巴美肉羊M yHC熒光定量檢測方法的優化

張　靜，郭月英，任　霆，程海星，王　樂，靳　燁

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

巴美肉羊M yHC熒光定量檢測方法的優化

張靜，郭月英，任霆，程海星，王樂，靳燁*

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

通過相對熒光定量的方法，以18S rRNA做管家基因，探索MyHC基因家族是否可用于巴美肉羊的研究，并確定最佳退火溫度。研究發現引物可用于巴美肉羊MyHC基因表達量的研究；當退火溫度為57℃時各基因的峰值單一，Ct值最穩定，且擴增效率好。此方法確定的實驗條件可以用于測定巴美肉羊MyHCmRNA表達量的分析。

肌球蛋白重鏈（MyHC），18S rRNA，熒光定量PCR

隨著人們消費水平的提高，人們對肉制品的要求已從量的需求轉變為對質的提高。肉品質成為大家關注的焦點。肉品質是一個復雜的性狀，眾多因素共同決定了肉質的優劣，如：動物品種、飼養管理、營養狀況、屠宰時間以及基因效應等［1］。巴美肉羊是我國第一個具有自主知識產權的培育肉用品種，它的出現緩解了我國優質肉用種羊嚴重不足的壓力，促進了肉羊良種繁育和產業化發展［2］，但關于巴美肉羊的研究卻鮮見。MyHC基因家族（myosin heacy chain）又稱肌球蛋白重鏈基因家族，MyHC家族的Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱx型和Ⅱb型基因分別對應Ⅰ型（慢速氧化型）、Ⅱa型（快速氧化型）、Ⅱx型（中間型）和Ⅱb型（快速酵解型）四種肌纖維類型［3］。大量研究表明，MyHC基因可以通過控制肌纖維的類型來影響肉質的優劣。關于MyHC基因家族在魚、豬和牛這些動物方面的研究較多，在羊特別是巴美肉羊方面的研究幾乎沒有。熒光定量是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度，從而實現了由定性技術向定量技術的飛躍。本實驗以巴美肉羊為實驗動物，以MyHC基因家族及管家基因18S rRNA為實驗基因，采用熒光相對定量的方法進行mRNA相對表達量的研究，通過此實驗確定MyHC基因在相對表達量實驗中的最佳實驗條件，為下一步的研究提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

4月齡巴美肉羊的股二頭肌選用來自內蒙古巴彥淖爾市，現代畜牧業示范基地（常見食用部位且容易取得）；RNAiso Plus、Prem ix Taq?Version2.0（Loading dye mix）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR?Prem ix Ex TaqTMII、pMD19-T Vector Kit大連寶生物工程有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit AXYGEN、Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞北京全式金生物技術有限公司；RNase-free水北京天根生物技術有限責任公司；氯仿分析純，國藥集團化學試劑有限公司；異丙醇、無水乙醇分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

ZHJH-C1112C超凈工作臺上海智城分析儀器制造有限公司；Eppendorf 5430R低溫臺式冷凍離心機、移液槍1000、200、100、20、10、2.5μLEppendorf生物公司，德國；BG-power5000型穩壓穩流電泳儀

北京百晶生物技術有限公司；水平電泳槽北京百晶生物技術有限公司；凝膠成像系統、核酸蛋白分析儀、實時定量PCR儀（CFX96TMReal-Time PCR Detection System）Bio-rad，美國；普通PCR儀App lied Biosystems（AB），美國；R134A生化培養箱SHEL LAB；ZWYR-240搖床上海智城儀器。

1.2RNA用樣品處理

將宰后1h內巴美肉羊的股二頭肌肌肉100mg左右放入2m L無酶管中，并迅速將其投入液氮中保存，帶回實驗室后，置于-80℃冰箱中保存。將采回的肉樣進行RNA提取，并進行表達量的研究，從而得出巴美肉羊中MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx及管家基因18S rRNA的最佳實驗條件。

1.3總RNA的提取和反轉錄

1.3.1總RNA的提取總RNA的提取按照RNAiso Plus、Prem ix Taq?Version2.0（Loading dye m ix）試劑盒說明書進行，用1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA質量，最后置于-80℃冰箱保存。

1.3.2反轉錄測定RNA的OD值和濃度，OD260/ OD280均在1.7～2.0范圍，稀釋成約1000ng/μL的濃度。反轉錄按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書進行。反轉錄后的默認cDNA濃度為50ng/μL。

1.4引物的設計與合成

管家基因18S rRNA、MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx引物引用參考文獻［4］，MyHCIIb引物由內蒙古農業大學郭月英提供，由上海生工生物工程有限公司合成引物。引物信息如表1所示。

表1　實時定量引物Table 1　Primers of real-time PCR

1.5實驗方法

熒光定量PCR按照SYBR?Premix Ex TaqTMII說明書的CFX96TMReal-Time PCR Detection System二步法操作。為了篩選最佳反應條件，本實驗做了溫度梯度實驗，溫度梯度范圍為52～61℃，最終選擇的最佳退火溫度為57℃，反應條件為：

1.6PCR產物的膠回收純化

用1.2%的瓊脂糖凝膠做膠回收純化，膠回收純化操作步驟按照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒說明書進行。

1.7目的基因的克隆

1.7.1目的基因的連接目的基因與pMD19-T連接載體連接，操作步驟按照pMD19-T Vector Kit說明書進行。

1.7.2目的基因的轉化重組質粒轉化到感受態細胞中，操作步驟按照Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞說明書進行。

1.7.3篩選陽性克隆及測序將有轉化好的感受態細胞的菌液200μL均勻涂布于含有AMP、IPTG和x-Gal的LB瓊脂培養基上，把平板置于37℃至液體被吸收，倒置平板，37℃過夜培養。選取單個漂亮的陽性菌落放入裝有10μL滅菌水的PCR管中，1μL用于菌落PCR，菌落PCR的產物經瓊脂糖凝膠檢測后，把條帶清晰明亮且單一的菌落PCR產物對應的剩余9μL的帶有菌落的滅菌水加入含有AMP和甘油的LB液體培養基中，送去測序。

2　結果與分析

2.1RNA提取結果

經凝膠成像結果如圖1，由圖1可看出28、18和5S處的三條帶清晰明亮，基本沒有降解。用核酸蛋白分析儀測得OD260/OD280均在1.7～2.0之間，沒有被DNA或蛋白污染（當OD260/OD280小于1.7時，說明被蛋白污染；當OD260/OD280大于2.0時，說明被DNA污染），可用于反轉錄及熒光定量。

圖1　RNA提取結果Fig.1　The resultof total RNA

2.2PCR產物電泳結果

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2。

圖2　PCR產物結果圖Fig.2　The result of PCR

從圖2可以看出，MyHCⅠ、Ⅱa、Ⅱb和Ⅱx基因和18S rRNA的PCR擴增產物經凝膠電泳后條帶單一且清晰明亮，無引物二聚體和其他雜質產生。通過與Marker條帶比較，其大小與所設計引物相符，說明引物符合實時定量PCR實驗要求。

2.3測序結果

通過對陽性菌液的測序比對，證實所設計引物即為目的基因引物，各引物均符合實時定量PCR實驗要求，可用于后續實驗。

2.4溶解曲線分析

如圖3～圖7所示，分別為MyHCII x、II a、II b，I基因和管家基因18S rRNA在退火溫度為57℃時的溶解曲線圖。溶解曲線頂點對應的溫度為溶解溫度（Tm），可部分代表序列的特異性。由圖3～圖7可知，溶解曲線的峰值單一，重復性好，說明無引物二聚體和非特異性擴增產物；Tm分別為86、85.3、81.5、90和84℃，數值穩定且均位于80～90℃之間，可用于后續實驗。當出現雜峰時，可通過改變引物濃度，退火溫度和鎂離子濃度來解決問題；若仍然有雜峰，說明引物特異性差，要換特異性好的引物。

圖3　MyHC IIx溶解曲線Fig.3　Melting curve ofMyHC IIx

圖4　MyHC IIa溶解曲線Fig.4　Melting curve ofMyHC IIa

圖5　MyHC IIb溶解曲線Fig.5　Melting curve ofMyHC IIb

圖6　MyHC I溶解曲線Fig.6　Melting curve ofMyHC I

圖7　18S rRNA溶解曲線Fig.7　Melting curve of 18S rRNA

2.5擴增曲線分析

如圖8～圖12所示，分別為MyHCII x、IIa、IIb、I基因和管家基因18S rRNA在退火溫度為57℃時的擴增曲線圖。理論上擴增曲線為2n的曲線圖，但實際反應中呈“S”型，反應前的基線相當于準備時間，如溫度升高或雙鏈變性等，指數期開始復制，平臺期是由于底物消耗完所致，因此為“S”型。其中“S”型曲線與熒光閾值的交點為ct值，即熒光信號達到設定閾值時的循環數。由圖8～圖12可知，擴增曲線成典型“S”型，拐點清晰，指數期明顯，平臺期平行性好，無掃尾現象，每條擴增曲線的重復性好；平行樣的ct值差異小于0.5，重復性好，ct值的平均值分別為14.03、17.00、13.97、18.20和10.63，可用于后續實驗。

圖8　MyHC IIx擴增曲線Fig.8　Quantification curve ofMyHC IIx

圖9　MyHC IIa擴增曲線Fig.9　Quantification curve ofMyHC IIa

圖10　MyHC IIb擴增曲線Fig.10　Quantification curve of MyHC IIb

圖11　MyHC I擴增曲線Fig.11　Quantification curve ofMyHC I

2.6標準曲線分析

分別以2倍梯度將cDNA稀釋成5個濃度，經過熒光定量分析得出表2。

圖12　18S rRNA擴增曲線Fig.12　Quantification curve of 18S rRNA

表2　MyHC和18SrRNA標準曲線Table 2　Standard curve of MyHC and 18S rRNA

經實時定量PCR儀分析得MyHCⅡx、Ⅱa、Ⅱb、Ⅰ和18S rRNA的擴增效率（E）、相關性系數（R2）及標準曲線（y）。由表2可知MyHCⅡx、Ⅱa、Ⅱb、Ⅰ和18S rRNA各基因的相關系數分別為0.995、0.997、0.998、0.994和0.993均大于0.99，故相關性好；擴增效率分別為106.9%，96.8%，96.5%，93.0%和108.2%，均位于90%～110%之間，說明擴增效率好，可用于后續實驗。

3　結論與討論

結果顯示，MyHC基因家族及管家基因18S rRNA經相對熒光定量實驗得到的溶解曲線均在80～90℃范圍內出峰，平行樣的溶解溫度相同，峰值單一，沒有雜峰，重復性好，說明沒有引物二聚體和非特異性擴增產物；擴增曲線成典型“S”型，平臺期平行性好，無掃尾現象，平行樣的ct值差異小于0.5，重復性非常好；標準曲線相關性系數全部大于0.99，擴增效率介于90%～110%之間，表明擴增產物特異性非常好，熒光曲線能夠準確反映目的產物的擴增［5］。由上述可知，標準曲線中相關系數接近1，擴增效率為90%～110%，實驗符合通過2-△△Ct方法分析相對基因表達差異［6-7］的條件。故此相對實時熒光定量方法可用于巴美肉羊MyHC基因mRNA表達量的測定，從而為進一步實驗提供依據。

能夠影響肉品質的基因有很多，例如MRFs家族又稱生肌調節因子基因家族，此家族基因能夠作用于整個肌肉生成的過程［8］；MSTN又稱肌肉生成抑制素，是近年來發現的能夠影響產肉率，改善肉質性狀的基因［9］；CAST（calpastatin）基因又稱鈣蛋白酶抑制蛋白，是與嫩度密切相關的基因［10］，諸如此類的基因還有很多。MyHC基因家族（myosin heacy chain）又稱肌球蛋白重鏈基因家族，MyHC基因家族在哺乳動物中有8種亞型，均由獨立的基因編碼。Weydert等（1983）研究說明，小型嚙齒動物的MyHC只有四種亞型分別為MyHCⅠ、Ⅱa、Ⅱx/d和Ⅱb型［11］，在人、豬［12］和牛中也有相同結論。MyHC家族的Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型基因分別對應Ⅰ（慢速氧化型）、Ⅱa（快速氧化型）、Ⅱx（中間型）和Ⅱb（快速酵解型）四種肌纖維類型［3］。大量研究表明，MyHCⅠ的mRNA表達量越高，即Ⅰ型肌纖維含量高的肉質優良，鮮嫩多汁，口味極佳［5，13］；相反，IIb型纖維似乎與較差肉質有關［14-15］，IIb型肌纖維的增加甚至可能導致PSE肉的產生［16］。由上述可知此家族基因與肌纖維有著極其密切的關系，而肌纖維的類型又是影響肉品質的重要因素之一，也就是說MyHC基因可以通過控制肌纖維的類型來影響肉質的優劣，故MyHC家族的Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型基因的mRNA表達能準確、客觀地評價肉品質量。

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Optim ization of the detection of the fluorescentquantitative PCRmethod of the meat quality gene MyHC in BaMeisheep

ZHANG Jing，GUO Yue-ying，REN Ting，CHENG Hai-xing，WANG Le，JIN Ye*
（Collage of Food Science and Engineering Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The op tim izing reac tion condition ofMyHCwas found by real-time PCR，and 18S rRNAwas housekeep ing gene.The result showed that these p rimers could be used in the searching MyHC gene in BaMei sheep. Besides，when the PCR annealing temperature was 57℃，the peak of PCR melting curve was sing le，the cyc le threshold was at the same leveland the efficiency of PCR was high.So thismethod could be used in searching mRNA exp ression of the meatquality gene MyHC in BaMeisheep.

MyHC；18S rRNA；real-time PCR

TS251.1

A

1002-0306（2015）06-0053-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.002

2014-06-16

張靜（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產品加工。

靳燁（1964-），男，博士，教授，研究方向：畜產品安全生產。

國家自然基金項目（31160330）；國家自然基金項目（31360393）。