綠硫細菌色素的高效液相色譜分析及其應用*

郭 偉 于仁成 亢振軍 孔凡洲 周名江

(1. 中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學院大學 北京 100049;3. 欽州學院 欽州 535000)

綠硫細菌(green sulfur bacteria, 簡稱 GSB)是一類不產氧光合細菌(anoxygenic phototrophic bacteria),能夠在無氧條件下利用光能同化二氧化碳合成有機物(Overmann, 2001; Sakuraiet al, 2010)。在一些常年層化的淡水湖泊里, 以及黑海等封閉海域, 綠硫細菌與紫硫細菌(purple sulfur bacteria, 另一類光合細菌)常常存在于光線能夠到達的無氧且含有游離硫化氫的水體或沉積物表面, 是無氧環境中重要的初級生產者。根據Overmann(2008)統計, 在有綠硫細菌和紫硫細菌的湖泊中, 這些光合細菌對初級生產力的貢獻平均為28%, 最高可達83%。在一些常年存在層化現象的湖泊中, 它們甚至可以大量增殖, 形成“菌華”(bacterial bloom)。目前, 對于綠硫細菌和紫硫細菌的分類學、生理學和生態學方面的研究工作已有全面、系統的綜述(Van Gemerdenetal, 1995; Overmann, 2008)。

綠硫細菌含有獨特的色素, 隨著高效液相色譜和色譜-質譜聯用技術的發展, 人們對于綠硫細菌色素的認識也在不斷深入(Airset al, 2002; Glaeseret al, 2002;Nishimoriet al, 2011)。根據綠硫細菌所含色素的差異, 可以將綠硫細菌分為兩類(Overmann, 2008)。其中, 綠色菌株主要含有細菌葉綠素d和綠硫菌烯(chlorobactene); 而褐色菌株主要含有細菌葉綠素e和異海綿烯(isorenieratene)。各種色素的化學結構如圖1所示。

綠硫細菌能夠在含有硫化氫的無氧真光層水體中大量生長, 而且含有獨特的色素, 因此, 綠硫細菌色素及其老化產物常被用來分析海洋、湖泊環境的真光層無氧事件(euphotic anoxia event)以及生態系統演變狀況(Overmann, 2008)。研究表明, 顯生宙時期海洋真光層中可能發生過多次大范圍的水體無氧事件,與幾次大規模的生物滅絕有密切聯系。在這些研究中,綠硫細菌產生的異海綿烯及其衍化產物提供了重要的證據(Richozet al, 2012)。綠硫細菌色素不僅可用于指示地質年代上的海洋環境演變, 也被用來研究近期水生生態系統中的無氧和缺氧問題。在美國、印度和日本, 許多學者圍繞淡水湖泊中綠硫細菌類群組成、分布特征及其與水體溶解氧和硫化氫分布的關系開展了系統研究(如Kurian, 2012)。除淡水湖泊外, 在黑海深層的無氧水體中也存在綠硫細菌: 通過對黑海海域沉積物中異海綿烯等相關色素的分析,發現黑海的真光層無氧問題可追溯至 6000年前(Repeta, 1993)。尤為令人關注的是, Chen等(2001)在存在季節性底層水體缺氧現象的墨西哥灣北部陸架區發現了綠硫細菌產生的細菌葉綠素e及其降解產物脫鎂細菌葉綠素e, 為該海域缺氧問題提供了確切無疑的證據。同時, 根據沉積物柱狀樣中細菌葉綠素e含量的變化, 分析了墨西哥灣海域缺氧區的發展過程。這表明, 綠硫細菌色素有可能作為一類重要的指標, 指示水體缺氧現象的發生和發展過程(Gooday, 2009)。

圖1 細菌葉綠素d、e (a), 綠硫菌烯(b)和異海綿烯(c)的化學結構(引自Sinninghe Damsté et al, 2006)Fig.1 Chemical structure of bacteriochrolophyll d, e (a); chlorobactene (b); and isorenieratene (c) (from Sinninghe Damsté et al, 2006)

在長江口鄰近海域, 底層水體缺氧問題近年來不斷加劇, 直接威脅該海域生態系統和漁業資源。觀測發現, 一方面缺氧區面積不斷擴展; 另一方面, 底層水體中最低溶解氧水平也在不斷下降(Wang, 2009)。對此, 本研究培養了兩種典型的綠硫細菌, 并嘗試通過高效液相色譜技術對其所產色素進行分析; 應用這一方法及得到的細菌葉綠素d,e和異海綿烯的吸收光譜, 對長江口鄰近海域缺氧區表層沉積物樣品中的綠硫細菌色素進行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 綠硫細菌培養

本研究采用的兩株綠硫細菌購自德國萊布尼茨研究所。其中, 綠硫細菌Chlorobium phaeovibrioides(DSM269)為褐色菌株,Prosthecochloris vibrioformis(DSM260)為綠色菌株(Gloeet al, 1975; Borregoet al,1994)。兩株細菌分別采用 29號培養基(配方見表 1)和40號培養基進行培養。與29號培養基相比, 40號培養基僅NaCl含量增加1%, 其余保持不變。培養基配制過程中, 先將溶液A高壓滅菌45min; 冷卻至室溫后, 在強攪拌條件下充入高純CO2至飽和(30min)。然后加入表1中所列出的溶液B、C(5mL)、D(5mL)、E和F(30mL), 并持續通入高純氮氣, 避免氧氣污染。用滅菌的HCl和Na2CO3溶液(濃度均為2mol/L)調節培養基pH為6.8。最后, 培養基中加入1mg/mL刃天青鈉溶液(1mL/L培養基)作為氧化還原電位指示劑(Hungate, 1969)。

菌株培養參照萊布尼茨研究所推薦方法, 采用Hungate型厭氧管培養。厭氧管管塞采用丁基橡膠材料, 并及時更換, 避免漏氣。菌懸液分裝量控制在厭氧管長度1/3以下。厭氧管置于恒溫培養箱中進行培養, 培養溫度為25°C , 光照強度為2000 lx。培養期間注意觀察菌懸液顏色, 并及時補充還原劑。當菌株長到一定密度時進行分接, 待獲得足量菌懸液后, 以0.22μm 玻璃纖維濾膜過濾收集培養的細菌, 并將濾膜置于超低溫冰箱中保存, 用于色素提取和分析。

表1 綠硫細菌29號培養基組成與含量Tab.1 Composition and concentration of culture medium No.29 for green sulfur bacteria

1.2 綠硫細菌色素提取與分析

對綠硫細菌色素的提取和分析參照本實驗室的藻類色素提取和分析方法進行(Konget al, 2012)。將過濾收集的細菌膜樣在黑暗中解凍 5min, 并剪成細條, 放入 1.5mL樣品瓶中。加入 1500μL甲醇, 冰浴中超聲處理5min。上清液用0.22μm PTFE濾頭過濾后, 取700μL至樣品瓶內, 并加入140μL超純水, 振蕩混勻后立即用于分析。所有操作過程均在弱光環境下進行。

色素方法主要參照Zapata等建立的方法(Zapataet al, 2000), 對分析過程簡述如下: 采用Waters e2695高效液相色譜系統, 應用Waters Symmetry C8色譜柱(4.6×150mm, 3.5μm)分離色素, 柱溫控制在27°C。采用二元梯度洗脫程序, 流動相A為甲醇/乙腈/吡啶水溶液(50:25:25,V/V/V), 其中吡啶水溶液中含有2%吡啶, 并以乙酸調整pH值至5.0; 流動相B為甲醇/乙腈/丙酮溶液(20:60:20,V/V/V)。梯度洗脫過程參考Kong等(2012), 洗脫液流速為1mL/min。樣品室溫度4°C,進樣量100μL。細菌葉綠素e和異海綿烯分析時DAD檢測波長470nm, 細菌葉綠素d和綠硫菌烯分析時DAD檢測波長425nm, 所有分析均同時掃描記錄300—750nm的光譜信息。通過與以往文獻中報道的細菌葉綠素d、細菌葉綠素e、綠硫菌烯和異海綿烯的吸收光譜和保留時間進行對比, 對細菌樣品中的色素組分進行鑒別。

1.3 沉積物樣品的采集、處理和分析

沉積物樣品于2011年5月采自長江口鄰近海域,采樣站位如圖2所示。沉積物樣品以箱式采泥器采集,刮取采泥器中央未擾動的表層沉積物樣品(1—3cm)用于色素分析。表層樣品為灰黑色軟泥, 采集后立即放入–20°C冷凍保存。色素分析方法如 1.2所示, 提取方法如下。

圖2 長江口鄰近海域采樣站位示意圖Fig.2 The sampling deployment in the sea area adjacent to the Changjiang River mouth

將沉積物樣品冷凍干燥, 研磨后過100目篩。準確稱取 2g研磨樣品置于 10mL玻璃離心管中, 加入3mL 100%甲醇, 同時加入 100μL 內標(8'-阿樸-β,ψ-胡蘿卜醛), 于冰浴中超聲處理 5min, 之后進行過夜提取。12h后, 將樣品冷藏離心(5000r/min, 5min, 4°C),取上清液。沉淀以3mL甲醇冰浴超聲萃取5min, 收集萃取液, 重復萃取三次。收集全部上清液用0.22μm PTFE濾頭過濾后, 用柔和氮氣氣流吹干, 加入 1mL甲醇復溶。取700μL樣品至樣品瓶內, 并加入140μL超純水, 震蕩混勻后立即用于分析。浮游植物色素的高效液相色譜分析方法如 1.2所述, 檢測波長為440nm, 同時掃描記錄 300—750nm的光譜信息。沉積物樣品中的浮游植物色素通過與購買的色素標準品(購自丹麥DHI公司)對比進行確認, 綠硫細菌色素則通過在特定檢測波長下與兩株細菌提取液中的相應色素對比, 并參考數據庫信息(http://lipidbank.jp)進行鑒別。

2 實驗結果

2.1 菌株 Chlorobium phaeovibrioides (DSM269)所產色素分析

將綠硫細菌DSM269菌株培養5—7d后, 細菌培養液呈黃褐色時, 收集細菌進行色素分析, 所得色譜圖如圖 3所示。檢測到的細菌色素集中出現在 24—41min時間段內。根據每一色譜峰的吸收光譜圖, 并參照以往綠硫細菌色素的有關文獻(Gloeet al, 1975;Hurleyet al, 1991; Repeta, 1993; Borregoet al, 1994;Takaichi, 2000), 對色素組分進行了初步鑒別?？梢钥闯? DSM269菌株色素組成分成明顯的三簇。第一簇各組分主要出現在 24—27min, 色素吸光度值較高,且具有基本相同的吸收光譜特征(圖4a), 依據其吸收光譜特征可以確定為細菌葉綠素e的同系物; 第二簇各組分出現在保留時間 29—35min的時間段內,色素吸光度值略低, 其吸收光譜特征基本一致且與第一簇各組分相似(表 2), 應為細菌葉綠素e的衍生物(圖 4b)。第三簇出現在 37—42min, 兩個主要組分的吸收光譜基本一致, 應為異海綿烯化合物(圖 4c)。

圖3 菌株Chlorobium phaeovibrioides (DSM269)所產色素的高效液相色譜圖(檢測波長470nm)Fig.3 Chromatogram of pigments extracted from Chlorobium phaeovibrioides (DSM269) (detection wave length: 470nm)

2.2 菌株 Prosthecochloris vibrioformis (DSM260)所產色素分析

綠硫細菌DSM260菌株培養3—5d后, 待細菌培養液呈黃綠色時, 收集細菌進行色素分析, 色譜圖如圖 5所示。檢測到的細菌色素集中出現在從 26—35min時間段內。如圖6和表3所示, DSM260菌株所產色素吸收光譜特征相似, 主要為細菌葉綠素d的同系物。

圖4 菌株Chlorobium phaeovibrioides (DSM269)所產典型色素的吸收光譜圖Fig.4 Absorption spectra of pigments extracted from Chlorobium phaeovibrioides (DSM269)a: 細菌葉綠素e組分4; b: 細菌葉綠素e同系物Ⅱ組分9; c: 異海綿烯組分1

表2 菌株Chlorobium phaeovibrioides (DSM269)所產色素組分列表Tab.2 List of pigments extracted from Chlorobium phaeovibrioides (DSM269)

2.3 長江口鄰近海域沉積物中色素的分析

對長江口鄰近海域采集的表層沉積物樣品進行了分析(圖7), 在樣品中檢測到葉綠素c2, 多甲藻素、巖藻黃素、甲藻黃素、別藻黃素、硅藻黃素、玉米黃素、葉黃素、葉綠素a、b-胡蘿卜素等常見的浮游植物色素。然而, 在關注的保留時間段內, 幾個色譜峰的吸收光譜明顯有別于細菌葉綠素d、e和異海綿烯,未檢測到相應的綠硫細菌色素。

3 討論

3.1 綠硫細菌色素的高效液相色譜分析

綠硫細菌色素, 特別是異海綿烯, 能夠指示水體真光層無氧事件, 因此在存在無氧環境的海洋(如黑海)和淡水湖泊中, 綠硫細菌及其色素研究受到密切關注。而 Chen等(2001)對墨西哥灣北部海域的研究表明, 綠硫細菌色素有可能作為一類重要的化學指標用于分析現代底層水體缺氧現象的演變過程。然而,綠硫細菌色素的分析受到許多因素限制, 其中最突出的是缺少細菌葉綠素d、細菌葉綠素e、綠硫菌烯、異海綿烯等色素的標準品。針對這一問題, 我們從萊布尼茨研究所購置了綠硫細菌菌株, 并以實驗室成熟的高效液相色譜色素分析方法分析其所產色素,基本明確了細菌葉綠素d、細菌葉綠素e、異海綿烯等幾類主要色素的保留時間和吸收光譜特征。與以往文獻相比, 色素的吸收光譜特征基本一致, 而保留時間變化較大。通過分析, 為進一步應用該高效液相色譜方法分析缺氧海區綠硫細菌色素的狀況提供了依據。

盡管本文采用的色素分析方法系針對浮游植物色素設計和優化, 但從分析結果來看該方法對細菌色素同樣具有良好分析能力, 在兩種綠硫細菌中檢測到了細菌葉綠素e同系物I組分4種, 同系物II組分11種, 細菌葉綠素d組分4種, 與之前其它高效液相色譜分析方法的檢測結果基本吻合(Borregoet al,1994; Airset al, 2001)。在以往研究中, 通過結合液相色譜-質譜聯用技術, 初步確認了幾種綠硫細菌所產的色素成分。Airs等(2002)將一株綠硫細菌C.phaeobacteroides中檢測到的四種細菌葉綠素e組分確定為[乙基, 甲基]、[乙基, 乙基]、[丙基, 乙基]、[異丁基, 乙基]取代的細菌葉綠素e。但是, 考慮到不同菌種、菌株之間所產色素可能存在差異, 以及高效液相色譜技術自身在定性分析能力方面的限制, 本研究沒有對檢測到的細菌色素逐一進行確認, 僅按照洗脫順序對主要色素成分進行了分類和編號。在今后的研究中, 將液-質聯用方法應用于綠硫細菌色素分析, 有望提供更精確、可靠的分析結果。

圖5 菌株Prosthecochloris vibrioformis (DSM260)所產色素的高效液相色譜圖(檢測波長425nm)Fig.5 Chromatogram of pigments extracted from Prosthecochloris vibrioformis (DSM260) (detection wave length: 425nm)

圖6 菌株Prosthecochloris vibrioformis (DSM260)所產典型色素的吸收光譜圖Fig.6 Absorption spectrum of a pigment extracted from Prosthecochloris vibrioformis (DSM260)

表3 菌株Prosthecochloris vibrioformis (DSM260)所產色素組分列表Tab.3 List of pigments extracted from Chlorobium phaeovibrioides (DSM269)

3.2 以綠硫細菌色素作為標志物研究長江口鄰近海域缺氧問題

在對近海缺氧區的研究中, 由于缺少長期、連續的觀測資料, 很難對缺氧區的演變情況進行系統分析。因此, 利用沉積物中的生物或化學標志物來反演缺氧問題的發展歷程, 對于了解缺氧區環境與生態系統的演變過程和發展趨勢非常重要。包括綠硫細菌色素在內的很多標志物可以反映水體缺氧環境的長期變化情況(Hodgsonet al,1998; Itohet al,2003;Goodayet al,2009)。

在我國近海, 長江口鄰近海域底層水體的季節性缺氧現象最為嚴重。早在1959年的海洋普查中即發現, 夏季海水底層溶解氧(DO)低值區濃度僅有2.57mg/L(顧宏堪, 1980)。近20年來, 在長江口鄰近海域多次觀測到大范圍的底層水體缺氧區。1999年8月, 在調查中發現缺氧區的影響范圍為 13700km2(DO<2mg/L)(Liet al, 2002)。2003年夏季, 調查發現長江口東南部海域存在缺氧區, 影響范圍達 12000km2(Chenet al, 2007)。2006年夏季, 東海西部海域發現缺氧區的影響范圍超過20000km2(Weiet al, 2007)。同時, 底層水體的溶解氧水平也呈現出持續下降態勢。對長江口北側 32°N 斷面的長期調查(1974—1995)發現, 從1974年至1995年, 調查斷面不同水層溶解氧水平有明顯降低。近年來的觀測結果多在1mg/L左右(Ninget al, 2011)。

盡管長江口鄰近海域的缺氧問題非常突出, 但通過沉積物中的標志物來反演缺氧區演變過程的研究仍然較少。Li等(2011)根據沉積物中有孔蟲類化石的分析結果, 認為長江口鄰近海域底層水體缺氧現象加劇, 表明了開展此類研究的必要性。在常用的各類化學和生物標志物中, 綠硫細菌和紫硫細菌的色素是無氧和缺氧環境的特異性標志物(Sinninghe Damstéet al, 2006), 但是兩類細菌所含色素及其對光照的適應特征有明顯差別。通常紫硫細菌對光照的需求較高, 而綠硫細菌對光照的需求較低, 可以在水深達數十米的海水中存在。在黑海深層水體中的硫化氫躍層區, 由于綠硫細菌對低光照的適應性, 盡管光線很弱, 也能夠達到一定豐度。在墨西哥灣北部海域,在表層沉積物中也檢測到了綠硫細菌產生的細菌葉綠素e。因此, 在本文研究中, 我們嘗試將高效液相色譜技術應用于綠硫細菌典型色素的分析, 并初步檢測了長江口鄰近海域缺氧區沉積物中綠硫細菌色素的存在狀況。

圖7 長江口鄰近海域表層沉積物色素分析的高效液相色譜圖(檢測波長440nm)Fig.7 Chromatogram of pigments extracted from a surface sediment sample collected from the sea area adjacent to the Changjiang River mouth(detection wave length: 440nm)

對長江口南部海域缺氧區表層沉積物進行初步分析, 未能檢測到綠硫細菌色素。這可能是受到高效液相色譜方法本身的限制, 盡管高效液相色譜搭配光電二極管陣列檢測器具有一定的定性分析能力,但是從分析結果來看, 表層沉積物中的色素組成極為復雜, 而且存在較為嚴重的基質干擾現象, 含量較低的色素很難被檢測到。與高效液相色譜方法相比,高靈敏度、高特異性的液-質聯用技術在沉積物中細菌色素檢測方面更具應用潛力。此外, 細菌色素穩定性差異很大, 異海綿烯等類胡蘿卜素能夠存在較長時間, 常用于地質年代海洋真光層無氧事件的分析。與之相比, 細菌葉綠素容易分解, 很難長期存在。研究發現, 并非所有綠硫細菌褐色菌株都會同時產生細菌葉綠素e和異海綿烯, 有的菌株只能產生細菌葉綠素e(Meyeret al, 2011)。在墨西哥灣北部陸架區的研究中就僅檢測到細菌葉綠素e及其降解產物(Chenet al, 2001)。穩定性較差的細菌葉綠素e很有可能會在水體中降解, 因而很難檢測到。盡管目前尚未在長江口鄰近海域沉積物中檢測到綠硫細菌色素, 但應當看到, 長江口鄰近海域底層水體缺氧問題正在加劇。細菌色素作為一類能夠反映底層水體溶解氧狀況、特別是無氧事件的標志物, 應當給予充分關注。

4 結論

綠硫細菌色素及其衍化產物可以作為標志物,指示水體真光層的無氧事件以及水生生態系統在缺氧環境的演變過程。本文應用高效液相色譜分析手段,對兩種典型的綠硫細菌所產色素進行了分析, 獲得了細菌葉綠素d、細菌葉綠素e和異海綿烯等特征色素的保留時間和特征吸收光譜。依據上述結果, 對底層水體缺氧問題突出的長江口南部鄰近海域表層沉積物樣品進行了初步分析, 但未檢測到綠硫細菌色素?？紤]到長江口鄰近海域底層水體缺氧問題正在不斷加劇, 因此綠硫細菌色素仍可作為一類潛在的指標, 用于研究長江口鄰近海域底層水體缺氧程度和演變狀況。

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