急性缺血性腦卒中患者外周血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度的研究

蘆林龍，李芳菲，馮 濤*，陳慧敏，郜麗妍

（1首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經病學中心神經變性病科，2國家神經系統疾病臨床醫學研究中心，北京 100050）

α?突觸核蛋白是一種相對分子質量為14.5ku的蛋白質，在多種神經退行性疾病中含量增加[1]，但確切的神經機制尚不清楚。α?突觸核蛋白相關的病理改變可發生在帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）患者的神經系統、皮膚、唾液腺等全身多個系統，是該病經典的病理標志物[2?5]。此外，PD患者及多系統萎縮患者外周血α?突觸核蛋白濃度均增加[6]，而阿爾茨海默癥患者也存在α?突觸核蛋白相關的病理改變[7]。這些研究說明，α?突觸核蛋白病理改變存在于多種神經退行性疾病，且可能累及全身多個系統。然而，除了神經退行性疾病以外，目前α?突觸核蛋白病理改變與其他神經系統疾病[如急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）]的關系研究較少。

神經細胞急性缺血損傷與α?突觸核蛋白有一定聯系。動物研究發現，大腦中動脈急性閉塞可誘發急性氧化應激反應，并誘發α?突觸核蛋白聚集[8]。早期研究也發現，在大腦中動脈閉塞小鼠模型中海馬缺血5min后就開始出現α?突觸核蛋白的異常聚集[9]。此外，陳予東等[10]發現腦卒中患者血漿中α–突觸核蛋白寡聚體濃度增高。然而，其產生機制和病理意義尚有待進一步研究。此外，外周血紅蛋白α?突觸核蛋白寡聚體濃度與AIS的關系尚無研究報道。

于是，我們招募正常對照、PD患者和AIS患者并留取血樣標本，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）定量觀察血紅細胞α?突觸核蛋白濃度，并進行組間比較，同時觀察年齡和性別對其含量的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

招募55名正常對照組、55例PD患者和55例AIS患者。納入標準：（1）PD組受試者符合英國帕金森病腦庫的PD診斷標準；（2）卒中組為急性期缺血性腦卒中患者，其中，急性期定義為病程在2周內；（3）有抗凝血樣；（4）簽署知情同意書。正常對照組為與PD患者年齡和性別相匹配的健康老年人。排除標準：（1）繼發性帕金森綜合征患者；（2）符合癡呆診斷標準，臨床癡呆評定量表（Clinical Dementia Rating，CDR）≥1；（3）頭部CT/MRI提示顱內器質性病變者；（4）嚴重焦慮、抑郁和精神分裂癥患者；（5）合并心臟、肺、肝臟、腎臟、內分泌、血液系統嚴重疾病患者；（6）患有失語、嚴重構音障礙等影響臨床測評的疾??；（7）預計依從性較差的患者。

1.2 紅細胞的提取

EDTA?抗凝管采集樣本血液10ml，低速短時離心（2 000轉/min，4℃，20min）；吸取血漿：上層透明的黃色血漿（留?。?；洗滌：下層暗紅色的紅細胞加入1倍體積的1×PBS溶液，輕輕混勻；低速短時間離心后棄上清，重復3次；最后一次離心棄上清后，加入1倍體積的1×PBS溶液，輕輕混勻后分裝，于-80℃保存備用。

1.3 免疫組化分析

1.3.1 重組人α?突觸核蛋白的制備和純化將含有α?突觸核蛋白基因的pET重組質粒轉化至大腸桿菌B121感受態細胞中，在含氨芐青霉素的2*YTA培養液中培養至適當濃度后加入IPTG誘導蛋白表達3h，超聲破碎，進一步用離子交換分層、疏水層分析及反相層析純化后獲得α?突觸核蛋白，冷凍-80℃備用。

1.3.2 α?突觸核蛋白寡聚體標準品的制備將α?突觸核蛋白凍干粉末用PBS溶解使其終質量濃度為100μmol/L，經0.22μm濾膜過濾細菌，在37℃下650轉/min恒溫震蕩72h。

1.3.3 雙抗體夾心ELISA法測定紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度用濃度1mg/L3D5單抗包被96孔酶標板，2.5%明膠封閉2h。加用封閉液稀釋生物素化的3D5抗體，向酶標板每孔加入100μl，孵育；用封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶（1︰5000），向酶標板每孔加入100μl，孵育；向酶標板每孔加入100μl pNPP，顯色；用酶標儀測定405nm處吸光度值（A405nm）。

1.4 統計學處理

采用SPSS20.0統計軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量數據以均值±標準差表示，3組組間比較采用方差分析（ANOVA）及驗后檢驗；非正態分布的數據以中位數（百分位數間距）表示，組間比較采用非參數檢驗。計數資料和等級資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 α?突觸核蛋白寡聚體濃度組間差異性分析

正常對照組、PD組及AIS組各組紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度均符合正態分布。血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體在正常對照組、PD組及AIS組中分別為（0.41±0.14）、（0.82±0.55）及（1.01±0.56）mmol/L。ANOVA示3組患者紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度差異具有統計學意義（F＝24.305，P＜0.001）。驗后檢驗示PD患者紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度顯著高于正常對照組（P＜0.001，95%CI 0.230～0.577）；AIS組患者紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度顯著高于正常對照組（P＜0.001，95%CI 0.426～0.773）及PD組患者（P＝0.027，95%CI 0.022～0.369；圖1）。

圖1 3組患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度比較Figure1 Comparison of the oligomeric α-synuclein levels in the red blood cells among the three groups

2.2 性別對AIS患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度影響

55例AIS患者中男性43例，女性12例。血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度在男性患者中為（1.01±0.58）mmol/L，女性患者中為（1.03±0.51）mmol/L。男性AIS患者與女性患者相比，血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度差異無統計學意義（P＞0.05；圖2）。

圖2 不同性別AIS患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度比較Figure2 Comparison of oligomeric α-synuclein levels in the red blood cells between different genders in the patients with AIS

2.3 AIS患者及PD患者中α?突觸核蛋白寡聚體濃度與年齡相關性

AIS患者年齡為（57.6±12.1）歲，PD患者年齡為（54.4±11.8）歲。年齡與血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度在AIS患者（r＝0.036，P＝0.793）及PD患者（r＝?0.185，P＝0.190）中均無顯著相關性（圖3，圖4）。

圖3 AIS患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度與年齡的關系Figure3 Correlations between oligomeric α-synuclein levels in the red blood cell and age in patients with AIS

圖4 PD患者血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度與年齡的關系Figure4 Correlations between oligometric α-synuclein levels in the red blood cell and age in patients with PD

3 討 論

α?突觸核蛋白寡聚體在PD和其他神經退行性疾病的發病機制中具有重要的作用，可以直接導致神經元的死亡[6,11]。在本研究中，我們首次對AIS患者紅細胞中的α?突觸核蛋白寡聚體進行了定量研究。結果表明，AIS患者紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體的含量明顯高于對照組，甚至高于PD患者，但其濃度與性別、年齡無關。

AIS患者外周血紅細胞α?突觸核蛋白含量升高，且升高程度較PD患者更為顯著。這提示α?突觸核蛋白的功能異?？赡懿皇荘D患者的特異性改變。研究顯示，在阿爾茲海默癥患者[12]及多系統萎縮患者[6]中均存在α?突觸核蛋白的功能改變，與我們的研究結果一致。

α?突觸核蛋白廣泛存在于人體細胞中，其功能和致病機制尚不明確。研究指出α?突觸核蛋白可調節突觸傳遞功能、突觸囊泡密度和神經元可塑性[13,14]，其異常增高可以形成路易小體，從而導致細胞死亡。α?突觸核蛋白寡聚體具有細胞毒性，在神經退行性疾病中有重要作用[15]，但其在急性腦血管事件中所扮演角色尚缺乏解釋。陳予東等人對腦卒中患者血漿進行分析，發現血漿α?突觸核蛋白寡聚體濃度增高。他們猜測：這可能是因為腦梗死部位缺血、缺氧，能量代謝下降，導致缺血神經元胞膜破裂或分泌囊泡釋放α?突觸核蛋白至細胞間質，進一步彌散至血漿中[10]。本研究發現的AIS患者外周血紅細胞中α?突觸核蛋白寡聚體濃度升高，進一步驗證了急性缺血事件與α?突觸核蛋白病理改變的關系，但并不支持陳予東等人提出的假說。我們猜測：AIS患者外周血及血漿內α?突觸核蛋白寡聚體濃度增加是由氧化應激損傷誘發的。

早期研究發現，在大腦中動脈閉塞小鼠模型中海馬缺血5min后就開始出現α?突觸核蛋白的異常聚集[9]。具有細胞毒性的α?突觸核蛋白的異常聚集可能導致神經細胞的缺血損傷[16]。這提示，神經細胞中α?突觸核蛋白的異常聚集可能是神經細胞缺血性損傷的機制之一。近期動物研究發現，大腦中動脈急性閉塞可誘發急性氧化應激反應，并誘發α?突觸核蛋白聚集[8]。在PD和阿爾茲海默癥患者中，氧化應激可能是導致α?突觸核蛋白異常聚集的原因之一[12,17]。因此，我們認為氧化應激也可能導致急性缺血事件中α?突觸核蛋白細胞內異常聚集。我們猜測：AIS患者神經細胞急性缺血不僅引起神經細胞的氧化應激損傷，也可能引起外周細胞（如外周血紅細胞）的氧化應激損傷，從而引起α?突觸核蛋白功能異常。

綜上所述，本研究發現，AIS患者外周血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度顯著升高。外周血紅細胞α?突觸核蛋白寡聚體濃度改變可能參與急性缺血事件的病理生理改變，但其是否能夠作為疾病早期診斷、反映預后的生物學標記物或能否作為AIS的獨立危險因素，有待進一步研究。在未來的研究中，我們需要對AIS患者外周血α?突觸核蛋白寡聚體濃度及其他危險因素進行流行病學研究；同時對缺血性腦卒中患者外周血α?突觸核蛋白寡聚體濃度與疾病的嚴重程度之間的關系及其神經損傷機制進一步進行研究。

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