RNA干擾技術的研究及進展

榮晶晶 和姬苓

【摘要】RNA干擾是近幾年興起的一種新技術，它是由雙鏈核糖核酸引起的抑制基因表達的一種現象。這種新技術在抗病毒、抗癌癥和基因病等醫學領域表現出了廣闊的應用前景。本文就RNA干擾的作用機制 、研究進展進行綜述。

【關鍵詞】RNA干擾技術 基因沉默 研究進展

【中圖分類號】R9145 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0645-01

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是近年來發現的一種高效特異地阻斷基因表達的新技術。RNAi 是指一些小的雙鏈 RNA（dsRNA）在細胞內 Dicer 內切酶的識別、結合、酶切下，產生有活性的長度為 21～23nt 干擾性 RNA（short interfering RNA ，siRNA），與互補的目的基因的 mRNA 結合并使之降解，從而到達抑制目的基因表達的作用，是一種由雙鏈 RNA誘發的“基因沉默”現象。本文旨在講述RNA干擾的作用機制及研究進展。

1. RNA干擾技術的作用機制

RNAi是指細胞中導入與內源性mRNA編碼區某段序列同源的雙鏈 RNA （double—stranded RNA，dsRNA）片段，可致該mRNA發生特異性降解從而導致基因表達沉默的現象[1]。其作用機制是：外源性 （如病毒）或內源性的dsRNA在細胞內與一種具有dsRNA特異性的RNA酶Ⅲ內切核酸酶 （RNaseUIendnuclease）——Dicer結合為酶dsRNA復合物 ，隨即被切割成21～23nt的RNA片段 ，即siRNA。siRNA與 Dicer形成 RISC。siRNA 作為引導序列，按照堿基互補原則識別靶基因轉錄出的mRNA，并引導RISC復合體結合mRNA.隨后siRNA與mRNA在復合體中換位，核酸酶 Dicer將mRNA切割成21～23nt的片段 ，從而可以破壞特定目的基因轉錄產生的mRNA，使其功能沉默，即基因沉默（gene silencing）。而新產生的siRNA片段可再次與Dicer酶形成RISC復合體 ，介導新一輪的同源mRNA降解 ，從而產生級聯放大效應 ，顯著增強了抑制基因表達的作用

2. RNA干擾技術的臨床應用與進展

2.1抗腫瘤治療

2.1.1白血病的治療 化療在惡性腫瘤的治療中具有重要地位。很多學者致力于利用RNA干擾技術治療腫瘤，以解決多重耐藥性導致化療失敗的問題。例如，w0hlbold等[2]構建了針對bcr—abl融合位點 b3a2的同源siRNA，研究結果表明特異性siRNA可以使過表達 bcr—abl蛋白的細胞系（32Dp2102wt，M07P210，CD34 十 2CML細胞 ）的bcr—abl蛋白形成組顯著下降，并且長期用這種特異性 siRNA可以逆轉 bcr—abl蛋白依賴性的細胞循環調節作用而且可以選擇性地抑制細胞生長，為進一步探索慢性粒細胞白血病治療的新途徑提供了有利的實驗依據。

2.1.2治療乳腺癌 乳腺癌細胞在體內具有不受控增殖性，有研究表明利用RNA干擾技術抑制可能導致乳腺癌的基因從而達到控制乳腺癌細胞的增殖，Jiang等[3]通過構建靶向 MTA1 （ metastasis associate d-1）的短發夾RNA（ short hairpin RNA，shRNA） 并導入ER（ +） MCF-7 和 ER（ -） MDA-MB-231 乳腺癌細胞。MTA1 下調后 ER（ -） MDA-MB-231 細胞重新表達 ERα，增加了內分泌治療的敏感性。同時降低基質金屬蛋白酶-9 （ matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 和 cyclin D1 的蛋白表達水平，使MDA-MB-231 細胞阻滯在G0/ G1期，但對MCF-7 細胞的細胞周期無明顯影響。靶向 MTA1 沉默能明顯引起兩種乳腺癌細胞增殖和轉移抑制，RNA 靶向干擾 MTA1 基因可能具有乳腺癌治療效用。 Qiu等 [4]實驗研究表明，利用 siRNA的方法靶向沉默 cripto一1基因的表達可在一定程度上抑制人乳腺癌MDA—MB468細胞的侵襲，進而抑制腫瘤的進一步發展。另外，乳腺癌50% 的首發性和 80% 的復發性轉移發生在骨骼中，Guo等提出靶向 BMP4 信號通路將成為乳腺癌治療的新手段，實驗中通過成功構建靶向BMP4的siRNA并導入MCF-7 和MBA-MD-231細胞中，抑制了癌細胞的侵襲和轉移，證明了 BMP4 在乳腺癌細胞中的作用； 同時發現 MMP-1 和 CXCR4 的表達在 BMP4過表達的細胞中激增。

2.1.3其他腫瘤 腫瘤細胞可持續增殖，Zhou等[5]利用腺病毒介導的 RNAi轉染人食管鱗狀細胞癌細胞 Hecl能抑制腺癌腫瘤的生長和增殖并使其失去致瘤性。應用慢病毒介導的RNA干擾技術將Akt1沉默，并成功轉入胃癌細胞株SGC-7901和BGC-823， 結果也發現， Akt1沉默在體外和體內環境下均可顯著抑制胃癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。鐘英強等研究發現，siRNA靶向沉默 hTERT基因的表達，可在一定程度上抑制人胰腺癌 Capan-2細胞 Bcl-2、環氧化酶 2基因的表達，從而抑制腫瘤進一步惡化[6]。在前列腺癌研究領域中，金鵬等[7]已率先采用RNA干擾技術， 將針對GSTP1設計的短發卡RNA轉染人前列腺癌細胞株Du145介導GSTP1基因沉默， 發現能明顯抑制癌細胞增殖。

2.2抗感染

RNA技術同樣可以用于病毒、寄生蟲甚至細菌引起的感染性疾病中，尤其是對抗病毒情有獨鐘，起初是在植物中發現 RNAi的抗病毒作用，后來在動物中也發現相同的作用。近幾年RNA干擾機制在抗病毒感染的研究中取得了很大進展。在病毒復制時，tat基因轉錄所必需的周期蛋白（cyclin）T1能夠顯著提高病毒基因表達水平。通過 RNAi的方法設計抑制 cyclinT1的表達 ，從而達到抑制病毒復制的目的。Deng等科學家致力于這方面的研究，最后的研究結果表明shRNA能夠阻斷乙型肝炎病毒DNA的表達與復制[8]。

2.3心腦血管疾病

2.3.心血管病 高血壓是最常見的心血管病，張敬群等[9]通過構建兩腎一夾高血壓大鼠模型用攜帶U6啟動子和血管緊張素1受體短發夾RNA編碼序列的質粒干擾AT1a受體，結果證實可有效抑制腎血管性高血壓進展。在心肌病及心力衰竭的研究也有一定進展，李凡東等[10]通過RNA干擾IK1表達，使其電流幅度明顯下降，有利的抑制了心機細胞IK1，為治療心肌病提供了新的方法。Watanabe等[11]將肌漿網Ca2+ATP酶（SERCA2a）的RNA轉染入新生小鼠心肌細胞，通過證實SERCA2a的mRNA和蛋白水平顯著下降，而鈣離子的吸收明顯提高。楊廣等[12]也在實驗中進一步驗證了RNA可干擾心衰大鼠受磷蛋白mRNA的表達，改善心臟功能。

2.3.2腦血管病 2. 腦血管疾病致殘率、致死率極高，治療腦血管病成為了又一個研究重點?；虬悬c治療主要體現在動脈粥樣硬化方面。脂蛋白脂肪酶（LPL）在動脈粥樣硬化中的機制不完全清楚，因此脂蛋白脂肪酶成為治療動脈硬化的突破口。劉明等[13]利用 RNAi 技術在細胞水平抑制LPL 基因的表達，結果證實抑制率可達 70%以上。這一結果為以后控制和預防腦血管疾病提供了理論依據。洪濤等[14]應用 RNAi 技術沉默平滑肌細胞間隙連接蛋白 43（ connexin43，Cx43）的表達，從而抑制了細胞間的通訊。在此基礎上，他們繼續采腺病毒介導的RNAi特異干擾腦血管痙攣 Cx43 的異常高表達，進一步證實 Cx43 及縫隙連接在腦血管痙攣發生、發展中的重要作用，也為探討腦血管疾病的基因治療做出貢獻。

2.4其他

還可用于遺傳病的研究中， RNAi在基因功能和相關方面的研究中具有許多傳統方法無法比擬的優勢 ，因此許多遺傳學家和分子生物學家對此產生了極大興趣，RNA干擾技術成為了遺傳學研究的新方法。實驗研究發現，在體內siRNA能夠直接作用于點突變的基因使其功能喪失降低突變，野生型基因卻不受影響，因為點突變引發的遺傳性疾病能夠通過應用 RNAi技術降低突變方法進行治療。例如 ，遺傳性神經系統退化性疾病Huntington病和 Alzheimer病的治療就可以通過RNAi技術，即在腦部局部注射siRNA進行基因治療；再如應用 RNAi技術治療常染色體顯性色素性視網膜炎 （adRP）的轉基因小鼠，取得了良好的效果。

3.研究進展

siRNA 的這種非特異性反應和 RNA 傳遞效率極大地影響著它的體內應用，但進一步合理設計高效 siRNA 序列、開發在體內具有長效功能的載體、完善更為特異性的體內輸送途徑等將成為進一步促進 RNAi 作為疾病治療策略的研究熱點。隨著 RNAi 機理的進一步闡明，RNAi 技術將以驚人的速度向前發展，不斷取得突破，聯合多基因 RNAi 治療也將為基因治療開辟更廣闊的前景?？傊?，隨著RNA干擾機制研究的深入和完善，應用RNA干擾技術，必將大力推動人類疾病的治療和人類功能基因組學的發展。

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