葡萄二倍體與四倍體雜交胚挽救技術中珠被處理方式的研究

陳三春 ，張 娜 ，武書哲 ，田淑芬

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津市農業科學院葡萄研究中心，天津 300192；3.天津市葡萄遺傳與育種企業重點實驗室，天津 300192）

選育優質無核葡萄是現代葡萄育種的研究熱點。20世紀80年代以前的無核品種中，70%左右都是通過有性雜交獲得的，即以無核品種做父本，有核品種做母本雜交組合中選育出來的，這種選育無核葡萄品種的方式預選困難且效率低下。1982年美國育種學家Ramming和Emershad[1]改變了傳統育種模式，創立了無核胚挽救技術，利用胚挽救技術，雖然可以進行無核與無核品種之間的雜交，但親本選擇范圍較小。三倍體育種為無核葡萄育種開辟了新途徑，即采用二倍體和四倍體雜交獲得三倍體后代，三倍體具有高度不育性，從而提高后代無核效率，三倍體育種是獲得大粒無核葡萄的重要育種途徑，但仍存在著植株形成率低，技術不完善等問題。

本研究以玫瑰香優系（歐亞種，二倍體，該優系適應性強、豐產、抗病性強，天津市農科院葡萄研究中心通過分子標記和田間選種結合的方法鑒別篩選出，較普通玫瑰香品種香氣濃郁，果穗松緊度適中，果粒均勻）為母本，以戶太8號和巨峰為父本，通過雜交進行玫瑰香型大粒無核葡萄的篩選，研究取樣時期、剝胚和剪喙不同處理方式對兩種雜交組合胚挽救的影響，為三倍體育種技術提供參考。

1 試材與方法

1.1 試驗材料

試驗于2014～2015年在天津市農業科學院葡萄研究中心、天津市葡萄遺傳與育種企業重點實驗室進行。供試材料為玫瑰香與戶太8號雜交胚珠、玫瑰香與巨峰雜交胚珠。

1.2 方法

在初花期采集父本的花粉，花前3～4d母本去雄，柱頭上開始分泌粘液時授粉，以24h為間隔連續授粉3次。自葡萄授粉后35d起，每隔10d調查1次胚珠發育狀況，即隨機取15粒果實，稱其漿果單粒重，然后剝開果實取出胚珠，稱取胚珠的平均重量并統計漿果內平均胚珠數，連續取樣3次，將取樣果粒在自來水中洗凈后，置于超凈工作臺上，先用75%的酒精浸泡45s，無菌水沖洗1次，再在3%的次氯酸鈉溶液中浸泡3min，無菌水沖洗3次。切開漿果，取出胚珠，接種在培養基上。

1.2.1 雜交果實胚珠重量、胚珠數量變化觀察

取玫瑰香×戶太8號、玫瑰香×巨峰葡萄授粉后35、45、55d的果粒，每個取樣時期隨機選取15粒果實，稱其漿果單粒重，然后剝開果實取出胚珠，稱取胚珠的平均重量并統計漿果內平均胚珠數，并進行統計比較。

1.2.2 不同接種時間對胚發育的影響

取玫瑰香×戶太8號、玫瑰香×巨峰葡萄授粉后35、45、55d的雜交胚珠在胚珠發育培養基上培養60d后進行剝胚處理，調查胚發育的情況，并進行統計比較。

1.2.3 不同培養方式對幼胚萌發率的影響

分別取授粉后45d和55d玫瑰香×戶太8號、玫瑰香×巨峰雜交胚珠在發育培養基上培養60d后，分別進行剝胚和剪喙處理，轉入胚萌發培養基，并統計胚萌發率、成苗率以及畸形苗率。

胚珠培養采用的ER培養基（0.5mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，1g/L活性炭，pH5.8，5g/L瓊脂）。胚萌發過程中采用剝胚和剪喙兩種處理方法，在WPM培養基（0.2mg/L6-BA，30g/L蔗糖，1g/L活性炭，5g/L瓊脂，pH5.8）上培養，30d后調查胚成苗情況。

分別統計接種胚珠數、胚發育率、胚萌發率、胚成苗率和畸形苗率，計算方法如下：

胚發育率=（發育胚數/接種胚珠數）×100%；胚萌發率=（萌發胚數/接種胚珠數）×100%；成苗率為=（正常苗數/萌發胚數）×100%；畸形苗率（畸形苗數/萌發胚數）×100%。

2 結果與分析

2.1 雜交果實胚珠重量、胚珠數量變化觀察

由表1可以看出：在授粉后35～55d，隨著取樣時間延遲，玫瑰香×戶太8號雜交果實平均重量持續增加，而雜交胚珠平均重量則呈先減后增趨勢，單粒漿果內平均胚珠數逐漸減少。玫瑰香×巨峰雜交果實平均重量先增后減，雜交胚珠重則呈先減后增趨勢，單粒漿果內平均胚珠數逐漸減少。

表1 不同接種時期果實重、胚珠重及胚珠數的觀察

2.2 不同接種時間對胚發育的影響

由表2可以看出：隨取樣時間的延遲，玫瑰香×戶太8號、玫瑰香×巨峰胚珠內胚發育率總體呈增長趨勢，在授粉后55d胚發育率均達到最高；在授粉后45～55d，兩個雜交組合胚珠內胚發育率呈明顯上升趨勢。在相同的采樣時間，玫瑰香×戶太8號胚發育率均高于玫瑰香×巨峰，不同的父本基因型對胚發育率也有一定的影響。

表2 不同取樣時期對胚發育率的影響

2.3 不同培養方式對幼胚萌發率的影響

由表3可以看出：不同取樣時間，玫瑰香×戶太8號胚珠內胚萌發率剝胚處理高于剪喙處理，而玫瑰香×巨峰胚珠內胚萌發率剝胚處理低于剪喙處理；兩個雜交組合的成苗率剪喙處理均高于剝胚處理，畸形苗率則是剝胚處理均高于剪喙處理；隨著取樣時期推遲，兩個雜交組合的剝胚處理胚萌發率、成苗率均上升，畸形苗率下降；玫瑰香×戶太8號剪喙處理胚萌發率、成苗率先升高后降低，玫瑰香×巨峰胚萌發率升高，成苗率則先升高后降低；在胚挽救過程中，兩個雜交組合，采取剪喙處理雜交胚更容易獲得正常苗，因此剪喙為較好的處理方式；玫瑰香×戶太8號和玫瑰香×巨峰在授粉后45d經剪喙處理更容易獲得正常苗，因此授粉后45d為較好的取樣時期。

表3 不同處理方法對胚萌發胚成苗的影響

3 討論與結論

確定胚珠接種的最佳時間是胚挽救成功的前提。關于葡萄二倍體與四倍體的取樣時間，Yamashita等[2-3]和Okamoto等[4]報道的時間基本集中在授粉后50～70d。徐海英等[5]研究表明葡萄二倍體與四倍體雜交胚發育進程與無核品種有顯著不同，同一品種內存在果粒大小不整齊及同一果實中胚珠發育程度不一致現象，根據胚珠重量繪出的胚珠生長曲線有些表現呈無規則，葡萄二倍體與四倍體雜交胚珠敗育是漸進性的，發生敗育的時間與母本成熟期有明顯的關系，不同倍性的有核品種間雜交胚珠的敗育存在明顯的個體間差異。本研究中兩個雜交組合果實重和胚珠重表現有些無規則，而從胚珠數呈持續降低趨勢可以看出，在授粉后35d起，兩組雜交組合胚珠敗育逐漸增強。

葡萄的外種皮對于發育不完全胚存在著機械阻礙[6]，影響胚的萌發。眾多研究學者認為，對葡萄珠被進行一定的處理，可以提高無核葡萄胚的萌發及成苗率。Fernandez[7]對無核與無核雜交胚珠分別采用了3種珠被處理方式，直接進行胚珠培養獲得幼苗，對于胚珠進行切喙處理，剝取裸胚進行胚萌發培養。結果顯示：剝取裸胚萌發率顯著高于其他兩種處理，最高可達67%。而經過切喙和胚珠直接培養胚萌發率僅為0～15%，E－mershad[8]、Ramming[9]、Spigel-Rol[10]、Cain[11]等采用胚珠培養再剝取裸胚培養來提高無核葡萄的胚挽救成功率。郭印山等[12]對二倍體與四倍體葡萄雜種胚珠采取橫切的方法獲得了三倍體植株，郭海江、王躍進等[13]采取剝取裸胚的方法獲得了大量的雜種后代。孟新法等[14]研究發現剝取裸胚，可以使胚萌發提前，萌發整齊，提高成苗質量，并且能直接判斷最后的成苗是合子胚還是體細胞胚。蔣愛麗等[15]研究認為：盡管采取剝胚得到的有胚率為最高，但是由于操作中易碰傷及其他原因，畸形苗占相當比例，所得正常的試管苗比不剝胚的還略低些。

本研究以玫瑰香×戶太8號、玫瑰香×巨峰雜交胚珠為試材，研究發現兩組雜交組合授粉后35d起，胚珠敗育逐漸增強，在授粉后55d取樣，胚發育率最高；經剪喙處理過的雜交胚珠成苗率高且畸形苗率低。在胚挽救過程中，兩個雜交組合，采取剪喙處理雜交胚更容易獲得正常苗，因此剪喙為較好的處理方式；玫瑰香×戶太8號和玫瑰香×巨峰，在授粉后45d經剪喙處理更容易獲得正常苗，因此授粉后45d為較好的取樣時期。

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