二苯甲酮衍生物對酪氨酸酶生物活性的影響*

劉 清，曾福燃，蔣匯鋒，馮安生，鄒訓重，游 遨

廣東輕工職業技術學院 生態環境技術學院，廣州510300

酪氨酸酶是一種廣泛分布于人、動物、植物以及菌類的含銅氧化酶，在結構上屬于Ⅲ型金屬酶[1，2]。酪氨酸酶與生物體內色素的生成有著直接關系，其在生物體內催化成L-酪氨酸生成L-多巴，進一步將L-多巴催化成L-多巴醌，最終多巴醌自我氧化生成黑色素[3]。人體內酪氨酸酶活性偏低將間接導致多種疾病，如白癜風、白化病以及神經退行性疾病等[4，5]。目前，用于治療白癜風和白化病的藥物大多來自中草藥提取物，例如提取自何首烏的2，3，5，4'-四羥基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（THSG）、提取自補骨脂和淫羊藿的補骨脂素、類黃酮、芹黃素等，而相關的化學合成藥物報道較少[6，7]。

二苯甲酮衍生物廣泛應用于現代工業，是一類重要的紫外吸收劑，主要應用于自由基紫外光固化清漆體系，如UV 涂料、UV 油墨等。還可用于防曬化妝品中的抗紫外線成分，以及用于醫藥行業生產苯乙烯聚合抑制劑以及各類香料的定香劑[8，9]?，F選取了11 種二苯甲酮衍生物，測試其對酪氨酸酶活性的影響，發現部分二苯甲酮衍生物表現出優異的酪氨酸酶激活活性。這一發現為酪氨酸酶激活劑拓展了一個新的研究方向。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2-羥基二苯甲酮、3-羥基二苯甲酮、4-羥基二苯甲酮、4-甲氧基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、4-甲基二苯甲酮、4，4′-二羥基二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4，4′-二氟二苯甲酮、3-甲氧基-4，4′-二羥基二苯甲酮（均購自上海麥克林生化科技有限公司）；蘑菇酪氨酸酶（比活力為6680 U·mg-1，購自美國Sigma 公司）；L-β-（3，4-二羥基）苯丙氨酸（L-DOPA，純度99%，）、L-酪氨酸（均購自英國Alfa Aesar 公司）；其他試劑均為國產分析純；水為去離子重蒸水。

UV-2501 紫外可見分光光度計（日本島津公司）；BPZ11D 型電子天平（Sartorius）。

1.2 測試方法[5，10]

于1.5 mL 離心管中加入890 μL 磷酸緩沖溶液（pH=6.8），隨后加入20 μL 不同濃度的化合物DMSO 溶液（控制DMSO 在體系中最終濃度為2%），然后加入10 μL 溶解于磷酸緩沖溶液的酪氨酸酶（濃度為0.5 mg·mL-1），搖勻，置于25 ℃恒溫水浴10 min。向離心管內加入80 μL 的L-DOPA 溶液（濃度為2 mg·mL-1），迅速振蕩搖勻，于25℃下進行測試。觀察溶液在475 nm 波長下的吸光度值（A 值）變化，時間3 min?？鄢彌_溶液本身對試驗的影響，根據A值增長曲線求出斜率，即為酶活力值。

酶的相對活性=K/K0×100%

K 為加入化合物時反應進程的直線斜率；

K0為不加化合物反應進程的直線斜率。

2 結果與討論

2.1 11 種二苯甲酮衍生物對酪氨酸酶活性的影響

在本實驗中，選取11 種二苯甲酮衍生物，測試其對酪氨酸酶的活性影響，結果見表1。所選化合物結構見圖1。

表1 11 種二苯甲酮衍生物對酪氨酸酶活性的影響

測試結果顯示，在選取的11 種二苯甲酮衍生物中，激活效果最好的兩種分別為4-羥基二苯甲酮與3-羥基二苯甲酮。4-羥基二苯甲酮、3-羥基二苯甲酮、2-羥基二苯甲酮與4，4′-二羥基二苯甲酮這四種化合物均在較低的濃度范圍內表現出強烈的酪氨酸酶激活活性，隨著濃度逐漸增大，其對酪氨酸酶的激活效果逐漸降低。有趣的是，當2-羥基二苯甲酮濃度超過300 μmol·L-1后，其對酪氨酸酶的活性影響從激活轉變為抑制。見圖2。

2.2 4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮對酪氨酸酶激活動力學的機制

為進一步研究這類化合物對酪氨酸酶的激活機制，選取了其中活性最好的兩種化合物4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮，通過測試做出Lineweaver-Burk 雙倒數曲線。見圖3。

如圖3 所示，4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮對酪氨酸酶激活動力學曲線均為平行線，兩組測試的最大速率（Vmax）和表觀米氏常數（Kappm）均隨著測試樣品濃度增加而增大，根據Saboury AA 關于激活劑的理論[11]，表明兩種化合物對酪氨酸酶激活動力學模式均為非競爭性。

2.3 化合物結構對其激活效應的影響

這類化合物均為二苯甲酮衍生物，它們具有相同的母體結構，但是取代基的位置、數量及取代基的差異對活性有很大的影響。

①羥基分別在4-位、3-位及2-位時，對酪氨酸酶的最大激活效率由230%降低到215%及162%。

②當化合物中羥基的數量增加時，其對酪氨酸酶的激活活性降低，4-羥基二苯甲酮對酪氨酸酶的最大激活率為230%，而4，4′-二羥基二苯甲酮僅為160%，當化合物中羥基的數量增加至3 個或者以上時，其對酪氨酸酶的影響由激活轉變為抑制[12]。

③當化合物中的羥基被氨基取代之后，其對酪氨酸酶的激活活性大幅降低，如4-氨基二苯甲酮與3-氨基二苯甲酮對酪氨酸酶的最大激活率分別僅為147%和149%。

④這類化合物中的羥基被甲氧基、甲基或氟原子取代之后，其對酪氨酸酶的激活效果大幅度降低、甚至消失。

3 小 結

本實驗選取了11 種二苯甲酮衍生物，分別研究了其對酪氨酸酶激活效果的影響，結果顯示，大部分化合物對酪氨酸酶表現出良好的激活效果，其中活性最好的為4-羥基二苯甲酮，其對酪氨酸酶最大激活率達到230%。除此之外，取代基的位置、數量以及取代基本身的不同對這類化合物的活性都有很大影響。在接下來的研究中，將選取活性最好的4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮兩種化合物進行體內活性測試。