葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠用于皮膚淋巴管顯影的研究

王海珍， 戴婷婷， 崔春曉， 周淑彥， 蔣朝華， 竇紅靜

葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠用于皮膚淋巴管顯影的研究

王海珍， 戴婷婷， 崔春曉， 周淑彥， 蔣朝華， 竇紅靜

目的 探討葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠用于皮膚微淋巴管顯影的可行性和生物安全性。方法 應用葡聚糖和聚丙烯酸為原料，合成熒光納米凝膠，采用掃描電鏡和納米粒度電位分析儀測定其表征。注入小鼠趾蹼皮下，在熒光顯微鏡下觀查小鼠下肢皮膚淋巴管走行和分布。1個月后，取其肝臟、腎臟、脾臟及心臟，進行HE染色病理組織學檢查，驗證其是否具有生物安全性。結果 葡聚糖和聚丙烯酸通過自組裝一步法合成了熒光納米凝膠，控制其粒徑約為180 nm，皮下注射能夠被皮膚淋巴管吸收，并清晰準確地顯示和定位皮膚淋巴管，示蹤出皮膚淋巴管的走行和分布。組織學分析證實，遠期未發現重要組織器官的病損。結論 葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠能夠應用于皮膚淋巴管的顯影，可以清晰地示蹤皮膚淋巴管的走行和分布，并具有生物安全性。

熒光納米凝膠； 淋巴管； 淋巴造影； 生物安全性

皮膚淋巴管參與了眾多疾病的病理過程，對皮膚淋巴管的研究有助于闡明其在淋巴管相關疾病病理過程中的作用機制[1]。因此，通過示蹤皮膚淋巴管來研究皮膚淋巴管的走行和分布特征具有十分重要的臨床意義。選擇合適的造影劑是皮膚淋巴管成像的關鍵[2]。近年來，熒光納米凝膠由于其生物親和性良好，粒徑適中而開始應用于生物顯影[3-4]。葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠(fluorescent dextran-based nanogels， FDNG)是由葡聚糖和聚丙烯酸按照一步法自組裝的方式合成的大分子熒光納米凝膠[3,5]。這種大分子凝膠因其合適的粒徑，高熒光強度和生物親和性，已成功用于脂肪間充質干細胞的示蹤顯影[6]和前哨淋巴結的示蹤，但能否應用于皮膚淋巴管顯影，尚未見文獻報道。筆者通過用FDNG注射小鼠趾蹼皮下研究小鼠下肢皮膚淋巴管的走行分布，探討其應用于皮膚淋巴管顯影的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 C57小鼠，由上海斯萊克實驗動物中心提供；葡聚糖(dextran，分子量40 000)分析純(analytical reagent, AR)、丙烯酸(acrylic acid，AA)，國藥集團化學試劑有限公司；無水硫酸鎂(干燥過夜經減壓蒸餾提純后使用)；5-氨基熒光素(Fluoresceinamine，isomer Ⅰ， 5-AF)，美國SIGMA公司；10%水合氯醛,深圳市騰龍源實業有限公司；倒置相差顯微鏡(TS-100型)、熒光顯微鏡,日本OLYMPUS公司；數碼照相機(DXM-1200),日本NIKON公司。

1.2 葡聚糖-聚丙烯熒光納米凝膠的制備 FDNG由葡聚糖-聚丙烯納米凝膠(dextran-based nanogels，DNG)與熒光介質5-AF采用自組裝一步法合成(由上海交通大學材料學院提供)。具體合成方法如下：取25 ml葡萄糖的儲備液，用注射器加入一定量的引發劑硝酸鈰銨，5 min后用微量進樣器加入反應單體丙烯酸，30 min后再加入交聯劑亞甲基雙丙烯酸酰胺；反應結束后，制備得到DNG；再通過酰胺縮合反應將帶有氨基的5-AF偶聯到DNG上，從而得到FDNG[3,5,7]，見圖1。

1.3 材料的表征 ⑴FDNG的形態觀察。納米凝膠經磷鎢酸負染后，通過透射電子顯微鏡觀察形態。將1 mg/ml納米凝膠的水溶液滴加在附有碳膜的銅網上，干燥后，用2%的磷鎢酸溶液(pH 6.0)染色2 h，用濾紙吸去染液，透射電子顯微鏡觀察。⑵FDNG粒徑的測量。納米凝膠的流體力學直徑及分布，通過動態光散射法在納米微粒電位分析儀(Malvern Zetasizer Nano ZS90)上測量獲得。除非特別指出，所有測定均在25 ℃下水溶液中進行，測定濃度為1 mg/ml。所有結果均為至少3次測定結果的平均值。

1.4 活體小鼠皮膚微淋巴管顯影 小鼠經腹腔注射10%水合氯醛(5 ml/kg)麻醉后，使用脫毛膏將其下肢毛發脫去。經后爪皮下注射FDNG(1 mg/ml， 20 μl)，輕揉注射部位片刻，置熒光顯微鏡下觀察，對其下肢皮膚的微淋巴管通路進行原位成像。

1.5 生物安全性評估 在C57小鼠注射FDNG進行皮膚微淋巴管顯影1個月后，將小鼠用過量CO2氣體麻醉處死，對其解剖，取其肝臟、腎臟、脾臟和心臟，用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋等。對上述器官進行HE染色，觀察其形態學和組織學的改變。

2 結果

2.1 FDNG的表征 經過5-AF修飾的DNG的粒徑分布仍然較窄，PDI在0.2左右，粒徑較未經熒光修飾的納米凝膠粒徑稍大，掃描電鏡檢測脫水后的粒徑為30～50 nm；動態光散射檢測DNG粒徑約為113 nm，FDNG的粒徑約為180 nm(圖2)。

2.2 活體小鼠皮膚微淋巴管顯影 小鼠下肢趾蹼皮下注射FDNG后，發現FDNG能夠被皮下淋巴系統迅速吸收并進入下肢微淋巴管循環，在熒光顯微鏡下，活體小鼠的下肢皮膚中清晰地顯示出真皮微淋巴管的走向和分布(圖3)。

2.3 體內生物安全性評估 小鼠注射FDNG 1個月后，對肝臟、腎臟、脾臟和心臟進行組織學檢測，未發現形態學和病理學的改變(圖4)。

3 討論

對皮膚淋巴管的研究，近年來一直進展緩慢，很大程度上可能因為缺乏理想的淋巴管顯影手段。皮膚淋巴管的走行分布、收納范圍和回流淋巴結等問題，國內外均鮮有報道。有文獻報道利用淋巴管內皮特異性免疫組化染色標記淋巴管的方法[7-9]，可以精確標記淋巴管。但是該方法對于觀察單張切片和小范圍情況下的淋巴管有效，而且工序繁多，無法連續觀察，且大體情況下無法辨認淋巴管，因此不適用于觀察皮膚整體淋巴管走行和分布特征。亞甲藍直接淋巴管造影法，因其必須暴露在解剖視野中，限制了其應用[10]；同位素淋巴管影像學造影方法因為存在放射污染有一定的局限性[11]。目前，對于皮膚淋巴管的分布走行特征缺乏有效的觀察方法。因此，有必要找到一種合適的方法，既能準確判斷是否為淋巴管，又能準確定位皮膚淋巴管的位置，且能夠觀察皮膚淋巴管整體分布和走行及其回流情況等。

一般認為，一種好的淋巴管示蹤劑應該具備：⑴對淋巴組織的特異性；⑵被淋巴組織吸收快，并能清楚地顯示出淋巴管；⑶在淋巴管中能夠滯留較長時間；⑷成本低，無毒性。本實驗采用的納米凝膠是由物理或者化學交聯的聚合物網絡組成的水凝膠顆粒[12]，它是一種納米尺度的水分散體，水中穩定性高[13]，而且采用葡聚糖和聚丙烯酸制備，原料價格低廉，成本低，生物相容性好，毒性小，接載熒光素后熒光強度高，利于在熒光顯微鏡下觀測[14]。由于其粒徑可控，我們合成后將其粒徑控制在180 nm左右，使其滿足只進入淋巴管而不進入血管的條件，因此，將其注入趾蹼皮下后，FDNG能夠只走行于淋巴管中，而不會與血管混淆，我們可以在熒光顯微鏡下清晰準確地觀測活體小鼠下肢皮膚中淋巴管的走行和分布?；谝陨蠋c，我們證明了FDNG可以用于皮膚淋巴管的顯影，示蹤皮膚淋巴管的走行和分布。但是，若應用于臨床，還需要生物安全性的保證。因此，我們對小鼠皮下注射FDNG1個月后，對其肝臟、腎臟、脾臟和心臟進行組織學的檢測，HE染色證實，重要器官并未發生形態學和組織學的改變，表明FDNG在體內不會引起遠期的器官損害，從一定程度上闡明了應用的生物安全性。

圖1 FDNG的制備 圖2 FDNG的表征 a.FDNG的掃描電鏡圖像 b.DNG和FDNG的粒徑分布 圖3 小鼠下肢皮膚微淋巴管的活體成像 a. 熒光顯微鏡下小鼠下肢皮膚成像 b. 熒光顯微鏡下小鼠下肢皮膚微淋巴管影像(綠色熒光所示) 圖4 小鼠體內注射FDNG1個月后肝臟、腎臟、脾臟和心臟的形態學和組織學變化(HE ×100)

Fig 1 Prepare of FDNG. Fig 2 Exosyndromes of FDNG. a. transmission electron microscopy images of FDNG. b. size distributions of DNG and FDNG. Fig 3 Images of micro lymphatic vessels in mouse lower extremity skins after injection of FDNG in vivo. a. images of lower extremity skin under fluorescence microscope. b. images of micro lymphatic vessels of the skin under fluorescence microscope (green). Fig 4 Histological and morphological changes of liver, kidney, spleen, and heart at 1 month after FDNG injection (HE ×100).

綜上所述，使用熒光納米凝膠示蹤法研究皮膚淋巴管的走行和分布，將為皮膚病理生理研究提供一種有效的檢測手段。雖然熒光納米凝膠作為淋巴示蹤劑，體現出許多優勢，但是在熒光成像的過程中，當受到激發光激發時，生物體部分其他物質會產生熒光，例如皮膚和毛發等。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度降低，因此，如何避免生物樣品的背景熒光干擾，將成為我們今后實驗中進一步深入探討和研究的內容。

葡聚糖-聚丙烯熒光納米凝膠具有合適的粒徑，能夠特異性示蹤皮膚淋巴管的走行和分布，同時具有較好的生物安全性，為其臨床應用提供了保證。

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Experimental research of dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel for skin lymphangiography

WANGHai-zhen,DAITing-ting,CUIChun-xiao,etal.

(DepartmentofDermatology,ShangqiuCentralHospital,Shangqiu476000,China)

Objective To investigate the feasibility and biosafety of fluorescent dextran-polyacrylic nanogels (FDNG) for the skin lymphangiograph. Methods Dextran and polyacrylic acid was used as raw material to synthesize fluorescent nanogel. The characteristics of FDNG were detected by Zetasizer Nano ZS90 and scan electronic microscope. FDNG was injected into subcutaeous of mouse toe web to observe the distribution and pattern of lymphatic vessels under fluorescence microscope. One month later, tissues of liver, kidney and heart tissue were harvested and examined by HE staining to testify whether there were pathological changes. Results The dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel was synthesized with dextran and polyacrylic acid by self-assembly one-step method, the synthesized particle diameters were around 180 nm. Pattern and distribution of skin lymphatic vessels could be clearly visualized after subcutaneous injection. The histological analysis showed that No pathological changes were found in important organs. Conclusion The dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel can clearly trace the distribution and pattern of skin lymphatic vessels with reliable biosafety.

Fluorescent nanogel; Lymphatic vessel; Lymphangiography; Biological safety

國家自然科學基金資助項目(81372080/21374061); 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院基金資助項目(2013B02)

476000 河南 商丘，商丘市中心醫院 皮膚科(王海珍);上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 整形外科(戴婷婷,崔春曉,蔣朝華);上海交通大學 材料科學與工程學院金屬基復合材料國家重點實驗室(周淑彥,竇紅靜)

王海珍(1975-)，女，河南人，副主任醫師，博士.

蔣朝華，200011，上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 整形外科，電子信箱：zhhjiang@163.com；竇紅靜，200240，上海交通大學 材料科學與工程學院金屬基復合材料國家重點實驗室，電子信箱：hjdou@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.06.020

R446

A

1673-7040(2015)06-0375-04

2015-03-17)