鏈霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023多功能葡糖淀粉酶SoGA的克隆、表達及鑒定

王苗李園園岳昌武邵美云呂玉紅保玉心黃英

（1.遵義醫學院醫學與生物學研究中心 貴州省普通高校微生物資源及藥物開發特色重點實驗室，遵義 563003；2.中國科學院微生物研究所，北京 100101）

鏈霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023多功能葡糖淀粉酶SoGA的克隆、表達及鑒定

王苗1李園園1岳昌武1邵美云1呂玉紅1保玉心1黃英2

（1.遵義醫學院醫學與生物學研究中心 貴州省普通高校微生物資源及藥物開發特色重點實驗室，遵義 563003；2.中國科學院微生物研究所，北京 100101）

根據海洋來源鏈霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因組測序結果設計特異引物，通過PCR擴增獲得1條全長為1 788 bp的糖苷水解酶15家族蛋白新成員完全編碼區DNA片段，該片段編碼1個595個氨基酸殘基、分子量為66.2 kD的預測蛋白。利用基因工程技術將該片段重組入原核表達質粒pET32a并轉化宿主菌BL21（DE3）plySs，IPTG誘導融合蛋白表達，表達的包涵體融合蛋白經純化、復性后利用DNS法測定其在不同溫度、pH條件下催化不同底物產生還原糖的活性。結果表明，該酶能夠水解纖維素、淀粉等多種底物產生還原糖活性，且對不同底物表現不同的最適pH和最適反應溫度。

鏈霉菌；葡糖淀粉酶；基因克??；蛋白表達；酶活

葡糖淀粉酶（Glucoamylase，GA）是一大類能夠從淀粉等底物分子的非還原端開始，逐步水解底物中的α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵產生葡萄糖的糖苷水解酶第15超家族（http：//www.cazy. org/GH15.html）的酶類（EC 3.2.1.3）。葡糖淀粉酶的天然底物主要是各種來源的淀粉，包括直鏈淀粉、支鏈淀粉和各種糊精等，葡糖淀粉酶底物專一性較低，既能從淀粉鏈的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵，也能緩慢切開α-1，6糖苷鍵，將直鏈淀粉從非還原性末端依次切下葡萄糖單位，當底物為支鏈淀粉，遇到α-1，6糖苷鍵分支時，先切割α-1，6糖苷鍵，再切割α-1，4糖苷鍵，從而使支鏈淀粉水解成葡萄糖。在工業上由于葡糖淀粉酶主要用于水解淀粉來生產葡萄糖，因而廣泛應用于酒精、淀粉糖、味精、檸檬酸、啤酒、白酒、黃酒等食品工業生產［1-8］、農產品加工［9-11］以及抗菌素醫藥工業等［12，13］。早期工業上應用的葡糖淀粉酶主要來自于根霉、黑曲霉、紅曲霉等霉菌［1，14-20］，隨著生物技術的發展以及工業需求的變化，當前對于葡糖淀粉酶的研究主要集中在新型酶制劑的開發、高耐受性酶篩選及優良基因工程菌株的構建等方面，研究者對多種微生物來源的淀粉水解酶進行了篩選研究，以期獲得具有良好工業利用潛力的葡糖淀粉酶［21］。迄今，碳水化合物活性酶數據庫（carbohydrate-active enzymes，http：//www.cazy.org）已收錄1 491種不同來源的葡糖淀粉酶數據信息，其中古菌來源202種，細菌來源1 090種，真核生物來源186種，未知來源13種。在這1 000多種葡糖淀粉酶中，有57種酶的功能已得到驗證，其中包括1種鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus subsp. limoneus來源的葡糖淀粉酶VLdI［22］。

本研究擬利用基因工程技術克隆并原核表達鏈霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因組中預測的1條葡糖淀粉酶基因，通過DNS法檢測該重組蛋白在不同條件下催化不同底物的生物活性，初步評估其應用潛力，旨在為進一步開發利用該酶提供試驗依據，給農產品加工、食品及醫藥工業生產等提供新的水解碳水化合物產生葡萄糖的葡糖淀粉酶來源。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023（CGMCC 4.7054）由中科院微生物所黃英課題組分離自1 180 m深的南海海泥，大腸桿菌基因工程菌JM109、BL21（DE3）pLysS感受態細胞及高純質粒提取試劑盒等購自博邁德（北京）生物科技公司；基因克隆載體pMD18-T simple 購自寶生物（大連）公司；rTaq等PCR反應試劑、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、去磷酸化酶等分子克隆所用酶類購自富酶泰斯（深圳）生物科技公司；培養基、蛋白質表達純化等生化藥品如無特殊說明均購自碧迪醫療（上海）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒等購自愛思進（杭州）生物技術有限科技公司；引物合成及測序由英濰捷基（廣州）有限公司完成。葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、 氫氧化鈉、甲基纖維素鈉、直鏈淀粉、支鏈淀粉及可溶性淀粉等酶活測定試劑或標準品購自阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┕?。

1.2 方法

1.2.1 目的基因克隆及原核表達質粒載體構建 利用primer5.0等生物軟件，根據課題組前期鏈霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因組測序結果（GenBank登錄號APIV00000000.1）設計SoGA編碼基因的完全編碼區擴增引物：上游引物sogaEF：5'-CCGGAATTCATGCACCCCCGTATCGAGGA-3'，下游引物sogaER：5'-CCCAAGCTTCTATCCTGCATCCTCTTCCCCG-3'（下劃線分別為限制酶EcoR I和Hind III識別位點）。利用熱酚法提取Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因組DNA，加入無DNase污染的RNaseA去除RNA后，經1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測DNA質量合格后用于PCR模板進行目的基因PCR擴增，PCR體系如下：rTaq 2 U，sogaEF 20 pmol，sogaER 20 pmol，DMSO 3.0 μL，dNTPmix（10 nmol/L each）1.5 μL，模板DNA 100 ng，10×PCR buffer 5.0 μL，去離子水補足至50 μL。PCR擴增程序：95℃預變性3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個循環；72℃總延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用PCR產物純化試劑盒純化目的片段。取300 ng純化的PCR產物和50 ng的pMD18-T simple 室溫（約20℃）連接3 h，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞。37℃，200 r/min振蕩培養1 h，取200 μL轉化產物涂布于含終濃度為100 ng/μL氨芐西林的LB固體平板，37℃倒置培養過夜后，無菌牙簽挑取轉化子置于600 μL含終濃度為100 ng/μL氨芐西林的LB液體培養基中220 r/min，37℃培養3 h，取1 μL培養物與20 μL PCR體系中進行菌液PCR擴增，篩選重組子。菌液PCR體系如下：rTaq 0.8 U，正向引物M13-47F（5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'）10 pmol，反向引物M13-48R（5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）10 pmol，DMSO 1.0 μL，dNT-Pmix（10 mmol/L each）0.75 μL，菌液1 μL，10×PCR bu-ffer 2.0 μL，去離子水補足至20 μL。菌液PCR擴增程序：95℃預變性3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個循環；72℃總延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據長度初步判斷是否為陽性重組子。取500 μL經菌液PCR篩選、鑒定后的重組子菌液，高純質粒提取試劑盒法提取質粒DNA并利用EcoR I/Hind III限制酶雙酶切鑒定。經酶切進一步鑒定的重組子由英濰捷基有限公司完成測序并利用BLAST軟件比對以確定克隆得到DNA片段是否為目的基因，鑒定后的陽性重組子命名為pMD-soga。利用EcoR I/Hind III限制酶雙酶切2 μg的 pMD-soga質粒DNA，DNA凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段。取500 ng回收的雙酶切目的DNA片段和100 ng經EcoR I/Hind III限制酶雙酶切并去磷酸化的pET32a質粒DNA，T4 DNA連接酶室溫連接3 h，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞。轉化子篩選、重組子鑒定流程除菌液PCR引物使用基因特異引物外與前述pMD-soga質粒鑒定完全一致，經測序驗證后的原核表達質粒載體命名為pET-soga。

1.2.2 目的蛋白誘導表達 分別取100 ng pET-soga質粒和pET32a質粒，轉化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS感受態細胞，轉化子經過夜培養、T7啟動子引物（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）/T7終止子引物（5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'）菌液PCR鑒定后，將含重組質粒的基因工程菌分別命名為pET-soga BL21和pET32aBL21。取前述2種基因工程菌各50 μL，分別接種于5 mL含終濃度為100 ng/μL氨芐西林的LB液體培養基中220 r/min，37℃培養3 h后分別接種100 mL含終濃度為100 ng/μL氨芐西林的LB液體培養基中220 r/min，37℃培養至OD600=0.3時，取5 mL上述培養物分裝至50 mL無菌離心管，加入終濃度為0、0.5、1.0和2.0 mmol/L的IPTG，分別置于18℃、28℃和37℃誘導6 h。取1 mL誘導后培養物，4 000 r/min離心5 min，菌體沉淀加入100 μL的5×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，置于99℃金屬浴中裂解10 min，12 000 r/min，室溫離心10 min，上清即為菌體總蛋白裂解液。分別取10 μL總蛋白裂解液上樣，10%的SDS-PAGE凝膠電泳?？捡R斯亮藍R250染色6 h后，甲醇-冰醋酸脫色液脫色6 h，判斷蛋白質表達情況。根據目的蛋白表達情況，選取250 mL三角瓶中加入100 mL含終濃度為100 ng/μL氨芐西林的LB液體培養基，OD600=0.3時加入1.0 mmol/L IPTG于37℃ 220 r/min振蕩培養6 h為表達條件，大量誘導表達目的蛋白。

經SDS-PAGE鑒定表達目的蛋白的發酵物，4 000 r/min，4℃離心10 min，收集菌體，PBS（pH 7.6）漂洗3次后加入10 mL含終濃度為25 ng/mL溶菌酶、0.1%脫氧膽酸鈉的PBS（pH7.6）重懸菌體，于超聲裂解儀冰浴條件下超聲破碎細菌。取100 μL裂解液，12 000 r/min，4℃離心10 min，上清加入500 μL冰冷丙酮后置冰上10 min后12 000 r/min，4℃離心10 min。菌體超聲裂解物沉淀加入50 μL的5×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，置于99℃金屬浴中裂解10 min，12 000 r/min，室溫離心10 min，分別取10 μL總蛋白裂解液上樣，10%的SDS-PAGE凝膠電泳判斷蛋白質表達狀態。

1.2.3 包涵體蛋白純化與復性 取超聲裂解后的總蛋白沉淀，加入15 mL預冷PBS（pH7.6）漂洗3次去除可溶蛋白后，每1.0 g濕蛋白加入100 mL冰冷的8 mol/L尿素4℃放置過夜重溶包涵體。待無肉眼可見懸浮物后，12 000 r/min，4℃離心10 min。取上清，置冰上緩慢加入冰冷的包涵體蛋白稀釋緩沖液（含0.5 mol/L精氨酸，10%甘油的PBS緩沖液，pH7.6）至尿素終濃度為0.5 mol/L。將稀釋后的包涵體蛋白轉移至透析袋（截留分子量300 000），冰浴條件下用包涵體蛋白稀釋緩沖液每4 h換取1次透析液，50 r/min連續振蕩透析24 h去除尿素。最后以不含精氨酸的包涵體蛋白稀釋緩沖液透析去除精氨酸。

1.2.4 酶活測定 根據葡糖淀粉酶催化活性，以單位時間內每克酶蛋白催化產生還原性糖的摩爾數作為該酶的活力單位（U）。采用DNS法［23］測定反應產生還原性糖量。具體操作為在350 μL反應體系中加入0.1 mg酶蛋白和相應的底物，pH7.0條件下，分別在40、45、50、55、60和65℃反應30 min后，加入150 μL DNS試劑沸水煮5 min，立即冰浴冷卻至室溫，分別檢測其波長540 nm的光密度值，根據標準曲線計算相應的溫度下酶活。該酶催化最適pH測定采取梯度pH法，即各自底物最適催化溫度下，分別在pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0條件下反應30 min后，加入150 μL DNS試劑沸水煮5 min，立即冰浴冷卻至室溫，分別檢測其在波長540 nm的光密度值，根據標準曲線計算相應的pH下酶活。

2 結果

2.1 soga基因克隆及序列分析

通過特異引物PCR擴增得到1條全長為1 788 bp目的片段，菌液PCR篩選結合EcoR I/Hind III限制酶雙酶切鑒定該片段T/A克隆的陽性重組子測序NCBI在線BLAST結果表明，成功從海洋鏈霉菌Streptomyces oLivaceus FXJ7.023克隆到1條編碼595個氨基酸殘基、分子量為66.2 kD編碼糖苷水解酶15家族蛋白新成員，命名為soga。預測的SoGA氨基酸序列與已鑒定功能的微生物來源的糖苷水解酶15家族葡糖淀粉酶進行系統進化分析，結果（圖1）表明，與SoGA氨基酸序列相似性最高的葡糖淀粉酶是Streptomyces hygroscopicus subsp. limoneus來源的VLdI（相似性為58%），與真核微生物Blastobotrys adeninivorans來源的GaA的氨基酸序列相似性24%，與古菌Thermoplasma acidophilum來源的TaGA的氨基酸序列相似性僅為19%，表明該蛋白是一個較新的編碼糖苷水解酶15家族蛋白。

圖1 微生物來源已知功能葡糖淀粉酶系統進化分析

2.2 Trx-SoGA融合表達及純化

SDS-PAGE結果（圖2）表明，與未加IPTG誘導的基因工程菌pET-soga BL21總蛋白相比，加入1.0 mmol/L IPTG誘導的基因工程菌pET-sogaBL21總蛋白中出現1條明顯的分子量約為80 kD新蛋白條帶，與預期重組蛋白分子量大小一致，表明Trx-SoGA成功被誘導表達。進一步分析表明誘導表達菌裂解上清液中無該目的蛋白存在，表明該蛋白是以包涵體的形式表達。誘導表達的菌體沉淀超聲裂解物經PBS漂洗多次后，可見乳白色沉淀且能完全溶解入8 mol/L尿素。包涵體尿素溶液經包涵體稀釋液緩慢稀釋到尿素終濃度為0.5 mol/L時，未見蛋白沉淀析出，表明包涵體通過稀釋成功復性。將復性成功的Trx-SoGA透析去除殘留尿素，SDS-PAGE復性效果表明，Trx-SoGA以可溶形式存在于透析后上清液中。

圖2 重組蛋白Trx-SoGA表達及純化效果分析

2.3 溫度對Trx-SoGA酶活的影響

利用DNS法在pH7.0條件下，分別在不同溫度下測定Trx-SoGA催化不同底物產生還原性糖的酶活，結果（圖3）表明，Trx-SoGA催化底物羧甲基纖維素的酶活在40℃時達到最大值（1.36 mmol/g）；以可溶性淀粉為底物時，Trx-SoGA酶活在40℃時達到最大值（1.95 mmol/g）；而分別以直鏈淀粉和支鏈淀粉為底物時，該重組蛋白的最適反應溫度則分別為55℃（酶活為2.03 mmol/g）和45℃（酶活為1.90 mmol/g）。

圖3 溫度對Trx-SoGA催化底物產生還原性糖酶活的影響

2.4 pH對Trx-SoGA酶活的影響

Trx-SoGA水解不同底物產生還原性糖酶活的結果（圖4）表明，該蛋白水解羧甲基纖維素的最適pH為6.0（酶活為1.34 mmol/g），水解可溶性淀粉為最適pH為6.5（酶活為3.39 mmol/g），水解直鏈淀粉的最適pH為8.5（酶活為1.04 mmol/g），而催化支鏈淀粉的最適pH是8.0（酶活為1.59 mmol/g）。

3 討論

工業上用于水解生產糖類的淀粉原料主要有小麥淀粉、玉米淀粉、大米淀粉及薯類淀粉等。利用淀粉水解產生葡萄糖的方法主要有酸水解法［24，25］、酶水解法［26，27］和酸酶結合水解法［28，29］。酸水解法以酸（無機酸或有機酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解轉化為葡萄糖的方法，雖然具有過程簡單、產能大、時間短、技術含量低等優點，但存在要求設備耐腐蝕、耐高溫、高壓，淀粉利用率低以及淀粉原料要求嚴格（顆粒大小均勻等）、淀粉濃度不宜過高，且在酸水解過程中有副反應的發生，特別是產物直接用于食品和藥品原料時存在安全隱患等缺點。而酶法則能很好地克服酸水解法的這些缺點，特別是條件溫和、轉化率高和產品安全，盡管存在耗時較長、后期加工流程長和設備多等缺點，但只要隨著新型酶制劑的發現及酶解工藝的改進，酶法將會取代酸水解法成為工業制糖的主要方法。

農產品加工、食品及醫藥工業生產上應用的葡糖淀粉酶都是利用其熱穩定性，目前研究者主要是通過霉菌、酵母等真菌中篩選熱穩定的糖化酶生產菌株方法獲得熱穩定性好的葡糖淀粉酶［15，30］，由于還沒有理想的常溫水解生淀粉的葡糖淀粉酶產品，真正得到應用的基因工程葡糖淀粉酶較少。一般情況下，糖化酶都具有較寬的pH適應范圍，但最適pH多為4.5-6.0，不同來源的葡萄糖淀粉酶的糖化最適溫度和pH值可能存在一定的差異。例如，黑曲霉為55-60℃，pH值3.5-5.0；根霉50-55℃，pH值4.5-5.5；擬內孢霉為50℃，pH值4.8-5.0。葡糖淀粉酶底物專一性較低，可水解直鏈淀粉、支鏈淀粉及糊精等產生還原性糖，但目前尚未見同時具有水解纖維素活性的葡糖淀粉酶的報道。雖然本研究的結果離工業應用可能還有一定的距離，但如果結合現代基因工程技術對該酶進行相應的突變等相關操作，進一步提高其催化活力和改善催化條件，可望在農產品加工、食品及醫藥等工業生產得以應用。

圖4 pH對催化底物產生還原性糖酶活的影響

4 結論

本研究利用PCR技術從海洋來源的鏈霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因組DNA中成功克隆1個預測編碼葡糖淀粉酶基因soga，并在大腸桿菌中成功表達出分子量約為80 kD的重組葡糖淀粉酶Trx-SoGA，DNS法檢測結果表明該酶可水解直鏈淀粉、支鏈淀粉及可溶性淀粉等不同來源淀粉及羧甲基纖維素產生還原性糖，且該酶對不同底物表現出較廣的最適pH范圍（pH6.0-8.5）和較低最適反應溫度范圍（40-55℃）。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation，Expression and Identification of Multifunctional Glucoamylase from Marine Streptomyces olivaceus FXJ7.023

Wang Miao1Li Yuanyuan1Yue Changwu1Shao Meiyun1Lü Yuhong1Bao Yuxin1Huang Ying2
（1. Guizhou Key Laboratory of Microbial Resources & Drug Development，Zunyi Medical College，Zunyi 563003；2. Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

SoGA， a predicted glucoamylase encoded by a full-length 1 788 bp gene consists of 595 amino acids was cloned from Streptomyces olivaceus strain FXJ7.023 genomic DNA by PCR. Heterologous expression of SoGA in Escherischia coli strains BL21（DE3） plysS was performed and a fusion protein with molecular weight of 83.22 kD was obtained. The novel recombinant glucoamylase showed multifunctional catalytic activity of hydrolyze carboxymethylcellulose and starch under different temperature and pH.

streptomycetes；glucoamylase；gene clone；protein expression；enzyme activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.024

2014-06-23

國家自然科學基金項目（31160004），國家重點基礎科學研究計劃（2011CB808800），貴州省教育廳特色重點實驗室建設項目（黔教合KY字［2012］011號），貴州省科技學技術基金項目（黔科合J字［2010］2156號，黔科合J字［2012］2348號，黔科合SY字［2013］3013號）

王苗，女，碩士，研究方向：微生物天然產物生物合成；E-mail：wmhappy@nwsuaf.edu.cn

岳昌武，男，博士，副研究員，副教授，碩士生導師，研究方向：微生物天然產物生物合成；E-mail：changwuyue@126.com黃英，研究員，博士生導師，研究方向：放線菌系統學與資源；E-mail：huangy@im.ac.cn.