共振能量轉移技術在生命科學中的應用研究新進展

張順超， 沈國勵， 李合松*

(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128;2.湖南大學化學化工學院，湖南長沙 410082)

1 引言

共振能量轉移(Resonance Energy Transfer，RET)是指發生在距離足夠近(一般小于10 nm)的供體與受體之間的非輻射能量轉移。其中，熒光共振能量轉移技術(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)作為一種應用較廣泛的分析技術，已經成功應用于蛋白質結構分析[1]，核酸、免疫分析[2]等領域。生物發光共振能量轉移(Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET)作為一種天然的生物物理學過程，也成功應用于蛋白質分子相互作用的研究[3 - 4]。然而FRET存在光漂白、需要激發光源等缺點，BRET在供受體對的選擇上受到極大的限制。近年來，人們發展了一種新的能量轉移技術，即化學發光共振能量轉移(Chemiluminescence Resonance Energy Transfer，CRET)。由于CRET不需要激發光源、不存在光漂白現象，有望進一步拓寬能量轉移技術在相關領域的應用。目前，CRET在蛋白質分析[5]、核酸分析[6]等領域的應用引起了人們的廣泛關注。本文依據供受體對的不同，對RET技術在生命科學中的應用研究進展進行綜述，展望了其應用前景和發展趨勢。

2 共振能量轉移技術的原理

RET的產生必須具備兩個條件，一是供體的發射光譜和受體的激發(或吸收)光譜必須有部分重疊；另外供體和受體之間的距離必須足夠小(一般小于10 nm)。FRET是指在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團(供體)的發射光譜與另一個基團(受體)的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離足夠近時(一般小于10 nm)，就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象，即熒光供體受激發時，可觀察到熒光受體發射的熒光。

3 共振能量轉移技術的應用

3.1 熒光共振能量轉移技術的應用

FRET具有分析速度快、方法靈敏度高、選擇性好、無污染或污染小等優點，已經廣泛應用于生物學中生物分子的結構和動力學研究，如核酸分析[8，9]、免疫分析[10，11]、蛋白質分析[12 - 15]、糖類分析[16]等。因其具有高選擇性，近年來也逐漸應用于與臨床相關的藥物分析[17 - 20]。

3.1.1核酸分析核酸的研究備受廣大科研工作者的關注。如使用傳統的有機染料作為能量供受體對，設計相應的DNA探針，可以使用FRET技術在分子水平上研究DNA的結構[21]。Zhang等[22]合成了熒光陽離子水溶性共軛聚合物(CCP)，對35種卵巢癌癥樣本RASSF1A、OPCML和HOXA9啟動子區域進行了DNA甲基化水平分析，結果表明該方法診斷和篩查癌癥具有巨大的應用潛力。Yang等[23]同樣通過陽離子共軛聚合物熒光探針，分析了結腸癌啟動子甲基化水平，為FRET技術應用于癌癥的診斷治療提出了新的思路。Martí等[24]建立了一種新型的自旋禁止FRET技術，用釕吡啶復合物標記的DNA作為供體，Cy5標記的DNA作為受體，當目標DNA存在時，發生FRET，據此高靈敏檢測了目標DNA。

使用傳統的分子信標技術，通過FRET分析可在細胞水平上精確地觀察活體細胞內基因表達，但早期的FRET主要使用傳統的有機染料作為能量供受體對，存在熒光壽命短，斯托克斯位移小(易發生發光光譜重疊)，能量轉移效率低等缺陷，在一定程度上限制了其應用范圍。因此，尋找新的能量供受體對為研究FRET的關鍵。納米材料，特別是量子點(Quantum Dot，QDs)的出現，解決了熒光壽命短的缺陷，使FRET得到不斷的發展，極大的擴大了其在生命科學中的應用[25]。另外，一些新型納米材料的出現并作為能量受體和反應載體，如金納米(AuNPs)、碳納米管、石墨烯、氧化石墨烯(GO)等，使得供受體對之間的轉移距離增大[26]，使FRET的應用范圍更為廣泛。Jin等[27]建立了一種簡單有效地在均相水平上篩選G-四鏈體配體的新方法，該法將熒光素標記的G-四鏈體DNA(FAM-DNA)通過靜電吸附在AuNPs上，發生FRET，結果表明用FRET方法篩選G-四鏈體配體簡單、靈敏、有效，并有望在此基礎上設計出鑒別具有抗癌活性配體的方法。Lu等[28]合成帶正電的十六烷基三甲基溴化銨修飾的金納米棒(CTAB-AuNRs)，熒光素標記的單鏈DNA(FAM-ssDNA)可通過靜電吸附在CTAB-AuNRs上，發生FRET。Zhang[29]等使用納米銀結合低聚核苷酸DNA，研究了發生FRET的距離，結果表明引入AgNPs后發生能量轉移的距離增加至13 nm，從而有望將其用于比標準福斯能量轉移距離大的供受體的研究。Dong等[30]研究了QDs和GO作為供受體對，QDs標記的分子信標(QDs-MB)可通過π-π共軛連接到GO上，基于此建立了GO-FRET技術檢測DNA的方法。這類基于FRET檢測DNA的方法都具有簡便、快速、靈敏等優點，已用于活體細胞的DNA檢測?；贔RET的核酸分析日趨成熟，已發展由液相分析到固相分析的轉變[31]。Krull等[32]在紙上固定多色QDs，結合相應的熒光染料能量受體標記的DNA，構建了一個在非均相水平上多元檢測DNA的新技術。FRET技術在核酸分析上的應用，使人們對核酸的研究更加深入，同時，分析方法的多樣化，有利于推動核酸研究的快速發展。

3.1.2蛋白質分析FRET可作為精確的“光學分子尺”，已在蛋白質的結構及蛋白質分子內部特定位點之間距離的測量等領域獲得了廣泛應用[33]。Wruss等[34]基于FRET，在極低密度脂蛋白受體衍生物V33333-His6的N端修飾上熒光素作為能量供體，在其C段鍵合上猝滅劑QSY7-S-Tris-NTA作為能量受體，實驗表明在2 μmol/L的Ni2+存在下，tris-NTA對His6具有很強的親合性，從而找到了對His6更優越的熒光標記試劑QSY7-S-tris-NTA。Pihlasalo等[35]基于時間分辨FRET，設計了檢測低濃度蛋白的分析方法，結果表明該方法具有簡便快速、樣品消耗量少、靈敏度高等優點，而且檢測過程不需要引入有毒的底物，也不需要嚴格的控制溫度。Goswami等[36]采用kynurenine氨基酸和結晶紫作為能量供受體,基于FRET原理研究蛋白質構象的變化，拓寬了FRET在蛋白質分析中的應用。

基于納米材料的FRET用于蛋白質的檢測同樣發展迅速。Wang等[37]在微流/納流芯片中構建了一個V形預反應器，異硫氰酸熒光素標記的狗血清白蛋白(FITC-DSA)共軛連接到AuNPs上形成AuNPs納米探針(FITC-DSA-AuNPs)，由于AuNPs與FITC-DSA之間發生FRET，從而定量分析了胰蛋白酶的活性。Li等[38]設計了一個AgNPs增強FRET傳感器用于測量人類血小板源生長因子-BB(PDGF-BB)，熒光團TAMRA功能化的生物素化PDGF-BB適配體(Biotin-PDGF-BB-TAMRA)和猝滅劑BHQ-2標記的互補DNA通過親和反應結合到功能化的AgNPs上，由于適配體鏈與其互補鏈相互雜交發生FRET，結果表明使用AgNPs增強FRET傳感器具有更高的靈敏度，對PDGF-BB的檢測限達到0.8 ng/mL。Hong等[39]基于FRET，鏈霉親和素(SA)功能化的QDs作為能量供體，生物素化的AuNPs作為能量受體(作為猝滅劑)，設計了檢測抗生物素蛋白的分析方法，該方法簡便、快速、靈敏、檢出限達到10 nmol/L。Chang等[40]利用FAM標記的DNA適配體(FAM-Aptamer)可π-π共軛連接到GO上，發生FRET，基于這種新納米材料作為熒光受體，靈敏地檢測了凝血酶，檢測限達到了31.3 pmol/L。

3.1.3免疫分析免疫分析技術主要包含均相法和非均相法。均相法操作較簡單、誤差小、靈敏度高且應用較廣。其中，均相FRET免疫分析方法，選擇合適的能量供受體對，已廣泛應用于小分子半抗原和大分子抗體的檢測[41，42]。隨著納米科學的飛速發展，特別是一些新型納米材料，如QDs、碳納米管、石墨烯、上轉換納米材料等的出現極大地豐富了FRET供受體對的選擇，擴大了FRET技術在免疫分析上的應用[43 - 47]。Liu等[48]采用雙光子熒光染料TP-NH2作為能量供體，DABS作為能量受體，使用免疫夾心法，建立了基于免疫分析的TPE-FRET檢測抗體牛血清蛋白，該方法背景信號低，且具有靈敏度高，線性范圍寬等優點。Kokko等[10]基于FRET，一個抗體使用過渡金屬離子鋱標記作為FRET供體，另外兩個抗體分別標記的熒光素Alexa Fluor(AF)488和Alexa Fluor 680作為受體，建立了均相雙參數免疫分析法。該方法簡單、快速、背景干擾少且檢測限低。目前，基于FRET免疫分析已成功應用于臨床診斷分析。Long等[49]利用小分子BPA功能化石墨烯作為能量受體，熒光標記的BPA抗體作為能量供體，開發了一種均相免疫競爭方法用來檢測小分子BPA，檢測限達到0.1 nmol/L，可以作為新的小分子快速檢測手段。Kuningas課題組[50]基于上轉換FRET，利用上轉換熒光納米作為FRET供體，雌二醇偶聯的小分子染料作為FRET受體，建立了均相免疫測定雌二醇的方法。開發新的熒光供受體對，結合免疫分析，可以擴大FRET在生命分析中的應用。

3.1.4糖類分析應用FRET于糖類的分析相對較少，這主要可能與在糖的結構中同時修飾上兩個熒光團構建FRET相對困難有關。但近些年來，FRET技術應用于糖類分析開始受到科研工作者的關注。Blagoi等[51]基于FRET，用血凝素標記的熒光素作能量供體，右旋糖苷標記的紅色染料Texas作能量受體，研究了碳水化合物和糖蛋白類與右旋糖苷對血凝素的的競爭親合性，同時用該方法檢測了水溶液樣品中碳水化合物和糖蛋白類的含量。Furchak等[52]基于FRET，在適體酶的催化下，檢測6-磷酸鹽葡萄糖胺，檢測限為500 μmol/L。Chang等[53]基于QDs的FRET，結合毛細管電泳-激光誘導熒光(CE-LIF)超靈敏快速地檢測了酸性二糖。使用鏈霉親和素(SA)化的CdSe -ZnS QDs作為能量供體，親和素(biotin)和Cy5雙重標記的二糖作為受體，構建二糖的FRET體系，結合CE-LIF定量分析了硫酸軟骨素二糖。

3.2 生物發光共振能量轉移技術的應用

BRET與FRET相比，具有更多的優勢，例如：它不會產生細胞光敏、沒有熒光團的光漂白和自身熒光背景的影響等。目前，它已經普遍用于蛋白質之間的相互作用機制，非侵入性活細胞及活體成像等研究中。隨著新的熒光蛋白受體(如海腎熒光素，腔腸熒光素，二脫氫腔腸熒光素)的發現，BRET技術有了新的發展，其主要表現在G蛋白受體的偶聯的監測[54，55]、G蛋白偶聯受體相關的細胞內蛋白的功能與運行規律的研究[56]方面的應用。BRET供受體間的距離一般限制在10 nm以內，超過此距離時能檢測的信號非常的小。這也與G蛋白偶聯受體的研究相關，因為G蛋白偶聯受體7個跨膜螺旋核的直徑大概是5 nm。這表明，BRET能夠應用于研究G蛋白偶聯受體的低聚反應[57]和受體G蛋白的偶聯或抑制蛋白的監測，從而研究與G蛋白偶聯受體相關的細胞內蛋白的功能與規律。Yoshida等[58]通過染色體免疫沉淀法結合鋅指熒光素酶構建BRET體系用于檢測表觀遺傳修飾-組蛋白的修飾，使用該方法，準確地檢測了LNCaP和Du145細胞上雄激素受體基因啟動子區域的組蛋白的修飾。同樣，結合甲基-CpG-鍵合域蛋白質或甲基胞苷抗體，成功檢測了DNA甲基化。該方法能成功地應用于臨床診斷分析。Michelini等[59]基于BRET，建立了檢測體內植物雌激素復合物的分析方法，該方法可用于評測植物雌激素的活性以及評估從生物相關樣品中合成外源性雌激素。

目前，BRET體系主要是使用熒光蛋白作為受體，新的BRET受體需要改善一些特證，如Stokes位移能在大于600 nm的長波上發射熒光，以便獲得多功能的BRET體系進而提高它在細胞內成像的實用性和靈敏度。QDs可以在大于600 nm的長波長處發光，且具有較好的生物相容性，容易利用生化方法將它們鍵合到表達蛋白上，且更容易進入細胞內部。Rao課題組發展的QDs-BRET體系，使用內含子中間調節的化學方法偶聯納米粒子，將生物發光蛋白Luc8的C端通過底物肽蛋白連結到QD表面，用于檢測蛋白酶的活性[60]。Hasegawa等[61]通過重組蛋白技術合成谷胱甘肽-s-轉移酶標記的海腎螢光素酶(GST-RLuc)-腔腸素作為能量供體，谷胱甘肽(GSH)包裹的近紅外(NIR)CdSeTe/CdS QDs(GSH-QDs)作為能量受體，發生CRET，已成功應用于動物內的淋巴結和血管成像。Hsu等[62]建立了一種活體內光動力學治療(PDT)的BRET新方法。當加入底物腔腸素時，海腎熒光素酶固定的QDs-655(QDs-RLuc8)產生BRET，QDs發出的光進一步活化膠束中包裹的光敏劑Foscan，使產生活性氧(ROS)從而殺死癌細胞，有效地抑制了腫瘤的生長。

隨著蛋白質組學研究的進展，可以用BRET技術研究大量的存在潛在相互作用的蛋白質，從而有助于揭示疾病發生的病理生理過程。在此基礎上研究蛋白質之間的相互作用，進一步識別新的藥物干預靶點方面具有很大的潛力。同時，開發新的生物能量供受體，仍然是BRET技術的研究熱點。

3.3 化學發光共振能量轉移技術的應用

與FRET不同，CRET不需要外部激發光源，它是由化學發光(CL)底物作為能量供體，隨后將氧化反應產生的能量轉移給合適的受體分子，是一個非輻射能量轉移過程。主要的CL體系有魯米諾(Luminol)、吖啶酯化合物、過氧化草酸酯等。其中，Luminol是CL體系中最為廣泛研究與應用的試劑。一般情況下，在堿性水溶液中，適當的氧化劑如鐵氰化鉀、過氧化氫、高錳酸鉀、高碘酸鉀、過硫酸鉀等可將Luminol氧化使其處于激發態，隨后回到基態時發出最大發射波長為425 nm的光。由于CRET不需要外部光源激發，由外部光源激發非特異性的背景可大大減少，有效地提高了分析的靈敏度。當前，CRET在分析生物大分子和小分子時主要采用分子內和分子間兩種能量轉移模式[63，64]。

雖然CRET現象在很早以前就為分析科學家所發現，但由于CRET有限的能量供受體對選擇，能量轉移效率低下，其應用并不多。Zhao等[64]在微流控系統中引入了CRET用于改善免疫分析的靈敏度，以N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾(ABEI)標記雌二醇(E2)抗原為示蹤劑，與E2競爭結合有限量的FITC標記抗體，并通過CL光譜對該體系的發光行為進行表征，證實該CL體系為免疫CRET轉移，將該免疫體系與微流控芯片電泳-化學發光(MCE-CL)檢測技術結合進行分析，游離的ABEI標記抗原和免疫復合物在60 s內實現快速分離，E2的檢測限達到了3.6×10-11mol/L。Zhang等[65]用Luminol-H2O2-HRP和熒光素(Fluorescein)作為CRET供體-受體對，結合核酸適體特異性識別靶分子，巧妙設計了二元、三元DNA分子信標作為信號探測器檢測小分子三磷酸腺苷(ATP)。用二元、三元DNA分子信標檢測ATP的檢出限分別達到1.1×10-7、3.2×10-7mol/L。該方法成功檢測了白血病細胞和乳腺癌細胞中的ATP，具有樣品消耗量少、分析速度快、靈敏度高及選擇性好等優點。選擇不同的核酸適體，可進一步擴展該方法在高通量藥物篩選、臨床診斷、細胞研究等方面的應用。然而，傳統的CRET主要使用小分子熒光染料作為能量受體，由于小的斯托克斯位移差異，使得供受體對的發射光譜容易發生重疊，CRET的轉移效率低。近期，使用一些納米材料(如QDs，AuNPs，石墨烯等)作為能量受體，由于其具有大的斯托克斯位移和高的能量轉移效率，使CRET得到了極大地發展。

QDs相對于有機熒光團具有更長的的激發壽命，能否將QDs作為共振能量轉移的受體，有機熒光團作為供體產生共振能量轉移引起人們的關注[66]。由于QDs具有寬的激發光譜，高的量子產率，無疑能有效的作為CRET的能量受體。2006年，Huang等[67]首次建立了基于QDs的CRET分析方法。他們研究了QDs催化Luminol-H2O2-HRP-PIP的CL體系，以QDs作為能量受體，Luminol的化學發光為能量供體，提出了該催化體系的CL反應機理為化學發光能量轉移。由于Huang等的開拓性工作，此后CRET的研究日益受到人們的關注[68，69]。Zhao 等[70]提出了Luminol-NaBrO-QDs的非酶CRET體系，大大地拓寬了CRET的應用范圍。他們以Luminol-NaBrO作為能量供體，CdTe -QDs為能量受體，系統地分析比較了該體系，并結合MCE-CL技術，基于多種生理活性物質對該體系的抑制作用實現對其分析測定。Willner等[71]以DNAzyme催化的Luminol-H2O2發光的體系作為能量供體，CdSe/ZnS-QDs作為能量受體，分別建立了檢測核酸適配體和DNA的CRET分析平臺。

相對其它的納米材料，AuNPs具有很多優勢，如無毒、良好的生物兼容性，易于合成和表面功能化和高的摩爾吸光系數等。使用AuNPs高的猝滅效率，更長的供受體距離，在FRET系統中已被廣泛應用[72]，也逐漸應用于構建CRET系統。最近，Huang等[73]提出了一種基于AuNPs的長距離三明治夾心法檢測甲胎蛋白(AFP)的方法。他們使用AuNPs標記Anti-AFP-1作為能量受體，HRP共軛連接Anti-AFP-2，結合Luminol-H2O2化學發光體系作為CL供體，當分析物AFP存在時，發生免疫反應，使供受體之間的距離靠近，發生CRET?；谠摲治鲈?，高靈敏、高選擇性地測定了AFP。在石墨烯(Graphene)或它的水溶性衍生物氧化石墨烯(GO)反應體系中，由于CL供體到石墨烯或GO的π共軛系統可產生非輻射電子轉移，與AuNPs一樣，已被廣泛用作CRET的有效猝滅劑。Bi等[74]使用GO與生物分子直接作用建立了CRET用于生物大分子的檢測，先用熒光染料標記的目標ssDNA(FAM-ssDNA)吸附在GO表面作為能量受體，Luminol-H2O2產生CL，作為能量供體，高靈敏和高選擇性地檢測了H1V1 DNA和凝血酶。Lee等[75]使用石墨烯作為能量受體，Luminol-H2O2-HRP作為能量供體，構建了均相免疫的CRET用于C-反應蛋白(CRP)的檢測。當前，CRET的進一步應用有賴于開發新的CL試劑提高CRET的靈敏度和擴大其潛在的應用。我們相信，隨著納米技術的迅速發展，開發出更多新的CRET供受體對，可以擴展其在生命科學中的重要應用。

4 展望

選擇合適的供受體對，是RET得以實現的關鍵。人們對FRET的研究從早期的兩個熒光基團之間，逐漸擴展到納米材料與熒光基團之間，除了應用于生物化學的分析，人們也用FRET探索或驗證晶體的結構等。隨著QDs的出現，BRET的應用研究正在不斷發展。而CRET的研究的不斷深入，解決了FRET自身熒光干擾和熒光壽命短等問題，進一步拓寬了能量轉移的應用。由此可見，各種能量轉移技術在不同的領域均有其獨特的應用，在生命科學研究中，使用哪一種RET，主要取決于實際分析的需要。此外，開發新型的RET供受體對是進一步推動RET用于生命科學，如臨床癌癥標記物的檢測、小分子間距離的研究等熱門研究課題。在此基礎上，相信RET會在生物分子結構分析、生物標志物的測量以及臨床疾病的診斷等生物科學領域作出更大的貢獻。