糖寧通絡膠囊對db/db小鼠高血糖癥以及視網膜腎臟病變的療效研究

盧珊，王婷婷，李永吉*

(1.黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱商業大學 生命科學與環境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076)

·基礎研究·

糖寧通絡膠囊對db/db小鼠高血糖癥以及視網膜腎臟病變的療效研究

盧珊1，王婷婷2，李永吉1*

(1.黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱商業大學 生命科學與環境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076)

目的：探索糖寧通絡膠囊對2型糖尿病動物模型db/db小鼠高血糖癥以及視網膜腎臟病變的影響。方法：將8周齡db/db小鼠分為5組，分別為模型組，二甲雙胍組(0.14 g·kg-1)，糖寧通絡膠囊高劑量組(1.8 g·kg-1)，糖寧通絡膠囊中劑量組(0.9 g·kg-1)和糖寧通絡膠囊低劑量組(0.45 g·kg-1)，以同窩野生型小鼠為正常對照組。每天灌胃給藥1次，連續20周。檢測空腹血糖和葡萄糖耐量，并檢測血清糖化血紅蛋白水平，觀察糖寧通絡膠囊對db/db小鼠高血糖癥的影響；采用4Doct熒光血管造影儀器檢測視網膜微血管瘤，觀察糖寧通絡膠囊對db/db小鼠視網膜病變的影響；使用試劑盒檢測尿蛋白水平、BUN和CRE，觀察糖寧通絡膠囊對db/db小鼠腎臟功能病變的影響。結果：糖寧通絡膠囊顯著降低db/db小鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白水平，顯著增加葡萄糖耐量，明顯減少微血管瘤數量，并顯著減少尿蛋白、BUN和CRE水平。結論：糖寧通絡膠囊具有顯著的降血糖作用以及對糖尿病視網膜和腎臟并發癥的預防作用。

db/db小鼠；糖尿病視網膜病變；糖尿病腎病

糖尿病(diabetes mellitus)是一種基于胰島素抵抗的以持續性的高血糖狀態為主要臨床特征的慢性代謝障礙性疾病[1]。近年來，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，糖尿病的患病率在我國以及全球范圍內呈現逐步增高的趨勢，已成為嚴重危害人類生命健康的世界性公共衛生問題[2]。

糖尿病慢性并發癥是糖尿病患者致殘或致死的主要原因，其中以微循環障礙為病理基礎的視網膜病變和腎臟病變是糖尿病最常見的慢性并發癥。視網膜病變是成人獲得性視力損害與失明的重要病因，而糖尿病腎病已經成為終末期腎病的首位病因[3]。目前，臨床上治療糖尿病的藥物主要是化學藥，如：磺酰脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、糖苷酶抑制劑等。遺憾的是迄今為止尚無治療糖尿病慢性并發癥的特效藥物，所以，臨床上亟需防治或延緩糖尿病并發癥的藥物[4]。

中藥具有“多組分-多靶點-多因素-多效應”網絡化的作用特點，決定了其在改善糖尿病并發癥等復雜性疾病防治方面的優勢。如果能充分發揮中藥對糖尿病并發癥的防治作用，將會對人類健康作出重要貢獻。

糖寧通絡膠囊為醫院制劑，屬傳統苗藥，主要由科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花組成，主治生津止渴，活血通絡，清熱瀉火，用于氣陰兩虛所致的消渴病。糖寧通絡膠囊用于2型糖尿病及糖尿病并發癥的治療，臨床觀察效果較好。但是，糖寧通絡膠囊對db/db小鼠高血糖癥和糖尿病并發癥是否具有療效，國內外未見報道。

本研究采用目前國際公認的2型糖尿病動物模型db/db小鼠，探索糖寧通絡膠囊對db/db小鼠高血糖癥、視網膜和腎臟病變的影響，為臨床治療糖尿病并發癥提供新的治療思路和途徑。

1 材料

1.1 藥品

鹽酸二甲雙胍片(Metformin，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：1403107)；糖寧通絡膠囊(貴州百靈集團制藥股份有限公司，批號：20140401)，已獲貴州省藥品監督管理局批準授權(授權號：QYZZ-2014033)；穩豪型血糖試紙(批號：3558469)和穩豪型血糖儀[強生(上海)醫療器材有限公司]；葡萄糖(北京化工廠，批號：20140215)；小鼠糖化血紅蛋白(Haemoglobin A1c，HbA1c)ELISA試劑盒(美國Crystal Chem公司，批號：20140512)；。尿蛋白試紙條(批號：20140424)，尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN；批號：20140311)和肌酸酐(Serum creatinine，CRE；批號：20140201)試劑盒，均購自日立高科技貿易(上海)有限公司。

1.2 動物

8周齡雄性C57BL/KsJ/db-/-小鼠(db/db小鼠)和同窩野生型C57BL/KsJ/db+/+小鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。遵循國家《實驗動物管理條例》，依據北京實驗動物管理規定將小鼠置于SPF級實驗動物室進行飼養，溫度：(23±2)℃，濕度：(50±10)%，予以12 h明、暗交替光照，自由進食飲水。實驗方案由中國醫學科學院北京協和醫學院動物倫理委員會審查批準。

2 方法

2.1 分組及給藥

將db/db小鼠隨機分為5組，分別為模型組、陽性藥二甲雙胍組(0.14 g·kg-1)、糖寧通絡膠囊高劑量組(1.8 g·kg-1)、糖寧通絡膠囊中劑量組(0.9 g·kg-1)和糖寧通絡膠囊低劑量組(0.45 g·kg-1)，將野生型C57BL/KsJ/db+/+小鼠作為正常對照組，每組10只。每天灌胃給藥1次，共給藥20周，正常對照組和模型組均給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

2.2 測定小鼠空腹血糖水平

給藥期間每周測定各組小鼠(n=10)空腹血糖，小鼠禁食不禁水5 h后，用穩豪型血糖儀測定各組小鼠尾靜脈血的空腹血糖水平。

2.3 熒光血管造影

在給藥133 d，各組小鼠(n=10)經腹腔注射麻醉(10%烏拉坦和5%水合氯醛等量混合，15 mL·kg-1)，固定于4Doct熒光血管造影儀器(Optoprobe公司，加拿大)的實驗臺上，然后使用復方托吡卡胺滴眼液散瞳，調整小鼠眼睛靠近顯微鏡頭。腹腔注射20%熒光素鈉(2 mg·kg-1)后，觀察并拍照熒光血管造影圖。熒光血管造影圖中在視網膜血管分枝的末端，可見局部的末端膨大，我們將其確認為“微血管瘤”，在對微血管瘤計數時，我們將視網膜分為4個區域，左上對應顳上方、左下對應顳下方、右上對應鼻上方、右下對應鼻下方。在每個方向計數時，均將視盤影像置于各個象限的固定部位，其中左上方計數時視盤位于4∶30處，右上方計數時視盤位于7∶30處，左下方計數時視盤位于1∶30處，右下方計數時視盤位于10∶30處。4個方位計數的總和為該視網膜的微血管瘤總數。所有視網膜放大倍率均一致(20x)，以保證計數的可比性。為了確保計數的準確性，共有3人參與了微血管瘤的計數，分別是動物操作人員、熒光血管造影操作人員以及另外非本課題相關人員，3個人員的計數平均值為該視網膜的微血管瘤總數。

2.4 測定尿蛋白、BUN、CRE和HbA1c水平

給藥139、140 d，接取各組小鼠(n=10)尿液，用尿蛋白試紙條檢測尿蛋白水平。給藥140 d，將小鼠脫頸處死后，腹主動脈取血1 mL。血液經3000 r·min-1離心15 min后取血清，-80℃凍存，根據試劑盒操作說明測定腎臟功能相關指標BUN和CRE水平以及HbA1c水平。

2.5 測定小鼠葡萄糖耐量

在給藥140 d，各組小鼠(n=10)禁食不禁水5 h，灌胃給予小鼠葡萄糖溶液(2.5 g·kg-1)。分別于0、30、60、90、120 min用穩豪型血糖儀測定各組小鼠尾靜脈血血糖值，以時間為橫坐標，血糖值為縱坐標作圖，并計算血糖曲線下面積(Area under the curve，AUC)。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠空腹血糖的影響

由圖1所示，與正常對照組比較，db/db小鼠血糖值隨時間延長逐漸增加；與模型組比較，二甲雙胍和糖寧通絡膠囊處理組(1.8、0.9、0.45 g·kg-1)小鼠的血糖值隨給藥時間延長逐漸下降。糖寧通絡膠囊處理組(1.8、0.9 g·kg-1)給藥1周后小鼠的空腹血糖值顯著下降(P<0.01)。糖寧通絡膠囊處理組(0.45 g·kg-1)給藥4周后小鼠的空腹血糖值顯著下降(P<0.01)，糖寧通絡膠囊各劑量組在給藥4周后的降血糖效果與二甲雙胍組(0.14 g·kg-1)相當。

3.2 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠葡萄糖耐量的影響

由圖2所示，與正常對照組比較，db/db小鼠血糖-時間曲線下面積(AUC)顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍和糖寧通絡膠囊處理組(1.8、0.9、0.45 g·kg-1)小鼠的AUC顯著減少(P<0.01)，說明糖寧通絡膠囊能夠顯著提高db/db小鼠葡萄糖耐量。

3.3 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠HbA1c水平的影響

由圖3所示，與正常對照組比較，db/db小鼠HbA1c水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍和糖寧通絡膠囊處理組(1.8、0.9和0.45 g·kg-1)小鼠的HbA1c水平顯著降低(P<0.01)，表明糖寧通絡膠囊能夠降低糖化血紅蛋白水平。

圖1 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠空腹血糖的影響

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖2 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠葡萄糖耐量的影響

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖3 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠HbA1c水平的影響

3.4 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠視網膜病變的影響

由圖4所示，熒光血管造影結果表明，與正常對照組小鼠比較，模型組db/db小鼠微血管瘤的數量顯著增加(P<0.01)，提示db/db小鼠視網膜微血管發生病理性改變。糖寧通絡膠囊各劑量組都能顯著減少視網膜微血管瘤的數量(P<0.01)，表明糖寧通絡能夠改善db/db小鼠視網膜微血管病變。二甲雙胍對db/db小鼠視網膜微血管病變沒有明顯改善作用。

注：(1)微血管瘤如箭頭所示；(2)與正常對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖4 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠微血管病變的影響

3.5 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠腎臟病變的影響

由表1所示，腎臟功能指標檢測結果表明，與正常對照組小鼠比較，模型組db/db小鼠尿液的尿蛋白水平、血清中BUN和CRE水平均顯著增加(P<0.01)。而糖寧通絡各劑量組可顯著減少db/db小鼠尿蛋白、BUN和CRE水平(P<0.01)，提示糖寧通絡能夠抑制糖尿病腎臟功能損傷。二甲雙胍對db/db小鼠糖尿病腎臟功能損傷沒有明顯改善作用。

表1 糖寧通絡膠囊對db/db小鼠腎功能指標的影響

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

糖尿病的危害不僅僅是高血糖癥，更大的危害是慢性并發癥。糖尿病慢性并發癥，尤其是視網膜病變和腎臟病變，已經成為糖尿病致死致殘的主要原因。目前，臨床上對糖尿病的治療手段主要是使用化學藥控制血糖，然而，僅控制血糖并不能有效地防治糖尿病慢性并發癥[5]。如果在糖尿病早期及時使用藥物干預，阻斷和逆轉糖尿病并發癥的發生，可能對降低糖尿病致殘致死率具有重要意義。但是，目前化學藥在防治糖尿病并發癥方面效果并不理想。因此，臨床上迫切需要防治糖尿病并發癥的新型藥物。

糖寧通絡膠囊為苗藥配方，臨床上主要用于2型糖尿病的治療，療效顯著。本研究利用db/db小鼠探索了糖寧通絡的降血糖作用及其對糖尿病并發癥的防治作用。研究發現，db/db小鼠在6～8周齡時開始自發性出現高血糖，空腹血糖水平隨時間延長而逐漸增加，糖化血紅蛋白水平也顯著增加，葡萄糖耐量顯著降低。而陽性藥二甲雙胍和糖寧通絡膠囊(1.8、0.9、0.45 g·kg-1)能夠顯著降低db/db小鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白水平，并顯著提高葡萄糖耐量。這些實驗結果表明，糖寧通絡膠囊具有明顯的降血糖作用。

文獻報道，db/db小鼠逐漸自發性出現2型糖尿病的慢性并發癥，如視網膜病變和腎臟病變等[6-7]。本研究也發現，db/db小鼠在28周時視網膜出現大量微血管瘤，腎臟功能指標蛋白尿和血清BUN、CRE水平也顯著升高，提示db/db小鼠出現糖尿病視網膜和腎臟病變。而糖寧通絡膠囊(1.8、0.9、0.45 g·kg-1)灌胃給藥20周能夠顯著改善db/db小鼠的視網膜病變和腎臟病變，具體體現在糖寧通絡膠囊能夠顯著減少微血管瘤和抑制腎臟功能損傷。這些實驗結果表明，糖寧通絡能夠預防糖尿病視網膜和腎臟病變。

二甲雙胍被國際組織和許多國家制定的糖尿病診治指南推薦為2型糖尿病控制高血糖的一線用藥[8]。二甲雙胍也被國內糖尿病專家作為2型糖尿病的治療藥物[9]。文獻報道，二甲雙胍除具有降糖功能外，還具有改善心肌損傷、減少心肌纖維化、改善血管內皮功能和改善血管舒縮功能等心血管保護作用[10]。另有文獻報道，目前二甲雙胍不能降低2型糖尿病心血管風險[11]。二甲雙胍是否對糖尿病視網膜病變或腎臟病變具有防治作用，國內外未見報道。我們通過實驗發現，二甲雙胍對db/db小鼠出現的糖尿病視網膜微血管瘤和腎臟病變沒有表現出明顯的防治效果。與二甲雙胍比較，糖寧通絡在防治糖尿病視網膜和腎臟病變方面有一定的優勢。但是，糖寧通絡膠囊降血糖、預防糖尿病視網膜和腎臟病變的分子機制是什么，還需后續實驗進一步探索。

綜上所述，糖寧通絡膠囊具有顯著的降血糖作用，并對糖尿病視網膜和腎臟病變具有顯著的防治作用，可能成為治療糖尿病的候選藥物。

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EffectsofTangningtongluoCapsuleonHyperglycemiaandDiabeticRetinopathyandNephropathyindb/dbMice

LUShan1，WANGTingting2，LIYongji1*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China；2.CenterofResearchandDevelopmentonLifeSciencesandEnvironmentalSciences，HarbinUniversityofCommerce，Harbin150076，China)

In this study，the effects of Tangningtongluo capsule(TNTL) on hyperglycemia and diabetic retinopathy and nephropathy in db/db mice were evaluated.Db/db mice(n=50) were randomly assigned to 5 groups，i.e.，the model group，the metformin(0.14 g·kg-1) group，the high dose TNTL(1.8 g·kg-1)，the middle dose TNTL(0.9 g·kg-1) and the low dose TNTL(0.45 g·kg-1).The wide-type littermates were used for the control mice.Metformin and TNTL were freshly prepared and intragastric administration daily for 20 weeks.Themice in control group and model group were given the same amount of saline.TNTL significantly decreased fasting glucose and HbA1c，improved oral glucose tolerance，significantly reduced microaneurysm，decreased the levels of urine protein，BUN and CRE.In conclusion，TNTL exerted a strong hypoglycemic effect and had preventiveeffects on diabetic retinopathy and nephropathy in db/db mice.

db/db mice；diabetic retinopathy；diabetic nephropathy.

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.008

2014-12-19)

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李永吉，教授，研究方向：中藥藥劑學；E-mail：liyongji201506@163.com