柱前衍生－手性高效液相色譜法測定 R－3－奎寧環醇的光學純度

袁明輝，鄭鴻聲，王東武，謝愛芳

(1.山東省威海市藥品檢驗所，山東 威海 264200;2.山東省威海市經區醫院心理科，山東 威海 264205;3.迪沙藥業集團，山東 威海 264200)

R－3－奎寧環醇化學名為1－氮雜環[2.2.2]辛 R－3－醇，是合成毒蕈堿受體拮抗藥，如索利那新、瑞伐托酯、他沙利定、阿地溴銨等的重要中間體[1－6]。其合成是以3－奎寧環酮為原料，經羰基還原生成(R，S)－3－奎寧環醇后，再經拆分而得[7－9]。拆分后的 R－3－奎寧環醇光學純度均通過測定旋光度再計算ee值進行描述[2，7－8，10]，然而旋光度法測定的光學純度影響因素較多，如偏振光波長、溶液的濃度、溫度及旋光性雜質，誤差較大[11]。隨著手性液相色譜技術的發展，高效液相色譜(HPLC)法已廣泛應用于對映體光學純度的測定[12－15]。有關 R－3－奎寧環醇的光學純度檢測的HPLC法至今尚未建立，主要原因一方面由于 R－3－奎寧環醇缺少發色基團，不適用于常規的液相色譜法檢測;另一方面，由于其手性中心缺乏能與手性色譜柱填料產生氫鍵、偶極－偶極作用、π－π作用或空間作用的基團，難以進行手性色譜法分離。為此，筆者開發了柱前衍生手性色譜法測定 R－3－奎寧環醇光學純度的方法。該方法利用柱前衍生化法，使(R，S)－3－奎寧環醇與苯甲酰氯反應生成(R，S)－3－奎寧環醇苯甲酰氯衍生物，即3－苯甲酸奎寧環酯，再利用手性液相色譜法進行光學純度測定，結果準確、可靠，可用于 R－3－奎寧環醇光學純度的準確測定。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、變色龍色譜工作站(美國戴安公司);1500型高效液相色譜儀，包括Module數據處理器、單元恒流泵、紫外檢測器、CSChrom Plus色譜工作站(美國SSI series公司);Thermal Syncronis C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);AD －H 手性色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，日本大賽璐 Chiralpak公司);恒溫水浴鍋(江蘇金壇科興儀器廠);電子恒速攪拌器(上海申生科技有限公司)。正己烷(天津市彪仕奇科技有限公司，批號為000405)，乙醇(天津市彪仕奇科技有限公司，批號為121210)均為色譜純;二乙胺(天津登科化學試劑有限公司，批號為20120925)，苯甲酰氯(江蘇強盛功能化學股份有限公司，批號為 20120502)均為分析純;R－3－奎寧環醇(純度不低于99.0%，批號為 SLNX－04－63－16－20)，(R，S)－3－奎寧環醇(3－奎寧環醇消旋體，純度不低于99.0%，批號為SLNX－01－63－12－30)均由迪沙藥業集團藥物研究院提供。

2 方法與結果

2.1 供試品衍生化法

2.1.1 3－奎寧環醇消旋體苯甲酰氯衍生化反應

衍生化過程:向已有20 mL二氯甲烷的反應瓶中加入1.0 g 3－奎寧環醇消旋體，水浴反應溫度保持在20～30℃，向反應瓶中先后加入0.47 g氫化鈉和2.22 g苯甲酰氯，直到薄層色譜(TLC)跟蹤原料反應完全。反應工藝流程見圖1。

圖1 (R，S)－3－奎寧環醇苯甲酰氯衍生化工藝流程圖

后處理過程:冰水浴條件下，向體系中滴加1 mol/L的鹽酸溶液，直至體系不放氣為止，取二氯甲烷相，水相用20 mL二氯甲烷萃取1次，合并有機相。有機相用10 mL飽和食鹽水洗滌1次，減壓濃縮干后得3－奎寧環醇的衍生化產物，即為(R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯。

2.1.2 R－3－奎寧環醇苯甲酰氯衍生化反應

取 R－3－奎寧環醇 1.0 g，按(R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯的衍生化過程和后處理過程，制得 R－3－苯甲酸奎寧環酯。

2.2 對照品溶液制備

分別稱取(R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯、R－3－苯甲酸奎寧環酯各適量，加乙醇溶解后配制成質量濃度約為0.2 g/L的溶液，作為(R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯對照品溶液、R－3－苯甲酸奎寧環酯對照品溶液。

2.3 樣品的液相色譜分析

2.3.1 (R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯的純度測定

液相色譜系統采用美國戴安UltiMate 3000型液相色譜系統。色譜柱:Thermal Syncronis C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:緩沖鹽(20 mmol/L乙酸銨，氨水調節 pH至7.50)－乙腈(70 ∶30);流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:232 nm;進樣量:20 μL。按擬訂方法對(R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯的純度進行測定，用面積歸一化法計算純度。由于(R，S)－3－奎寧環醇羥基空間位阻較大，衍生反應產率較低，起初未加入催化劑，衍生物產率僅為25%，后選氫化鈉作催化劑，大大提高了反應的產率，3－奎寧環醇苯甲酰氯衍生產物收率達95%，產物純度達98%，見圖2 A。采用擬訂方法對衍生產物(R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯色譜峰進行峰純度檢測。結果峰純度良好(匹配度為998，大于軟件的推薦值990)，為單一色譜峰，見圖2 B。

圖2 (R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯純度測定色譜圖及光譜圖

2.3.2 R－3－苯甲酸奎寧環酯的光學純度測定

色譜系統采用美國SSI series 1500型高效液色譜系統。色譜柱:日本大賽璐Chiralpak?AD－H手性色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:正己烷 － 乙醇 － 二乙胺(80 ∶20 ∶0.1)，配制后經0.45 μm 有機濾膜過濾，超聲脫氣;流速:1.0 mL/min;檢測波長:232 nm;進樣量:10 μL。首先對(R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯、R －3－苯甲酸奎寧環酯分別進樣分析，并進行系統適用性試驗。結果顯示，(R，S)－3－苯甲酸奎寧環酯達到良好分離(分離度 R≥4.0)，見圖3 A;與 R－3－苯甲酸奎寧環酯色譜圖(圖3 B)對比，確定RT=7.42 min為 S構型，RT=11.60 min為 R構型。

圖3 R－3－苯甲酸奎寧環酯純度測定色譜圖

2.3.3 R－3－奎寧環醇的光學純度測定

取 R－3－奎寧環醇樣品約1.0 g，按擬訂方法進行衍生化反應，制備3－苯甲酸奎寧環酯。稱取衍生化所得樣品適量，配成質量濃度約為0.2 g/L的溶液，作為供試品溶液。按擬訂方法對供試品溶液進行分析。結果 R－3奎寧環醇樣品的光學純度為96.66%，見圖 4。

圖4 R－3－苯甲酸奎寧環酯樣品光學純度色譜圖

3 討論

3.1 衍生化反應條件

衍生化試驗初始條件:向已有20 mL二氯甲烷的反應瓶中加入3－奎寧環醇消旋體1.0 g，水浴保持反應溫度為20～30℃，向反應瓶中加入苯甲酰氯2.2 g，觀察薄層色譜跟蹤原料反應情況。結果顯示，反應緩慢，產率低。將水浴溫度提高至40℃，反應仍緩慢;后加入氫化鈉以改變反應條件，結果反應大大加速，收率得到很大提高，表明在反應條件中引入氫化鈉可促進反應。

3.2 手性高效液相色譜法開發

本研究中，采用Daicel AD－H手性色譜柱建立了正相色譜條件下分離3－奎寧醇苯甲酰氯衍生物對映異構體的方法，該方法簡單、方便，在開發過程中考察了有機改性劑對手性分離的影響。結果顯示，流動相中添加0.1%二乙胺后，一對對映異構體色譜峰拖尾明顯改善，峰形較對稱;流動相中添加0.1%三氟乙酸后無明顯變化;流動相中同時添加0.1%二乙胺和0.1%三氟乙酸后，一對對映異構體色譜峰與單獨添加0.1%二乙胺所產生的色譜峰幾乎無差別。故本試驗選擇正己烷－乙醇－二乙胺(80∶20∶0.1)為流動相。

本試驗中通過(R，S)－3－奎寧環醇苯甲酰氯衍生化，使(R，S)－3－奎寧環醇能夠用紫外檢測器進行檢測，引入的苯甲?；鶊F增強了其手性中心對手性色譜柱填料的辨識能力，使(R，S)－3－奎寧環醇的一對對映異構體 R－3－奎寧環醇和(S)－奎寧環醇在Daicel AD－H手性色譜柱上達到良好分離，建立了一種準確、可靠的測定 R－3－奎寧環醇光學純度的手性高效液相色譜法。

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