簡析地中海貧血高風險兒童β—地中海貧血基因

溫乃健

【摘要】目的：探討地中海貧血高風險兒童β-地中海貧血基因的檢測后的檢出率，和該基因的構成情況，并提出有效的防治策略以降低β-地中海貧血發生概率。方法：150例地中海貧血高風險兒童采取雙重PCR技術和反向斑點雜交技術（PDB）進行β-地中海貧血基因檢測、分析。結果：在150例受檢兒童中，檢測出β-地中海貧血兒童49例，占總數的30%左右，涉及基因突變類型8種。結論：不同基因類型具有不同的臨床表現，β-地貧純合子和雙重雜合子具有嚴重的臨床表現，需要制定有效措施來降低這兩種類型兒童的出生率，提高人口素質。

【關鍵詞】地中海貧血；β-地中海貧血基因；兒童

【中圖分類號】R725.5 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0556-02

1、引言

地中海貧血是一組遺傳性溶血性貧血疾病，具有高發病率，由于存在遺傳的基因缺陷，使得血紅蛋白中一種或多種珠蛋白鏈合成減少或不足，其中 -地中海貧血和β-地中海貧血最常見，占有的比例最高。地中海貧血廣泛分布于世界各地，最嚴重地區是東南亞，在我國多數集中在廣東、廣西、四川等地，長江以南各省區只有少數幾例，再往北則更加少見，具有明顯的種族和地域差異性。β-地中海貧血較常出現在兒童身上，發病率較高，嚴重影響兒童的身體健康發育和心理成長，給家庭和社會帶來了沉重負擔。必須采取預防控制措施，有效降低我國高發地區的發病情況。

2、資料與方法

2.1 一般資料

150例地中海貧血高風險兒童均為我院2013年5月至2014年12月期間檢測病人，其中男98例，女52例，年齡普遍在10d～12歲之間。所有病患采取空腹抽外周血2ml，采取EDTA-K2抗凝，血樣在4oC下保存。

試劑：人全血基因組DNA提取試劑盒、β-地中海貧血診斷試劑盒

儀器：TGRADIENT溫度梯度PCR儀器、高壓雙穩電泳儀、瓊脂糖水平電泳槽、凝膠圖像處理系統等。

2.2 方法

（1）診斷

對150例患者提取人全血基因組DNA，一切按照該試劑的操作說明操作。再進行單管二重PCR反應測試，反應結果顯示94oC總變性4min；94oC 60s，56oC 30s，74oC 60s，一共經歷34個循環，循環結束后74oC達到總延伸4min。對PCR產物進行分析：選用適量6 溴酚藍上樣緩沖液和擴增產物3 進行混合均勻，在2.0%的瓊脂糖凝膠上進行上樣，后在70V電泳下操作40min，用數碼凝膠圖像處理系統進行樣品觀察，如樣品中同時存在600bp 和200bp 各1條，則進行后續實驗。

（2）雜交

選用15ml的塑料離心管進行雜交實驗，并對離心管標注受試者編號，在離心管內放入相應的患者雜交膜條，添加10ml雜交液，再添加相應的PCR產物，后封閉離心管。將塑料離心管在沸水中進行10min的加熱處理，再在42oC 的雜交箱內進行5h的雜交。

（3）洗膜

雜交完成后將離心管內的膜條取出，放入42oC的洗膜液中，進行30min的輕搖洗滌。

（4）顯色

選取雜交液按照1：4000比例進行適量的POD溶液配制，將膜條放入溶液中輕搖浸泡30min，再用適量雜交液進行膜條的5min輕搖洗滌2次，后用檸檬酸鈉液再次對膜條進行2min的輕搖洗滌2次，以上過程全部在室溫完成。將取出的膜條浸入到最新配制的顯色液中進行15min的避光顯色操作，完成后的膜條迅速在純水中漂洗，后判定實驗結果。這種檢測方法可同時檢測中國人基因中的8種常見的和9種少見的β-地中海貧血基因突變位點。

（5）實驗結果

對膜條上相應探針位置，判斷是否存在藍色斑點。一般結果有幾下幾種：1）只有突變型探針位置存在藍色斑點，則為純合突變型，該基因點位同時在兩個等位基因處發生了基因突變；2）突變型探針位置不存在藍色斑點而野生型探針位置存在藍色斑點，則為雜合突變型，該基因點位只有一個等位基因處發生了基因突變；3）只有野生型探針位置存在藍色斑點，則為野生型，沒有發生基因突變。

3、結果

通過PCR-PDB方法對150例地中海貧血患者進行診斷，結果為β-地中海貧血基因型正常的兒童有101例，占70%左右，而患有β-地中海貧血的兒童有49例，占30%左右。存在的基因突變類型有8種：CD43（G T），CD26（G A），CD17（A T），CD41-42（-TCTT），-28（A G），CD71-72（+A），-29（A G），IVS-Ⅱ-654（C T）。

4、討論

地中海貧血是一種發病率極高的高風險單基因遺傳病，β-地中海貧血是最主要的一種地中海貧血類型，也是患病率較高的一種。β-地中海貧血的臨床表現較為復雜，基本上有輕、中、重型三種，不同的基因突變形成的臨床表現不同，β-地中海貧血純合子和雙重雜交合子的臨床表現最為嚴重，重度貧血且發病期早，容易形成肝、脾腫大。產生這種現象的主要原因是存在CD17和 CD43這種可以產生無意義的密碼子突變現象，而其他的CD27-28、CD41-42、28/CD71-72存在移碼突變，使得閱讀框架發生變化，影響β珠蛋白肽鏈的正常合成，使其提前終止合成，而654則影響RNA加工，使β珠蛋白肽鏈合成存在障礙等。其中IVS-Ⅱ-654（C T）突變型是最常見的，之后是CD41-42（-TCTT），CD17（A T），-28（A G），這四種突變類型占全部類型中的90%左右

本文的研究對象是地中海貧血高風險地區的兒童，其β-地中海貧血檢出率比其他地區要高，但不能說明實際發病率一定也這么高。廣東、廣西、四川等地是我國地中海貧血高檢出地方，也是較高發病率地點，人口密度基數在我國南方屬于人口密集處，必須制定可行的防止措施降低β-地中海貧血患兒的出生率，如根據四種突變類型最高的基因型提高產前診斷、開展遺傳咨詢等，提高我國人口質量。

參考文獻

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