具槽帕拉藻(Paralia sulcata)分離自渤海近岸海域, 并在本實驗室保存。藻種采用 f/2培養基進行培養, 培養條件如下: 溫度為(23.0±0.50)°C,光暗周期為14:10h, 光照強度為3.0×103lx。正式實驗前, 通過添加抗生素(硫酸鏈霉素與青霉素鈉鹽混合液)的方式對預接種藻液進行滅菌處理(Kwonet al,2013)。

5種不同形態的磷源分別為磷酸二氫鉀(KH2PO4)、β-甘油磷酸鈉(Sodium-β-glycerophosphate, β-G-P)、葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate, G-6-P)、三磷酸腺苷二鈉(Adenosine disodium triphosphate, ATP)和卵磷脂(Lecithin, LEC), 均購自Sigma公司。

1.2 實驗設置

參照 Harrison等(1980)的方法配制人工海水, 經0.22μm 孔徑醋酸纖維濾膜過濾后, 配制 f/2培養基,用于藻細胞培養。將處于指數生長期的具槽帕拉藻經5.0×103r/min離心 15min, 收集藻細胞并用人工海水清洗 2次, 接種于未添加營養鹽的過濾消毒海水中(初始藻密度約為 5.0×103cells/mL), 培養 3天以消耗母液中的磷。

實驗過程中, 設置5個處理組分別添加不同形態的磷源, 各形態磷的初始濃度均為 4.0μmol/L, 調整N︰P=16︰1, 其他營養鹽成分按照f/2培養基進行添加, 每個處理組設置3個重復, 實驗周期為7天。

1.3 藻細胞計數

采用浮游植物計數框進行顯微鏡鏡檢計數; 每24h取樣一次, 各處理組平行取樣3次并測算平均值,記錄細胞生長數據并分析細胞生長情況(李英等,2005)。

1.4 DIP和DOP的含量測定

DIP含量的測定采用磷鉬藍比色法(Leeet al, 2013);培養液中的總溶解態磷(Total dissolved phosphorus,TDP)和藻細胞內的 TDP含量采用過硫酸鉀(K2S2O8)氧化法測定(Jeffrieset al, 1979); DOP濃度以TDP減去DIP的濃度測算。

1.5 磷酸酶活性分析

AP和AcP活性的測定參照Wynne(1977)的方法進行, 采用對硝基苯酚磷酸鹽(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)作為底物。藻細胞分別經 Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L, pH 9.0)和醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.20mol/L,pH 5.0)勻漿, 用于后續的AP和AcP活性測定。測定過程中, 以未加底物的藻細胞勻漿液作為空白組。酶活力單位定義如下: 在 30°C條件下, 單位時間內每個藻細胞產生的磷酸酶釋放 1.0μg對硝基苯酚(p-nitrophenol, PNP)作為一個酶活力單位(U)。

1.6 數據處理

實驗數據均以平均值±標準差表示; 利用 SPSS16.0軟件對所得實驗數據進行方差分析, 當P<0.05時認為處理之間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不同磷源對具槽帕拉藻生長的影響

由圖1可知, 5種不同形態磷源均可促進具槽帕拉藻的生長。其中, 以G-6-P為磷源處理組的藻細胞生長最好, 從第2天開始細胞密度就高于其它處理組,至第 6天時細胞密度達到最高值(3.2×104cells/mL);以ATP為磷源的處理組次之, 第5天時細胞密度達到峰值(2.7×104cells/mL), 但從第 6天開始細胞密度迅速下降; 以β-G-P和LEC為磷源的處理組中, 藻細胞生長趨勢及細胞密度相近, 分別在第5天和第6天達到細胞密度的峰值(均為 2.5×104cells/mL)。相對于以DOP為磷源的處理組, 添加KH2PO4處理組的細胞生長較差, 第5天時細胞密度達到最大值(2.4×104cells/mL)。

圖1 不同形態磷源對具槽帕拉藻生長的影響Fig.1 Effects of different phosphorus substrates on growth of P.sulcata

2.2 具槽帕拉藻的磷酸酶活性

不同形態磷源對具槽帕拉藻生長過程中 AP和AcP活性的影響如圖2和圖3所示。在實驗期間, 具槽帕拉藻的 AP活性總體呈現先下降后上升的趨勢;其中, 在以大分子 DOP為磷源的處理組中(LEC處理組), AP活性始終保持最高。以KH2PO4為磷源的處理組, AP活性在前2天迅速下降, 從第6天(0.55×10–5U/cell)開始出現升高至實驗結束(0.74×10–5U/cell)。在以β-G-P、G-6-P和ATP三種小分子DOP為磷源的處理組中, AP活性均呈現降低趨勢, 分別在第 5天(0.20×10–5U/cell)、第 4 天(0.16×10–5U/cell)和第 5 天(0.24×10–5U/cell)時酶活性達到最低; 之后 AP酶活性有所上升, 且 ATP處理組的酶活性較 β-G-P、G-6-P處理組上升緩慢。實驗結束時, 在 3種小分子 DOP處理組中, AP活性由高到低的順序分別為 β-G-P>G-6-P>ATP。

圖2 不同形態磷源對具槽帕拉藻AP活性的影響Fig.2 Effects of different phosphorus substrates on AP activities of P. sulcata

圖3 不同形態磷源對具槽帕拉藻AcP活性的影響Fig.3 Effects of different phosphorus substrates on AcP activities of P. sulcata

AcP活性在前兩天呈上升趨勢, 之后出現略微降低, 從第 4天開始呈上升趨勢。在實驗結束時, ATP處理組的 AcP 活性最高(0.80×10–6U/cell), KH2PO4處理組最低(0.58×10–6U/cell), 其它三組的 AcP活性水平相當(≈0.60×10–6U/cell)。

2.3 具槽帕拉藻胞內TDP和培養液中磷濃度的變化

具槽帕拉藻胞內TDP的變化如圖4所示?？傮w而言, 胞內TDP在前2天呈現上升趨勢, 各處理組的胞內TDP均達到最高值; 其中, 以KH2PO4處理組的胞內 TDP 濃度最高(5.9×10–8μmol/cell)。隨培養時間的延長, KH2PO4、β-G-P、LEC、G-6-P處理組的胞內

TDP濃度相對平穩, 而ATP處理組則在第6天迅速下降。至第7天時, 5種磷源處理組的胞內TDP濃度由高到低的順序為KH2PO4>β-G-P>LEC>G-6-P>ATP。

圖4 不同形態磷源對具槽帕拉藻胞內TDP濃度的影響Fig.4 Effects of different phosphorus substrates on intercellular TDP of P. sulcata

在DOP處理組中, 培養液中的DOP濃度均迅速下降, 至第 2天已降至 0.20—0.30μmol/L; 而從第 3天至實驗結束, DOP濃度變化幅度較小, 基本維持在平穩狀態(圖5)。對DIP而言, KH2PO4處理組的DIP在實驗前2天迅速下降, 然后趨于穩定, 在第7天時DIP濃度為 0.91μmol/L; 而 DOP處理組培養液中的DIP在第2天達到峰值(0.80—1.20μmol/L), 隨后從第3天開始逐步降低(圖6)。

3 討論

3.1 不同形態磷源對具槽帕拉藻生長的影響

磷是浮游植物賴以生存和繁殖的必需營養元素之一(Sa?udo-Wilhelmyet al, 2004; Xuet al, 2010; Leeet al, 2013), 是近海初級生產力的重要限制性因子(Dyhrmanet al, 2006a; Hyneset al, 2009)。通常認為,DIP是浮游植物最重要的磷源; 但越來越多的證據表明, DOP也可作為浮游植物的重要磷源, 尤其是在DIP貧乏的海域(Cotneret al, 1992; Bonin, 1988)。

圖5 不同形態磷源對培養液中DOP濃度的影響Fig.5 Effects of different phosphorus substrates on DOP concentrations of the culture medium

圖6 不同形態磷源對培養液中DIP濃度的影響Fig.6 Effects of different phosphorus substrates on DIP concentrations of the culture medium

天然海水中含有分子量不同、種類繁多的 DOP化合物(Duursmaet al, 1981; 黃邦欽等, 1995)。研究表明, 不同浮游植物對 DOP化合物的利用特征存在差異。例如, 東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)可有效利用 G-6-P、ATP、β-G-P(Huanget al, 2005; 李英等, 2005); 球形棕囊藻(Phaecocystis globosa)在以LEC作為磷源的培養基中能夠快速生長(王艷等,2006); 束毛藻(TrichodesmiumIMS101)具有高效代謝G-6-P、單磷酸腺苷的能力(Sa?udo-Wilhelmy, 2006;Beversdorfet al, 2010)。此外, Wang 等(2011)研究發現,海洋卡盾藻(Chattonella marina)可以有效利用多種核苷酸和β-G-P, 但其對磷酸三乙酯(Triethyl phosphate,TEP)和對硝基苯磷酸二乙酯(Nitrophenyl phosphate,NPP)的利用效率較低。

在本研究中, 具槽帕拉藻在5種不同形態磷源下均能正常生長, 表明具槽帕拉藻具有較為廣泛的磷源利用能力。進一步分析發現, 實驗結束時 KH2PO4處理組培養液中的 TDP濃度最高, 即單位時間內的磷消耗量最少, 并且藻細胞在 KH2PO4中的生長速度也低于DOP處理組, 表明DOP比KH2PO4更有利于具槽帕拉藻的生長。通過與中肋骨條藻(Skeletonema costatum)比較發現, 在營養條件充足的情況下, 具槽帕拉藻相對于中肋骨條藻其延遲期較短, 表明其能夠快速的適應環境, 這些特性可能是具槽帕拉藻成為夏季和冬季黃渤海海域主要優勢種的原因之一。

3.2 不同磷源對AP活性的影響

眾多研究證實, AP在磷生物地球化學循環過程中發揮著非常重要的作用(Dyhrmanet al, 1999; Labryet al, 2005)。Dyhrman等(2006b)在研究海岸系統中DOP的循環作用時, 將AP活性作為DOP生物可利用性的衡量標準。大量研究表明, 在DIP缺失的環境中, 藻細胞能夠通過誘導合成 AP, 以分解水體中的DOP來維持細胞的生長和繁殖(Feuilladeet al, 1990;Huanget al, 2005; Baiet al, 2014)。

在實驗起始階段, 饑餓處理導致各處理組均具有較高的AP活性; 隨著磷源的加入, 各處理組的AP活性均快速降低, 表明AP可以指示具槽帕拉藻受磷限制的狀況。在本研究中, 3種小分子 DOP處理組AP的活性變化規律與 KH2PO4處理組相似; 而在大分子 DOP(LEC)處理組中, 雖然 AP活性在實驗初期有所下降, 但從第3天開始變化不明顯, 且在整個實驗周期中始終保持較高活性。據此推測, 小分子DOP可能較大分子DOP更易于被AP水解, 從而導致其吸收利用與無機磷酸鹽類似。此外, 具槽帕拉藻也存在直接吸收小分子DOP的可能性。洪華生等(1992)認為,藻類對 DOP的利用可能存在兩條途徑: 對于大分子DOP需要經過磷酸酶水解后被吸收利用; 另一方面,小分子DOP也能夠被直接吸收利用。例如, Johannes(1964)研究發現,Achnanthes subhyalina能夠直接吸收水生動物分泌的DOP, 以及自身代謝產生的DOP。由于海水中的 DOP化合物結構復雜, 不同種類浮游植物對DOP的利用方式仍需進一步研究。

3.3 不同磷源對AcP活性的影響

近年來, 胞內磷酸鹽也被發現是影響浮游植物生長的重要因子之一(Senft, 1978; Hoppe, 2003)。已有研究發現, 某些浮游植物在外界磷酸鹽充足的條件下, 能夠在胞內積累和儲存大量的磷酸鹽; 而當胞外磷酸鹽缺失時, 藻細胞可以利用胞內儲存的磷酸鹽來維持細胞的快速生長(Hernándezet al, 2002; Huanget al, 2005)。在本研究中, 實驗初期培養液中的TDP濃度迅速下降, 并維持在較低水平, 而藻細胞內的TDP含量在實驗初期快速上升, 表明在胞外磷源充足的時候, 具槽帕拉藻能夠在胞內儲存磷。

由圖3可見, 藻細胞在實驗起始階段具有較低的AcP活性, 可能是由于饑餓處理導致胞內儲存的磷被消耗殆盡, 進而限制了藻細胞生長并導致 AcP活性的降低。在添加營養鹽后, 隨著藻細胞對磷元素的吸收, AcP活性又表現出上升趨勢。結合藻細胞生長曲線(圖1)分析, 發現在3—5天胞外TDP濃度處于低水平時, 具槽帕拉藻并未立刻停止生長; 此時胞內 AcP活性有升高趨勢而胞內 TDP呈下降趨, 表明在外界TDP濃度較低時, 具槽帕拉藻通過 AcP動員胞內儲存的磷源以維持藻細胞生長。

王 艷, 唐海溶, 2006. 不同形態的磷源對球形棕囊藻生長及堿性磷酸酶的影響. 生態科學, 25(1): 38—40

李 英, 呂頌輝, 徐 寧等, 2005. 東海原甲藻對不同磷源的利用特征. 生態科學, 24(4): 314—317

張清春, 于仁誠, 周名江等, 2005. 不同類型含磷營養物質對微小亞歷山大藻(Alexandrium minutum)生長和毒素產生的影響. 海洋與湖沼, 36(5): 465—474

趙艷芳, 俞志明, 宋秀賢等, 2009. 不同磷源形態對中肋骨條藻和東海原甲藻生長及磷酸酶活性的影響. 環境科學,30(3): 693—699

洪華生, 戴漢民, 鄭效成, 1992. 海水中堿性磷酸酶活力的測定及其在磷的循環中的作用初探. 海洋與湖沼, 23(4):415—420

唐洪杰, 楊茹君, 張傳松等, 2006. 幾種海洋微藻的堿性磷酸酶性質初步研究. 海洋科學, 30(10): 61—64

黃邦欽, 洪華生, 王海黎等, 1995. 廈門西港浮游植物吸收磷酸鹽的粒級特征. 臺灣海峽, 14(3): 269—273

Bai F, Liu R, Yang Y Jet al, 2014. Dissolved organic phosphorus use by the invasive freshwater diazotroph cyanobacterium,Cylindrospermopsis raciborskii.Harmful Algae, 39: 112—120

Beversdorf L J, White A E, Bjorkman K Met al, 2010.Phosphonate metabolism byTrichodesmiumIMS101 and the production of greenhouse gases. Limnology and Oceanography,55(4): 1768—1778

Bonin D J, 1988. R?le du phophore organique dissous dans la production primaire. Océanis, 14(2): 381—387

Cotner Jr J B, Wetzel R G, 1992. Uptake of dissolved inorganic and organic phosphorus compounds by phytoplankton and bacterioplankton. Limnology and Oceanography, 37(2):232—243

Duursma E K, Dawson R, 1981. Marine Organic Chemistry. New York: Elsevier Scientific Publication, 125—127

Dyhrman S T, Chappell P D, Haley S Tet al, 2006a. Phosphonate utilization by the globally important marine diazotrophTrichodesmium. Nature, 439(7072): 68—71

Dyhrman S T, Ruttenberg K C, 2006b. Presence and regulation of alkaline phosphatase activity in eukaryotic phytoplankton from the coastal ocean: Implications for dissolved organic phosphorus remineralization. Limnology and Oceanography,51(3): 1381—1390

Dyhrman S T, Palenik B, 1999. Phosphate stress in cultures and field populations of the dinoflagellateProrocentrum minimumdetected by a single-cell alkaline phosphatase assay. Applied and Environmental Microbiology, 65(7):3205—3212

Feuillade J, Feuillade M, Blanc P, 1990. Alkaline phosphatase activity fluctuations and associated factors in a eutrophic lake dominated byOscillatoria rubescens. Hydrobiologia,207(1): 233—240

Gebühr C, Wiltshire K H, Aberle Net al, 2009. Influence of nutrients, temperature, light and salinity on the occurrence ofParalia sulcataat Helgoland Roads, North Sea. Aquatic Biology, 7(3): 185—197

Harrison P J, Waters R E, Taylor F J R, 1980. A broad spectrum artificial sea water medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology, 16(1): 28—35

Hernández I, Niell F X, Whitton B A, 2002. Phosphatase activity of benthic marine algae. An overview. Journal of Applied Phycology, 14(6): 475—487

Ho T -Y, Chu T -H, Hu C -L, 2013. Interrelated influence of light and Ni onTrichodesmiumgrowth. Frontiers in Microbiology,4: 1—6

Hobson L A, McQuoid M R, 1997. Temporal variations among planktonic diatom assemblages in a turbulent environment of the southern Strait of Georgia, British Columbia, Canada.Marine Ecology Progress Series, 150: 263—274

Hoppe H -G, 2003. Phosphatase activity in the sea.Hydrobiologia, 493(1—3): 187—200

Huang B Q, Ou L J, Hong H Set al, 2005. Bioavailability of dissolved organic phosphorus compounds to typical harmful dinoflagellateProrocentrum donghaienseLu. Marine Pollution Bulletin, 51(8—12): 838—844

Hynes A M, Chappell P D, Dyhrman S Tet al, 2009. Cross-basin comparison of phosphorus stress and nitrogen fixation inTrichodesmium. Limnology and Oceanography, 54(5):1438—1448

Jeffries D S, Dieken F P, Jones D E, 1979. Performance of the autoclave digestion method for total phosphorus analysis.Water Research, 13(3): 275—279

Johannes R E, 1964. Uptake and release of dissolved organic phosphorus by representatives of a coastal marine ecosystem.Limnology and Oceanography, 9(2): 224—234

Kruskopf M M, Plessis S Du, 2004. Induction of both acid and alkaline phosphatase activity in two green-algae(chlorophyceae) in low N and P concentrations.Hydrobiologia, 513(1—3): 59—70

Kwon H K, Oh S J, Yang H -S, 2013. Growth and uptake kinetics of nitrate and phosphate by benthic microalgae for phytoremediation of eutrophic coastal sediments.Bioresource Technology, 129: 387—395

Labry C, Delmas D, Herbland A, 2005. Phytoplankton and bacterial alkaline phosphatase activities in relation to phosphate and DOP availability within the Gironde plume waters (Bay of Biscay). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 318(2): 213—225

Lee S -H, Ahn C -Y, Jo B -Het al, 2013.Increased microalgae growth and nutrient removal using balanced N:P ratio in wastewater. Journal of Microbiology and Biotechnology,23(1): 92—98

McQuoid M R, Nordberg K, 2003. The diatomParalia sulcataas an environmental indicator species in coastal sediments.Estuarine, Coastal and Shelf Science, 56(2): 339—354

Oh S J, Yamamoto T, Kataoka Yet al, 2002. Utilization of dissolved organic phosphorus by the two toxic dinoflagellates,Alexandrium tamarenseandGymnodinium catenatum(Dinophyceae). Fisheries Science, 68(2): 416—424

Ryther J H, Dunstan W M, 1971. Nitrogen, phosphorus, and eutrophication in the coastal marine environment. Science,171(3975): 1008—1013

Sa?udo-Wilhelmy S A, 2006. Oceanography: A phosphate alternative. Nature, 439(7072): 25—26

Sa?udo-Wilhelmy S A, Tovar-Sanchez A, Fu F Xet al,2004. The impact of surface-adsorbed phosphorus on phytoplankton Redfield stoichiometry. Nature, 432(7019): 897—901

Senft W H, 1978. Dependence of light-saturated rates of algal photosynthesis on intracellular concentrations of phosphorus.Limnology and Oceanography, 23(4): 709—718

Thingstad T F, Zweifel U L, Rassoulzadegan F, 1998. P limitation of heterotrophic bacteria and phytoplankton in the northwest Mediterranean. Limnology and Oceanography, 43(1): 88—94

Wang Z H, Liang Y, Kang W, 2011. Utilization of dissolved organic phosphorus by different groups of phytoplankton taxa. Harmful Algae, 12: 113—118

Wu J, Sunda W, Boyle E Aet al, 2000. Phosphate depletion in the western North Atlantic Ocean. Science, 289(5480): 759—762

Wynne D, 1977. Alterations in activity of phosphatases during thePeridiniumbloom in Lake Kinneret. Physiologia Plantarum, 40(3): 219—224

Xu S S, Song J M, Li X Get al, 2010. Changes in nitrogen and phosphorus and their effects on phytoplankton in the Bohai Sea. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 28(4):945—952

Zehr J P, Kudela R M, 2011. Nitrogen cycle of the open ocean:from genes to ecosystems. Annual Review of Marine Science, 3: 197—225

Zong Y Q, 1997. Implications ofParalia sulcataabundance in Scottish isolation basins. Diatom Research, 12(l): 125—150