氧化型鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ

孫勝男 呂菁君 魏捷

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.026

基金項目： 國家自然科學基金（81372020）; 湖北省衛生廳青年科技人才項目（QJX 2012-11）;武漢市首批中青年醫學骨干人才培養項目

作者單位：430060 武漢，武漢大學人民醫院急診科

通信作者：呂菁君 ，Email： lvjingjun@gmail.com

鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶家族（Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase， CaMK）包括CaMKⅠ，CaMKⅡ，CaMKⅢ，CaMKⅣ。其中CaMKⅡ在體內廣泛分布，在心肌細胞中高表達。鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為Ca²⁺信號轉導的關鍵因子，調控細胞的多種生物學功能，包括氨基酸和脂質代謝，離子通道/受體及神經遞質的合成與釋放，維持細胞內鈣穩態，調控興奮收縮耦聯作用。

近年來，蛋白質翻譯后修飾與心血管疾病的發生發展機制之間的內在聯系受到關注。氧化型Ca²⁺/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ的發現將Ca²⁺與氧化應激緊密的聯系在一起，NADPH氧化酶/CaMKⅡ 信號通路在心肌梗死后心室重構、病態竇房結綜合征的發病機制中起關鍵性致病作用。氧化型鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ的激活位點、激活通路以及下游效應產物成為新的關注點。

1 CaMKⅡ 蛋白翻譯后修飾

鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ， CaMKⅡ）在20年前被確定是由Ca²⁺/ CaM 依賴激活的，其磷酸化位點是 CaMKⅡ蛋白活性調節區域第287蘇氨酸（Thr287）。研究表明，在沒有Ca²⁺/ CaM 參與下，血管緊張素Ⅱ誘導 CaMKⅡ蛋白活性調節區域第281和第282雙蛋氨酸結構氧化，形成氧化型CaMKⅡ（oxidized-CaMKⅡ），導致心肌細胞凋亡[1-2]。進一步的研究表明，CaMKⅡ 第281 / 282 雙蛋氨酸結構氧化激活（oxidized-CaMKⅡ）與CaMKⅡ第287蘇氨酸位點磷酸化激活（phos-CaMKⅡ）是完全獨立的兩個過程，并不相互依賴（圖 1）。

研究表明，CaMKⅡ的激活存在多種形式，不僅有Thr287磷酸化激活、第281和第282雙蛋氨酸氧化激活，糖尿病，長期高血糖導致CaMKⅡ蛋白活性調節區域第280絲氨酸（Ser280）糖基化;交感神經興奮、神經內分泌過度不僅磷酸化激活第287蘇氨酸（Thr287），還導致第272半胱氨酸（Cys272）和第290半胱氨酸（Cys290） 硝基化。

2 CaMK Ⅱ在心臟中的激活通路

鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ在心臟中的激活通路主要通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）和β-腎上腺素能受體信號通路（圖2）。在心肌細胞中RAAS系統通過AT1受體/NADPH氧化酶信號通路氧化激活CaMKⅡ，同時也能導致磷酸化激活CaMKⅡ蛋白 [3-5]。而β1-腎上腺素能受體信號通路主要磷酸化激活CaMKⅡ [6-8]。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是體內活性氧（ROS）的最主要的來源之一。NADPH氧化酶的經典結構由6個不同的亞單位組成，它們分別是位于細胞膜的核心亞基gp91 phox和調節亞基p22phox，二者形成的膜復合體稱為黃素細胞色素b558，以及位于胞質中的水溶性調節亞基Rac、p67phox、p47phox、p40 phox等。在NADPH氧化酶激活時，胞質中的調節亞基轉位與黃素細胞色素b558結合，含黃素的gp91 phox催化亞基作為電子傳遞系統，以NADPH為遞氫體，催化反應：

NADPH+2O₂→NADP⁺+H⁺+2O^2-。超氧化物陰離子（O^2-）在超氧化物歧化酶的作用下轉化成H₂O₂。O^2-和 H₂O₂都是損傷細胞最強的自由基。

血管緊張素激動血管緊張素1受體（AT1受體）誘導NADPH氧化酶活化，細胞內大量的H₂O₂直接作用于CaMKⅡ蛋白活性調節區域第281/282雙蛋氨酸結構，氧化激活CaMKⅡ。激動AT1受體同時也能導致CaMKⅡ蛋白活性調節區域第287蘇氨酸磷酸化激活。Mark E Anderson 團隊進一步研究證明，異丙腎上腺素通過β1-腎上腺素能受體信號通路，導致CaMKⅡ蛋白活性調節區域第287蘇氨酸磷酸化激活，并不作用于第281/282 蛋氨酸[3-5]。

蛋氨酸亞砜還原酶A（methionine sulfoxide reductase A， MsrA）是目前發現的可在體內還原逆轉蛋白質蛋氨酸殘基氧化結構變化和功能損傷的主要抗氧化酶系統。研究表明，與超氧化物歧化酶（SOD）相比，MsrA不僅可以在細胞內發揮清除氧化因子的作用，還可以對已經發生的蛋白質氧化進行可逆性修復。在心肌細胞內，oxidized-CaMKⅡ第281 / 282 雙蛋氨酸結構氧化修復是通過MsrA介導的。在MsrA作用下，心肌細胞內oxidized-CaMKⅡ氧化還原（圖2）。過表達MsrA基因可以顯著減輕氧化應激引發的心肌細胞損傷和凋亡[9]。

3 phos-CaMKⅡ和oxidized-CaMKⅡ在心血管病理生理中的作用

美國加利福尼亞大學洛杉磯分校的Xie等[26]采用膜片鉗和鈣內流成像負荷技術，研究氧化應激對家兔心室肌細胞動作電位的影響：①由于H₂O₂氧化激活CaMK Ⅱ，細胞內鈣濃度顯著增加，觸發肌漿網在舒張期不恰當地鈣釋放，激活瞬時內向電流（I_ti）引發延遲后除極。②H₂O₂（0.2～1.0 mmol/L）作用心室肌細胞5～15 min，影響INa失活，延長動作電位時程。INa通道阻滯劑河豚毒素（10 μmol/ L）可以拮抗這一作用。③ H₂O₂增強I_Ca，L的峰值和延長動作電位平臺期，增加鈣內流，I_Ca，L阻滯劑硝苯地平可以拮抗這一作用。影響I_Na失活，擴大I_Ca，L，延長動作電位時程導致早期后除極現象的發生（圖3）。

CaMKⅡ抑制劑KN-93（1 μmol/ L）可以完全拮抗H₂O₂誘導EADs，無活性的KN-93異構體KN-92無上述作用。選擇性CaMKⅡ磷酸化抑制劑AIP （autocamtide-2-related inhibitory peptide）2 μmol/ L也能顯著抑制H₂O₂誘導EADs發作。與CaMKⅡ抑制劑KN-93比較，CaMKⅡ磷酸化抑制劑AIP的抑制作用更多地表現在影響INa失活，CaMKⅡ抑制劑KN-93對I_Na失活和擴大I_Ca，L都發揮作用。

Song Y-H 研究證實CaMKⅡ在短暫的氧化壓力下誘導大鼠心肌細胞L-型鈣電流（I_Ca，L） 長時程易化（long-term facilitation ， LTF） [21]。1 mmol/L H₂O₂作用大鼠心肌細胞5 min，L-型鈣電流長時程易化持續約1 h。CaMKⅡ抑制劑KN- 93能夠完全逆轉H₂O₂誘導的L-型鈣電流長時程易化。進一步發現，氧化激活CaMKⅡ和磷酸化激活CaMKⅡ都參與維持CaMKⅡ的活化。但是肌漿網Ca²⁺釋放和線粒體

ROS生成在持續CaMKⅡ活化中起關鍵作用。長時程的心肌動作電位重構是通過氧化CaMKⅡ介導的。線粒體氧化激活CaMKⅡ導致與心律失常相關的病理性心肌細胞記憶。

3.4 oxidized-CaMKⅡ參與心肌缺血-再灌注損傷以及心肌梗死后的炎癥反應

CaMKⅡ在心肌中的促炎作用是一個新發現。CaMKⅡ參與心肌缺血-再灌注損傷以及心肌梗死后的炎癥反應。Ling等[27]首次研究證實在心肌細胞內CaMKⅡδ直接介導NF-κB激活，CaMKⅡδ觸發并維持缺血-再灌注損傷導致的炎癥基因表達。CaMKⅡδ基因缺失，減弱缺血-再灌注誘導的炎癥反應?；蚯贸呐K特異性CaMKⅡδ可以保護心臟，減少缺血-再灌注損傷，減少心肌細胞凋亡，減少梗死面積，改善心臟功能恢復。進一步的研究表明，缺血-再灌注迅速增加CaMKⅡ的活性，在再灌注數分鐘內活化NF-κB?；罨腃aMKⅡ在心肌細胞中的表達直接導致IκB激酶磷酸化，伴隨核P65的增加 。

在心肌梗死中，Toll樣受體-4促進核因子κB依賴的炎癥反應和氧化損傷。MyD88（myeloid differentiation protein 88）是Toll樣受體的重要下游信號和功能蛋白。2012年，Singh等[28] 研究發現脂多糖（LPS）激活Toll樣受體-4（TLR-4）誘導心肌細胞CaMKⅡ氧化激活，補體因子B是oxidized-CaMKⅡ激活后的下游效應蛋白。野生型小鼠心肌梗死后心臟中oxidized-CaMKⅡ顯著增加，但是MyD88基因敲除（MyD88-/-）小鼠心肌梗死后心臟由于缺乏MyD88依賴的Toll樣受體信號激活，不表達oxidized-CaMKⅡ。野生型小鼠心肌梗死后心臟中促炎因子TNF-α、補體因子B、心肌細胞死亡和纖維化均顯著增加。與野生型小鼠比較，MyD88-/-小鼠心肌梗死后心肌細胞肥大、凋亡、炎癥、oxidized-CaMKⅡ的表達、梗死后病死率均顯著減少。原因是MyD88-/- 小鼠核因子κB激活存在缺陷[29] 。這些證據表明，Toll樣受體/MyD88這條經典的炎癥信號通路氧化激活CaMKⅡ，oxidized-CaMKⅡ活化NF-κB參與了梗死后的炎癥反應。

綜上所述，作為一個新發現的CaMKⅡ蛋白質翻譯后修飾產物，oxidized- CaMKⅡ參與了諸多心血管疾病的發生發展機制。oxidized-CaMKⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統和腎上腺素能信號系統的重要效益產物，反映器質性心臟病的氧化應激壓力。在心肌細胞中，RAAS系統既氧化激活CaMKⅡ，又磷酸化激活CaMKⅡ。β-腎上腺素能受體信號通路主要磷酸化激活CaMKⅡ。oxidized- CaMKⅡ參與了與心律失常相關的病理性心肌細胞記憶，是病態竇房結綜合征患者的生物學標志物。oxidized-CaMKⅡ參與心肌缺血-再灌注損傷，心肌梗死后的炎癥反應，以及心肌梗死后醛固酮系統誘導的心室重構。持續的氧化應激壓力通過NADPH氧化酶依賴性ROS氧化激活CaMKⅡ，影響I_Na失活，擴大I_Ca，L，觸發EADs 和DADs，導致器質性心臟病患者發生致命性心律失常。

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（收稿日期：2014-10-08）

（本文編輯：鄭辛甜）

P335-338