RAGE對糖尿病大鼠骨代謝紊亂的影響

李健，劉亞平，郭洪敏，聶志奎

(1.濟寧市第一人民醫院骨關節科，山東 濟寧 272100；2.濟寧市第一人民醫院內分泌二科，山東 濟寧 272100)

RAGE對糖尿病大鼠骨代謝紊亂的影響

李健1，劉亞平2，郭洪敏1，聶志奎1

(1.濟寧市第一人民醫院骨關節科，山東 濟寧 272100；2.濟寧市第一人民醫院內分泌二科，山東 濟寧 272100)

目的 觀察糖尿病大鼠的骨代謝特點及骨組織糖基化終產物變體的表達。方法 采用高糖高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素誘導建立糖尿病大鼠模型，20周后處死大鼠，測定骨生物力學以及糖化血紅蛋白A1c、血清晚期糖基化終產物、空腹血糖、血清胰島素，紫外熒光分光光度計測定大鼠血清糖基化終產物含量。實時聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測大鼠骨組織糖基化終產物變體表達。結果 與正常對照組相比，糖尿病組大鼠和Goto-kakizaki組大鼠的糖化血紅蛋白A1c、血清糖基化終產物、空腹血糖、胰島素均顯著升高，而骨生物力學指標均顯著降低，糖尿病組大鼠和Goto-kakizaki組大鼠骨組織均檢測到糖基化終產物變體表達。結論 糖尿病大鼠和Goto-kakizaki大鼠的骨量和骨強度下降，骨折危險性增加，糖基化終產物及變體相互作用參與糖尿病骨代謝紊亂的發生發展。

糖尿??；大鼠；骨生物力學；晚期糖基化終產物受體

近來有研究指出骨組織中晚期糖基化終產物(Advanced glycation end-products，AGEs)的積累可能是骨細胞功能受損和骨重建障礙的原因之一。糖尿病患者體內AGEs變體(receptors of AGEs，RAGE)高水平表達，AGEs-RAGE軸是否干擾糖尿病骨代謝及機制目前尚不明確。本研究采用高脂高糖飼養聯合小劑量鏈脲佐菌素的方法制備糖尿病雄性大鼠模型，結合骨生物力學等指標，觀察糖尿病大鼠骨代謝的特點及骨組織RAGE的表達。

1 資料與方法

1.1 材料 山東大學實驗動物中心提供3個月齡健康雄性Wistar大鼠30只，平均體重(282.94±13.22)g，并提供普通飼料和高糖高脂飼料[1]。用0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH4.2)配成2%鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液，經濾菌器除菌。

1.2 方法

1.2.1 造模 大鼠按體重號隨機分為兩組，取6只作正常對照組喂普通飼料。余24只大鼠作糖尿病造模組，高糖高脂飼料喂養8周(不限每日熱量)，禁食12 h后左下腹腔一次性注射STZ(30 mg/kg)，正常對照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。STZ注射1周后造模組尾靜脈行腹腔內葡萄糖耐量試驗(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)[2]，以空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)≥7.0 mmol/L，或糖負荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L者為糖尿病造模成功鼠[3]。實驗結束時，納入7只6個月齡糖尿病Goto-kakizaki(GK)大鼠作陽性對照組。

1.2.2 觀察指標 成模后所有大鼠每周測隨機血糖，共觀察20周。實驗結束時，大鼠空腹8 h后頸動脈穿刺取血處死，分離血清以檢測FPG(比色法，日立7 180全自動生化分析儀)，血清胰島素(放免法，天津九鼎)，抗凝血糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)A1c(比色法，南京建成生物工程研究所)，完整離斷左側股骨，仔細剝離軟組織，做腰椎壓縮和股骨三點彎曲試驗(日本島津AG-1S萬能材料試驗儀)。血液離心，取血漿0.2 mL，蒸餾水稀釋至2 mL，測定熒光值(日本島津RF5301PC型紫外熒光分光光度計)，考馬斯亮藍法測定稀釋液的蛋白質濃度，用U/mg prot表示血漿AGEs水平[4]，以此間接反映骨組織AGEs含量。實時聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測骨組織RAGE的表達。

2 結 果

2.1 大鼠血清AGEs、GHbA1c、胰島素的變化 剔除因感染死亡和造模未成功的大鼠，入選糖尿病組大鼠為10只。高糖高脂飲食聯合STZ注射后造模組大鼠血糖明顯升高并且高血糖癥持續存在。與正常組比較，糖尿病組大鼠和Goto-kakizaki組大鼠AGEs、GHbA1c、空腹血糖、胰島素及穩態模式評分法測定胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)均顯著升高(P<0.01)，而糖尿病組和Goto-kakizaki組大鼠各指標無顯著差異(見表1)。

2.2 大鼠骨生物力學指標的變化糖尿病組大鼠和Goto-kakizaki大鼠股骨三點彎曲試驗和腰椎壓縮試驗各觀察指標均顯著低于正常對照組(P<0.05或P<0.01，見表2)。

表1 三組大鼠AGEs、HbA1c、空腹血糖、胰島素和HOMA-IR的比較

表2 三組大鼠股骨三點彎曲試驗和腰椎(L5)壓縮試驗的變化

2.3 相關分析 糖尿病組大鼠血清AGEs與股骨最大載荷、彈性模量、最大彎曲應力及腰椎最大載荷、彈性模量均呈顯著負相關(r=-0.413，-0.511，-0.503，-0.442，-0.427，P<0.05)，Goto-kakizaki大鼠組血清AGEs與與股骨最大載荷、彈性模量、最大彎曲應力及腰椎最大載荷、彈性模量均呈顯著負相關(r=-0.401，-0.483，-0.517，-0.482，-0.502，P<0.05)。

2.4 RT-PCR檢測大鼠骨組織RAGE的表達 糖尿病組和Goto-kakizaki大鼠組均檢測到骨組織RAGE的表達，正常對照組未檢測到RAGE表達(見圖1)。

3 討 論

傳統利用高糖高脂制備的特殊膳食或多次小劑量STZ腹腔注射誘導建立的2型糖尿病大鼠模型均存在造價高、建模周期長的缺點[5，6]，目前多采用上述兩種方法結合誘導2型糖尿病大鼠模型的建立。該模型具有血糖、GHbA1c升高，胰島素抵抗，脂代謝紊亂的特點[7]，比較接近人類2型糖尿病的病理過程，并且價格低、易操作、造模時間短、成功率高及相對穩定，為研究糖尿病急慢性并發癥的良好模型。Goto-kakizaki大鼠是未經人為干預的2型糖尿病動物模型，具有自發性高血糖、胰島素抵抗，本實驗以Goto-kakizaki大鼠作為陽性對照，觀察兩種糖尿病模型鼠骨代謝特點。

本實驗前期結果發現糖尿病組和Goto-kakizaki大鼠組的股骨和腰椎BMD均顯著下降，但是BMD不能反映骨質量[7]，骨的力學特征是反映骨質量的重要指標[8，9]，力學性能下降可導致骨折發生率增高。近來諸多橫斷面流行病學報道BMD正?；蛟龈叩?型糖尿病患者，其脆性骨折發生率增高[10，11]，究其原因可能與糖尿病患者骨量減少導致骨質量下降有關[12]。Burghardt等[13]采用高分辨率外周定量計算機斷層成像技術(HR-pQCT)掃描19 例絕經后2型糖尿病患者橈骨遠端和脛骨，評估BMD、骨小梁微結構、機械性能等指標，發現與對照組比較，10%糖尿病患者BMD增高，但最大載荷、彎曲應力、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著下降，既往有骨折史的患者，其皮質骨及骨小梁較無骨折史的顯著減少。本實驗觀察到，糖尿病組和Goto-kakizaki大鼠組的股骨三點彎曲實驗和腰椎壓縮實驗指標均顯著下降，骨組織形態計量學指標中的骨小梁相對體積、骨小梁厚度、骨小梁數量明顯下降，骨小梁分離度明顯增加，反映骨形成活力的指標(骨形成率、骨礦化沉積率)顯著降低，而反映骨吸收活躍程度的指標(內陷表面)顯著升高[7]，提示兩組大鼠的骨量和骨強度下降，骨折風險增加。

1 2 M 3

1—Goto-kakizaki大鼠組；2—糖尿病組；3—正常對照組

圖1 RT-PCR檢測大鼠骨組織RAGE的表達

蛋白質的非酶糖基化參與糖尿病的發病過程。AGEs是不同種類的復雜大分子物質，包括羧甲基賴氨酸(carboxymethyl-lysine，CML)、戊糖素、咪唑酮等，氧化應激產物也加劇體內AGEs生成。在小鼠未分化骨細胞體外培養物中，AGEs增強破骨細胞介導的骨吸收[14]，體內注射CML修飾后的膠原可刺激顱骨骨膜細胞凋亡[15]，此外在骨質疏松患者血清及尿標本中檢測AGEs水平明顯升高[16]，與Hein等[17]研究結果一致，提示骨質疏松本身與體內AGEs積累有關。Hein同時發現骨質疏松患者血清戊糖素與侵蝕面、礦化表面、礦化沉積率之間存在顯著正相關，說明AGEs先促使破骨細胞的激活，進而促使成骨細胞活化。本研究通過檢測血清AGEs含量，以此間接反映骨組織AGEs含量，結果顯示糖尿病大鼠和Goto-kakizaki大鼠的AGEs和GHbA1c水平明顯升高，證實兩組大鼠體內非酶糖基化作用增強，并且兩組大鼠的血清AGEs與骨生物力學指標均呈顯著負相關，以上提示AGEs的增多可能是骨細胞功能損傷、骨重建障礙的原因之一。

體內AGEs受體眾多，目前研究較為明確與糖尿病密切相關的是RAGE，大量證據顯示AGEs-RAGE相互作用參與動脈粥樣硬化及糖尿病微血管病的發生。RAGE在體內多種細胞中表達，比如內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、成骨細胞、破骨細胞等，并且在健康動物體內較低水平表達，而糖尿病者顯著高水平表達。Santana等[18]發現1型糖尿病大鼠缺損顱骨的愈合程度較非糖尿病鼠下降了40%，并且骨愈合部位RAGE表達顯著上調，與Chang等[19]研究結果相似。另外，在非糖尿病鼠骨缺損部位分別加入CML鼠血清白蛋白(MSA)后，其骨愈合延遲，提示炎癥和氧化應激上調成骨和破骨細胞NF-κB途徑，激活AGEs-RAGE軸，延緩骨缺損的愈合[20]。Ding等[21]發現，與野生鼠相比，RAGE敲除鼠的骨強度和骨量增加，破骨細胞數量減少。國內有報道糖尿病狀態下過多的AGEs通過與RAGE結合干擾骨細胞IGF-1表達，后者作用于偶聯骨重建的OPG/RANKL/RANK軸，從而干擾糖尿病骨代謝。本實驗RT-PCR檢測到糖尿病組和Goto-kakizaki大鼠組骨RAGE的表達，與國內外研究結果一致。

Yasuhiro Hamada[22]等選用RAGE敲除鼠(RAGE-KO)、野生鼠(WT)，利用STZ造模并將大鼠分為四組，分別為WT非糖尿病組(N-WT)、RAGE-KO非糖尿病組(N-RAGE)、WT糖尿病組(D-WT)、RAGE-KO糖尿病組(D-RAGE)，研究各組大鼠股骨生物力學特性及脛骨組織形態計量學指標，觀察到與N-WT組相比，由于生理狀態下無AGEs積聚，N-RAGE組的體重、GHbA1c水平、骨形成參數(類骨質表面、骨形成率、礦化沉積率)無差異，但BMD升高、骨吸收參數(破骨細胞表面、破骨細胞數/骨周長)顯著下降，提示RAGE缺陷鼠的破骨細胞功能下降，導致BMD升高，與Ding研究結果一致。相反，給予D-RAGE組和D-WT組大鼠行股骨X線拍片，發現嚴重骨質減少，并且BMD、骨形成及吸收參數均下降，似乎預示糖尿病狀態下RAGE缺陷不參與骨重建紊亂的過程。但RAGE在體內有多個剪接變體，比如去掉N末端的RAGE變異體無法與AGEs結合，因為該片段包含的V型區是RAGE與配體結合介導細胞信號轉導的關鍵結構，再者循環中存在的可溶型RAGE(the soluble form of RAGE，sRAGE)是去掉C末端的RAGE變異體，可與AGEs競爭性與RAGE結合，在糖尿病血管并發癥和動脈粥樣硬化中有保護性作用。Lalla[23]利用sRAGE與RAGE結合后，報道AGEs阻斷劑可顯著減少糖尿病大鼠牙槽骨的骨丟失。上述這些RAGE形式是獨立于經典RAGE信號傳導途徑發揮生物學作用，因此只有RAGE敲除鼠模型的設計能僅針對敲除細胞表面的RAGE或者成骨細胞、破骨細胞表達的RAGE，那么AGEs-RAGE軸在糖尿病骨代謝過程中的詳細機制才能明確。

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Effect of RAGE on Bone Metabolic Disorders in Diabetic Model of Rats

Li Jian1，Liu Yaping2，Guo Hongmin1，etal

(1.Department of Orthopaedics，Jining the First People′s Hospital，Jining 272100，China；2.2nd Department of Endocrinology，the First People′s Hospital，Jining 272100，China)

Objective To observe the bone metabolic characters in diabetic model of rats and bone expressions of RAGE.Methods Diabetic model of male rats was set up by feeding high-glucose and high-fat diet and injecting intraperitoneally with a low-dose streptozotocin(STZ).All rats were sacrificed after 20 weeks.The biomechanical indexes，glycosylated hemoglobin(GHb)A1c，serum advanced glycation end-products，fasting plasma glucose，fasting serum insulin were measured.Serum AGEs were measured with fluorospectrophotometer.RAGE was measured with RT-PCR.Results Compared with normal control group，the level of GHbA1c、serum AGEs、FPG、FINS of male diabetic model of rats and Goto-kakizaki rats markedly increased，and the biomechanical indexes markedly decreased.RAGE was detected by RT-PCR in diabetic male rats and Goto-kakizaki rats.Conclusion Bone mineral density and bone strength decreased，and risk of fracture increased in diabetic male rats and Goto-kakizaki rats.AGEs-RAGE interaction contribute to disturbed bone remodeling.

diabetes mellitus；rats；bone biomechanics；advanced glycation end-products

1008-5572(2015)07-0618-04

R587.1

A

2015-01-15

李健(1979- )，男，醫師，濟寧市第一人民醫院骨關節科，272100。