蜂毒注射液對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡影響的研究

譚寧，王科澎，賀守第，羅曉光，朱輝軍，黃勝光

1.廣東醫學院附屬深圳南山醫院中醫風濕科，廣東 深圳 518052 2.深圳市福田區中醫院，廣東 深圳 508060 3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410006

蜂毒注射液對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡影響的研究

譚寧1，王科澎2，賀守第3，羅曉光1，朱輝軍1，黃勝光1

1.廣東醫學院附屬深圳南山醫院中醫風濕科，廣東 深圳 518052 2.深圳市福田區中醫院，廣東 深圳 508060 3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410006

目的：探究蜂毒注射液對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞（FLS-RA）凋亡的影響。方法：原代培養FLS-RA，MTT法測定蜂毒注射液對細胞增殖及細胞毒性作用，hoechst染色法觀察凋亡小體，Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率。結果：組織塊培養法培養2周后細胞向心性排列，呈梭形及三角形。經過3～5次傳代，FLS-RA細胞逐漸純化，以FLS為主（＞95%），體外生長穩定。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態：細胞排列整齊，向心性排列，呈梭形或三角形，偶見圓形細胞，細胞核成卵圓形，居細胞中央，胞質均勻透亮。干預24 h：各組生存率低于空白對照組（P＜0.05），濃度越高，生存率越低；蜂毒注射液處理48 h：各組生存率低于空白對照組（P＜0.05），濃度越高，生存率越低；同濃度蜂毒注射液處理24 h生存率與48 h比較：48 h組小于24 h組（P＜0.05）。利用ORIGIN 5.0軟件計算蜂毒注射液的半數抑制濃度（IC50）為（16.79±0.13）mg/L。實驗組與陽性對照組中凋亡小體形態相似，細胞核呈致密濃染，顏色發白，而陰性對照組未見明顯凋亡小體，細胞核未見固縮的染色質。B1區為細胞碎片，B2區為晚期凋亡和死亡的細胞，B3區為正常細胞，B4區為早期凋亡的細胞。由于B2區包含死亡的細胞，多選擇B4區比較早期凋亡率。低濃度組蜂毒注射液作用FLS-RA細胞24 h，早期凋亡率大于空白對照組（P＜0.05）；高濃度組蜂毒注射液早期凋亡率明顯高于空白對照組（P＜0.01），且大于低濃度組（P＜0.05）。結論：蜂毒注射液可誘導成纖維樣滑膜細胞凋亡，這可能是蜂毒治療類風濕關節炎的機理之一。

類風濕關節炎（RA）；蜂毒注射液；成纖維樣滑膜細胞（FLS-RA）；細胞凋亡

類風濕關節炎（Rheum atoid arthritis，RA）是以對稱性多關節腫痛為主要臨床表現的一種系統性自身免疫性疾病，以關節滑膜慢性炎癥、關節進行性破壞、關節畸形及功能喪失為主要病理表現。臨床表現為對稱性多關節腫脹、疼痛、晨僵以及全身多系統的受累，此病病因未明，具有發病率高、致殘率高的特點，嚴重影響了患者的勞動力及生活質量［1～2］。蜂毒對類風濕關節炎病人具備較好的療效，但蜂毒通過何種機制起作用很少有人探究，國內外研究發現成纖維樣滑膜細胞（FLS-RA）增生特點類似于腫瘤細胞增生特點，蜂毒可通過多條途徑誘導腫瘤細胞凋亡，故設計本實驗探究蜂毒對FLS-RA凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 標本取材 4例類風濕關節炎滑膜標本均取自深圳市第六人民醫院骨科行關節置換或關節鏡手術患者，所有RA患者診斷均符合2009年ACR/EULA制定的RA分類標準和評分系統，得分均＞6分。

1.2 儀器和試劑 恒溫CO2細胞培養箱、流式細胞儀（美國beckm an coulter公司）、蜂毒注射液（長春博奧生物有限公司）、胎牛血清（美國Sigm a公司）、DMEM/F12細胞培養基（Hyclone公司）、MTT試劑盒（碧云天公司）、hoechst試劑盒（碧云天公司）、Annexin V/PI試劑盒（invitrogen公司）、細胞凋亡陽性對照試劑盒（碧云天公司）。

1.3 成纖維樣滑膜細胞的分離培養 將術后RA滑膜組織放入盛有DMEM/F12培養基的15m L離心管內低溫保存，除去附著的脂肪組織及血塊，用預冷PBS液沖洗3次，將組織塊修剪成1mm×1mm×1mm的小塊，放置于培養瓶中，加入DMEM/F12完全培養基，放置于細胞培養箱細胞培養箱內培養，每3天更換培養基，觀察滑膜細胞生長情況，待成纖維樣滑膜細胞長滿至覆蓋瓶底細胞＞80%，進行傳代，一般采用一傳二。將3～5代的細胞在倒置光學顯微鏡下進行鑒定及實驗。

1.4 MTT檢測實驗 蜂毒濃度配置參照臨床蜂毒注射液濃度稀釋于DMEM/F12完全培養基中。取96孔細胞培養板，設置空白對照組、低濃度組（0.1m g/L，0.5m g/L，1m g/L）、中濃度組（2 m g/L，4 m g/L，8 m g/L）、高濃度組（16 m g/L，20 m g/L，25m g/L），每個濃度設置3個復孔，首先加入100 μL細胞混懸液（FLS-RA細胞數5×104/m L），細胞培養箱培養24 h，吸除培養基，加入100μL上述濃度配置的蜂毒注射液培養基，細胞培養箱培養24 h，加入100μLMTT液，培養箱孵育4 h，再加入100μL甲瓚溶解液，培養箱孵育4 h后，在酶標儀下采用570mm波長測定吸光度。

1.5 hoechst染色法觀察凋亡小體 實驗設置陰性對照組、實驗組（根據MTT實驗的半數抑制濃度確定蜂毒注射液濃度16 m g/L）、陽性對照組。將蓋玻片放置于6孔板中，每孔加入2 m L細胞混懸液（FLS-RA細胞數1×104/m L），顯微鏡下觀察細胞爬片成功后，分別加入完全培養基、16m g/L蜂毒注射液培養基、細胞凋亡誘導試劑A+B，放入培養箱孵育24 h，吸除玻片表面培養基，加入0.5m L固定液，室溫固定10m in，無菌PBS沖洗2次，滴入適量Hoechst染色液染色9 m in，無菌PBS沖洗2次，封片液封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態。

1.6 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率 根據MTT實驗結果選擇最佳濃度，設置低濃度組（4 m g/L），高濃度組（16 m g/L），空白對照組（完全培養基）。6孔培養板每孔加入1m L細胞重懸液（FLS-RA細胞數5×104個/m L）中。按照實驗設計依次加入蜂毒注射液培養基混懸液，孵育24 h，無菌PBS沖洗兩次，胰酶消化后轉移至流式管中，離心去上清，無菌PBS沖洗1次，加入1×AnnexinV重懸，將重懸液稀釋至1×106/m L，各組取100μL至流式管中，同時加入5μLAlexa Fluor 488 Annexin V和1μL 100μg/m LPI工作液，室溫孵育15m in，離心去上清后，加入1X Annexin V定容至500μL，細胞濾網過濾，流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

2 實驗結果

2.1 FLS原代培養及鑒定 組織塊培養法培養2周后細胞向心性排列，呈梭形及三角形。經過3～5次傳代，FLS-RA細胞逐漸純化，以FLS為主（＞95%），體外生長穩定。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態：細胞排列整齊，向心性排列，呈梭形或三角形，偶見圓形細胞，細胞核成卵圓形，居細胞中央，胞質均勻透亮。

2.2 各組OD值比較 見表1。干預24 h：各組生存率低于空白對照組（P＜0.05），濃度越高，生存率越低；蜂毒注射液處理48 h：各組生存率低于空白對照組（P＜0.05），濃度越高，生存率越低；同濃度蜂毒注射液處理24 h生存率與48 h比較：48 h組小于24 h組（P＜0.05）。利用ORIGIN 5.0軟件計算蜂毒注射液的半數抑制濃度（IC50）為（16.79±0.13）m g/L。

表1 各組OD值比較±s）

表1 各組OD值比較±s）

與空白對照組比較，①P＜0.05；與同組24 h比較，②P＜0.05

組別空白對照組低濃度組低濃度組低濃度組中濃度組中濃度組中濃度組高濃度組高濃度組高濃度組蜂毒注射液濃度（mg/L）0 0.1 0.5 OD值1 2 4 8 16 20 25 24 h 0.0291±0.0015 0.0279±0.0020①0.0261±0.0019①0.0248±0.0017①0.0232±0.0019①0.0194±0.0013①0.0174±0.0017①0.0153±0.0206①0.0093±0.0020①0.0038±0.0011①48 h 0.0312±0.0012 0.0266±0.0016 0.0244±0.0020①②0.0232±0.0019①②0.0180±0.0010①②0.0154±0.0015①②0.0121±0.0012①②0.0074±0.0151①②0.0016±0.0012①②0.0008±0.0009①②

2.3 hoechst染色觀察凋亡小體 見圖1。實驗組與陽性對照組中凋亡小體形態相似，細胞核呈致密濃染，顏色發白，而陰性對照組未見明顯凋亡小體，細胞核未見固縮的染色質。

圖1 hoechst染色觀察凋亡小體

2.4 各組細胞凋亡率比較 見圖2。B1區為細胞碎片，B2區為晚期凋亡和死亡的細胞，B3區為正常細胞，B4區為早期凋亡的細胞。由于B2區包含死亡的細胞，多選擇B4區比較早期凋亡率。低濃度組蜂毒注射液作用FLS-RA細胞24 h，早期凋亡率大于空白對照組（P＜0.05）；高濃度組蜂毒注射液早期凋亡率明顯高于空白對照組（P＜0.01），且大于低濃度組組（P＜0.05）。

圖2 各組細胞凋亡率比較

3 討論

RA是以對稱性多關節損害的一種自身免疫性疾病，其病理表現為滑膜組織異常增生?；そM織是包裹在關節外面的一層膜組織，正常的滑膜組織在解剖學上可分為兩個部分：滑膜內層（襯里層）和滑膜下層（襯里下層），滑膜內層介于滑膜下層與滑液之間，這層有兩種主要類型的細胞：巨噬樣細胞（又稱A型滑膜細胞）和成纖維樣細胞（又稱B型滑膜細胞）［3～4］。大量的研究證實，FLS-RA擁有超常的增殖能力以及高強度的侵蝕力，襯里層的滑膜細胞異常增生可能與細胞凋亡受到不同程度的抑制相關［5～6］。

蜂毒是經受長時期考驗的天然藥物，在風濕病的治療中占有重要地位［7］。藥理研究表明，蜂毒具備鎮痛、抗炎、降血壓、抗凝血、抗菌、防輻射、抗腫瘤等作用。近年來用于治療自身免疫性疾病、神經系統疾病、運動系統疾病、心血管疾病、變態反應性疾病等。臨床試驗研究表明，蜂毒有抗炎、調節免疫作用，可改善類風濕因子、血沉、C-反應蛋白、抗環瓜氨酸抗體等指標［8～11］。體外研究及動物實驗發現，蜂毒可以有效抑制大鼠體內多種細胞因子的水平，這對抑制滑膜組織炎癥和阻斷關節軟骨基質的降解有正面作用，進而起到保護關節軟骨的作用［12～14］。

本實驗通過蜂毒注射液作用于體外原代培養的FLS，MTT實驗顯示在一定范圍內［（0.1～25）m g/L］隨著蜂毒注射液濃度升高，FLS的的生存率逐漸下降，通過hoechst染色法可觀察到凋亡小體，利用AnnexinV/PI雙染法聯合流式細胞術檢測發現蜂毒注射液誘導FLS-RA凋亡，且高劑量組的早期凋亡率大于低劑量組以及陰性對照組。有動物實驗研究發現，蜂毒肽是蜂毒治療RA的活性成分［15］，是否蜂毒通過蜂毒肽而誘導FLS的凋亡有待進一步探究。

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（責任編輯：駱歡歡）

Study o f Ap istoxin In jection on Apop tosis o f Fib rob last-like Synovial Cells o f Rheum atoid Arth ritis Patien ts

TAN Ning，WANG Kepeng，HE Shoudi，et al

Objective：To explore the influence of Apistoxin injection on the apoptosis of fibroblast-like synovial cells of rheum atoid arthritis patients.M ethods：Rheum atoid arthritis fibroblast-like synovial cells（FLS-RA）w as concentrated by the prim ary culture in vitro.Effect of Apistoxin injection on cellproliferation and cell toxicity w as m easured by MTT technique，and apoptotic body w as observed by Hoechst staining，apoptotic rate w as detected after Annexin V/PIdouble staining.Results：After prim ary culture for2 w eeks，the cells w ere fusiform or triangle-like，arranged around the center.After passage culture for 3-5 generations，FLS-RA becam e pure and the percentage of FLSw as over 95%，grow ing steady in vitro.The results under inverted phase contrast m icroscope show ed that the cells w ere arranged around the center in order，w ere fusiform or triangle-like，and seldom w ere round w ith oval nucleus in the center of the cell.The cytoplasm w as w ell-distributed and lucency.After intervention w ith Apistoxin injection for24 and 48 hours，the survival rate of FLS-RAw as low er in the intervention groups than that in the blank control group（P＜0.05），and the survival rate decreased w ith the increase of Apistoxin injection concentration（P＜0.05）.The survival rate induced by the sam e concentration of Apistoxin injection w as low erafter intervention for 48 hours than that after 24 hours（P＜0.05）.The 50%inhibiting concentration（IC50）of Apistoxin injection w as 16.79±0.13m g/L. The apoptotic body w as found in both observation group and positive controlgroup，w hile w as not show n in the negative control group.The cells in B4 region w ere chosen for the calculation of early apoptotic rate，and the results show ed that low-andhigh-concentration Apistoxin injection groups had higherearly apoptotic rate than the blank controlgroups（P＜0.05 or P＜0.01），and the high-concentration groups had the highestearly apoptotic rate（P＜0.05）.Conclusion：Apistoxin injection can induce the apoptosis of fibroblast-like synovial cells，w hich m ay be one of the therapeutic m echanism s of Apistoxin injection for rheum atoid arthritis.

Rheum atoid arthritis；Apistoxin injection；Fibroblast-like synovialcells；Apoptosis.

R593.22

A

0256-7415（2015）06-0280-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.130

2014-12-29

深圳市科技計劃項目（201303177）

譚寧（1977-），女，副主任醫師，研究方向：中西醫結合風濕病。

黃勝光，E-mail：282111306@qq.com。