調節Lnk/SCF-cKit反應軸改善糖尿病大鼠牙槽骨缺損早期愈合的研究

李 昊, 周海倫, 王 琪, 李 偉

(1. 廣西醫科大學附屬口腔醫院口腔修復科, 廣西 南寧 530021；2. 四川大學華西口腔醫學院口腔疾病研究國家重點實驗室, 四川 成都 610041)

調節Lnk/SCF-cKit反應軸改善糖尿病大鼠牙槽骨缺損早期愈合的研究

李 昊1, 周海倫1, 王 琪2, 李 偉2

(1. 廣西醫科大學附屬口腔醫院口腔修復科, 廣西 南寧 530021；2. 四川大學華西口腔醫學院口腔疾病研究國家重點實驗室, 四川 成都 610041)

目的: 探討調節Lnk/SCF- cKit反應軸對糖尿病大鼠牙槽骨缺損早期愈合的影響。方法：誘導大鼠形成糖尿病并構建牙槽骨缺損模型后，隨機分為3組(n=10), 空白對照組不做任何處理, 陰性對照組注射空載體質粒, RNAi組注射靶向Lnk的RNA干擾質粒。28 d后處死各組大鼠，HE染色檢測局部骨缺損愈合狀況; 免疫印跡實驗檢測骨缺損部位Lnk、SCF、cKit以及ALP、OCN、ColIa1的表達水平。結果：構建缺損28 d后，RNA干擾組骨組織再生Lane- Sandhu評分高于各組糖尿病大鼠(P<0.05)；免疫印跡實驗顯示，與其他各組糖尿病大鼠相比，RNA干擾組的Lnk蛋白表達水平降低，但SCF、cKit、ALP、OCN、ColIa1蛋白表達水平增加(P<0.05)。 結論：抑制Lnk表達、激活SCF- cKit通路可能改善糖尿病大鼠牙槽骨缺損的早期愈合。

Lnk; SCF- cKit反應軸; 糖尿病; 骨缺損

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.12.003

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(12): 713]

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，我國的發病率逐年上升。糖尿病患者易發生骨愈合障礙，從而導致拔牙創愈合遲緩等后果，因此對多種口腔疾病治療的實施產生不利影響。其發病機制復雜，常規療法效果不佳，如何治療糖尿病骨疾病是目前口腔醫學領域的難點之一。

有研究表明，糖尿病高糖狀態可影響細胞的骨向分化，進而影響骨缺損愈合過程，在臨床調查和動物實驗中均可發現，高血糖狀態下骨缺損愈合時間比血糖正常者長[1-3]。某些蛋白對細胞骨向分化有重要調節作用，如改變這些蛋白的激活或表達水平，則可改變骨缺損修復進程，從而改善骨愈合狀況[4-5]。近年發現，Lnk蛋白在多種信號轉導過程中具有重要的橋梁作用，其能負性調節下游的SCF- cKit反應軸，進而影響細胞的分化等過程[6-7]。有研究顯示，在多種病理狀態下，Lnk蛋白的表達水平增加；抑制Lnk蛋白的表達可調節Lnk/SCF- cKit反應軸，從而促進實驗動物骨折部位的骨形成[7-8]，但在糖尿病狀態下調節Lnk蛋白的表達，其下游SCF- cKit反應軸是否也發生改變，骨缺損愈合過程是否會受到影響，尚未見報道。

本研究擬用RNA干擾技術靶向抑制糖尿病大鼠牙槽骨缺損部位的Lnk蛋白的表達，觀察缺損部位骨愈合情況，并檢測SCF- cKit反應軸及成骨相關蛋白表達的變化，探討改善糖尿病狀態骨缺損愈合的方法，為探尋糖尿病骨疾病的治療措施提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(Sigma，美國)；靶向干擾Lnk基因的shRNA(Dharmacon，美國)；靶向Lnk的shRNA的AteloGene膠體(廣州波柏)； Nikon 80i型顯微鏡(Nikon，日本)；鼠抗單克隆抗體Lnk、SCF、ALP(alkaline phosphatase)、OCN(osteocalcin)、ColIa1(collagen type I a1)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、通用型二抗(Santa Cruz，美國)；兔抗多克隆抗體cKit(Abcam，美國)；BIO- RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(BIO- RAD，美國)。

1.2 構建大鼠糖尿病模型

取SPF級4周齡SD雄性(購自成都達碩實驗動物有限公司)大鼠40只(體質量60～80 g), 隨機選取30只以高糖飼料聯合鏈脲佐菌素法誘導其形成糖尿病(即經過高糖飼料喂養4周)，空腹 12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg，1周后取尾靜脈血檢測空腹血糖值，超過11.1 mmol/L者為糖尿病模型構建成功[9]，形成糖尿病后以常規鼠飼料喂養。30只糖尿病大鼠隨機分為空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組(n=10)。其余10只大鼠，不進行糖尿病誘導，均以常規鼠飼料喂食，作為正常對照組。處死前測定各組動物空腹血糖值確定是否為糖尿病狀態。

1.3 構建大鼠牙槽骨缺損模型及缺損局部的RNA干擾

確定糖尿病模型構建成功后，參考本課題組前期實驗方法[10]，對所有大鼠構建雙側上頜牙槽骨缺損模型。以100 g/L的水合氯醛按250 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，在上頜第一磨牙腭側分離牙齦及粘骨膜后，從近中向遠中磨除部分骨質，制備長3 mm、寬1.5 mm、深1.5 mm的缺損后，縫合軟組織并關閉創口。參考文獻[8]方法，RNA干擾組: 在骨缺損立即注射5 μL含有1 μmol/L靶向Lnk的shRNA的AteloGene膠體(正義鏈5’-CGAGUUACCUCUUUCCUUA-3’)；陰性對照組: 在骨缺損處注射5 μL含有1 μmol/L空載體質粒的AteloGene膠體；空白對照組及正常對照組不做注射。

1.4 HE染色檢測骨缺損的愈合狀況

在構建缺損28 d后，處死各組動物，取其左側上頜組織于40 g/L多聚甲醛中固定24 h后，100 g/L EDTA溶液中脫鈣3個月，每2 d換液1次。脫鈣結束后，將組織常規脫水、包埋，所得標本蠟塊按4 μm厚度連續切片，常規進行HE染色，在Nikon 80i型顯微鏡下觀察術區，計算各組標本骨組織再生Lane- Sandhu評分。

1.5 免疫印跡實驗檢測骨缺損區的蛋白表達

處死各組大鼠后，取其右側上頜組織并分離牙齦及粘骨膜后，取原術區組織在冰上裂解勻漿，12 000 g 離心40 min，取上清提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量以及SDS- PAGE凝膠電泳，濕轉后于50 g/L脫脂牛奶中封閉l h，鼠抗單克隆抗體Lnk、SCF(1 ∶500)、兔抗多克隆抗體cKit(1 ∶600)、鼠抗單克隆抗體ALP、OCN、ColIa1、GAPDH(1 ∶600)作為一抗并孵育2 h，通用型二抗(1 ∶1 000)孵育2 h，ECL顯影，BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統觀察并比較目的蛋白與內參GAPDH條帶平均灰度比值。

1.6 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件對數據(均數±標準差)進行分析，各組間比較采用成組設計方差分析，兩兩比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠空腹血糖值比較

各組大鼠處死當日測其空腹血糖值，正常對照組為(5.752±1.043)mmol/L，低于糖尿病各組(P<0.05)；空白對照組、陰性對照組與RNA干擾組的空腹血糖值分別為(17.594±2.125)mmol/L、(18.366±1.738)mmol/L、(17.102±1.465)mmol/L，3組間無統計學差異(P>0.05)。

2.2 各組大鼠骨缺損愈合狀況比較

HE染色檢測顯示，正常對照組骨缺損區骨形成量較多，但纖維組織較少；糖尿病各組纖維組織較多，但骨組織較少；陰性對照組與RNA干擾組骨組織周圍可見部分空隙，此空隙由標本處理過程中殘余的AteloGene膠體脫落所致(圖1)。骨組織再生Lane- Sandhu評分結果顯示，正常對照組為6.357±0.912，高于糖尿病各組(P<0.05)；RNA干擾組為4.506±0.575，高于空白對照組(3.269±0.423)和陰性對照組(3.144±0.358)(P<0.05)；而空白對照組與陰性對照組相比，Lane- Sandhu評分無統計學差異(P>0.05)。

正常對照組 空白對照組 陰性對照組 RNA干擾組

圖1 骨缺損構建28 d后大鼠牙槽骨缺損區愈合狀況(HE染色, ×200)

2.3 各組大鼠骨缺損區Lnk- SCF/ckit反應軸主要蛋白表達水平比較

免疫印跡實驗檢測顯示，與正常對照組相比，糖尿病各組骨缺損區Lnk蛋白表達水平較高， SCF、cKit蛋白表達水平較低(P<0.05)；與空白對照組、陰性對照組相比，RNA干擾組Lnk表達水平降低，而SCF、cKit表達水平升高(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組的Lnk、SCF、cKit表達水平均無計學差異(P>0.05)(圖2，表1)。

2.4 各組大鼠骨缺損區成骨相關蛋白表達水平比較

免疫印跡實驗檢測顯示，糖尿病各組骨缺損區成骨相關蛋白ALP、OCN、ColIa1的表達水平明顯低于正常對照組(P<0.05)；RNA干擾組ALP、OCN、ColIa1的表達水平明顯高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；空白對照組與陰性對照組相比，ALP、OCN、ColIa1蛋白的表達水平無統計學差異(P>0.05)(圖2，表1)。

A. 正常對照組; B. 空白對照組; C. 陰性對照組; D. RNA干擾組

相關蛋白正常對照組空白對照組陰性對照組RNA干擾組Lnk0.317±0.045b0.965±0.101ab0.903±0.114ab0.552±0.043aSCF0.946±0.092b0.423±0.061ab0.407±0.042ab0.653±0.054acKit0.851±0.064b0.317±0.052ab0.353±0.026ab0.519±0.047aALP0.893±0.056b0.562±0.038ab0.545±0.043ab0.687±0.036aOCN0.825±0.061b0.435±0.032ab0.398±0.046ab0.605±0.044aColIa10.867±0.058b0.326±0.052ab0.385±0.041ab0.523±0.039a

a與正常對照組相比P<0.05；b與RNA干擾組相比P<0.05

3 討論

目前，糖尿病已被世界衛生組織列為嚴重影響人類健康的第三大疾病，其典型特征是血液葡萄糖水平異常增高。既往研究顯示，具有分化功能的細胞發生骨向分化時可形成骨組織，在骨缺損愈合的過程中具有重要作用；而糖尿病高糖狀態可影響細胞的骨向分化過程，使骨組織缺損愈合延遲[1-2]。提示，改善高糖狀態下細胞的骨向分化能力，可能成為探尋糖尿病骨疾病治療措施的切入點之一。

Lnk蛋白是一種含有多個結構域的連接蛋白，在其介導的細胞信號轉導通路中具有重要的橋梁作用，可溝通整條通路的信號轉導[6, 11]。近年來發現Lnk蛋白能負性調節多種細胞的分化，如內皮祖細胞、成骨細胞等，并在多種病理狀態下高表達[7-8, 12]。另有研究表明，敲除Lnk可促進小鼠成骨細胞骨向分化，并在骨折愈合過程中加速骨形成，但其作用機制尚不清楚[7]。另有研究顯示，SCF- cKit反應軸是Lnk蛋白重要的下游信號轉導途徑之一，參與多種細胞的分化過程，激活SCF- cKit反應軸可促進具有分化功能的細胞分化為內皮細胞等，從而促進組織再生[8, 13]。Lnk蛋白可通過其Src同源區2結構域影響SCF和cKit的特異性結合，可改變cKit的激活水平，進而影響下游通路轉導細胞分化等信號[14]。研究顯示，調節Lnk/SCF- cKit反應軸可促進成骨細胞形成鈣化結節[8]。

本實驗誘導大鼠形成糖尿病并構建上頜牙槽骨缺損模型，局部轉染靶向Lnk的shRNA，在構建骨缺損28 d后，可觀察到正常對照組大鼠的骨組織再生評分高于糖尿病各組，Lnk蛋白表達水平則低于糖尿病各組；與空白對照組和陰性對照組相比，RNA干擾組的骨組織再生評分增高，Lnk蛋白表達水平降低; 提示， 在糖尿病狀態下牙槽骨缺損早期愈合障礙與Lnk過表達有關，抑制Lnk蛋白的表達水平可改善該愈合障礙。同時，免疫印跡實驗結果顯示，與正常對照組相比，糖尿病各組SCF、cKit蛋白的表達水平較低；RNA干擾組的SCF、cKit蛋白表達水平高于空白對照組與陰性對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；空白對照組與陰性對照組相比，SCF、cKit的表達未見統計學差異，提示在糖尿病狀態下抑制骨缺損部位過表達Lnk，可激活SCF- cKit反應軸。

某些蛋白在骨組織缺損愈合過程中是必需的，是細胞骨向分化的重要特征。既往研究表明，ALP是成骨樣細胞的特征性標記[15]；OCN是細胞骨向分化、成熟時分泌到胞外成為無定形基質的組成部分，是成骨過程中的特異蛋白之一[16]；ColIa1是由骨形成細胞產生的有機成分，其基因突變可引起成骨不全等骨疾病，也是細胞骨向分化的重要標志之一[17]。本實驗結果顯示，與正常對照組大鼠相比，各組糖尿病大鼠骨缺損區高表達Lnk蛋白的同時，低表達SCF、cKit、ALP、OCN、ColIa1蛋白，提示糖尿病狀態下骨缺損區的細胞存在成骨功能障礙，并可能與Lnk/SCF- cKit反應軸的激活異常有關。與空白對照組、陰性對照組相比，RNA干擾組骨缺損區低表達Lnk蛋白，且高表達SCF、cKit、ALP、OCN、ColIa1蛋白，提示靶向抑制Lnk蛋白的表達，激活SCF- cKit反應軸可能改善糖尿病狀態牙槽骨缺損區細胞骨向分化，促進骨缺損修復。

綜上所述，抑制Lnk蛋白的表達可能促進SCF-cKit反應軸的激活并改善糖尿病狀態下牙槽骨缺損的早期愈合，調節Lnk/SCF- cKit反應軸可能為探尋治療糖尿病骨疾病的方法提供新思路。

[1]Preshaw P, Alba A, Herrera D,etal. Periodontitis and diabetes: a two- way relationship[J].Diabetologia, 2012, 55(1): 21-31.

[2]Chang P, Chung M, Wang Y,etal. Patterns of diabetic periodontal wound repair: a study using micro- computed tomography and immunohistochemistry[J].JPeriodontol, 2012, 83(5): 644-652.

[3]Beam H, Parsons J, Lin S. The effects of blood glucose control upon fracture healing in the BB Wistar rat with diabetes mellitus[J].JOrthopRes, 2002, 20(6): 1210-1216.

[4]Ribeiro FO, Gómez- Benito MJ, Folgado J,etal. In silico mechano- chemical model of bone healing for the regeneration of critical defects: the effect of BMP- 2[J].PLoSOne, 2015, 10(6): e0127722.

[5]Arioka M, Takahashi- Yanaga F, Sasaki M,etal. Acceleration of bone regeneration by local application of lithium: Wnt signal- mediated osteoblastogenesis and wnt signal- independent suppression of osteoclastogenesis[J].BiochemPharmacol, 2014, 90(4): 397-405.

[6]Lee SH, Lee KB, Lee JH,etal. Selective interference targeting of lnk in umbilical cord- derived late endothelial progenitor cells improves vascular repair, following hind limb ischemic injury, via regulation of JAK2/STAT3 signaling[J].StemCells, 2015, 33(5): 1490-1500.

[7]Matsumoto T, Ii M, Nishimura H,etal. Lnk- dependent axis of SCF- cKit signal for osteogenesis in bone fracture healing[J].JExpMed, 2010, 207(10): 2207-2223.

[8]Kawakami Y, Ii M, Matsumoto T,etal. A small interfering RNA targeting Lnk accelerates bone fracture healing with early neovascularization[J].LabInvest, 2013, 93(9): 1036-1053.

[9]Lambertucci AC, Lambertucci RH, Hirabara SM,etal. Glutamine supplementation stimulates protein- synthetic and inhibits protein- degradative signaling pathways in skeletal muscle of diabetic rats[J].PLoSOne, 2012, 7(12): e50390.

[10]Wang Q, Li H, Xiao Y,etal. Locally controlled delivery of TNFα antibody from a novel glucose- sensitive scaffold enhances alveolar bone healing in diabetic conditions[J].JControlRelease, 2015, 206: 232-242

[11]陳艷，伍學強，韓春生，等. LNK基因突變在骨髓增殖性腫瘤中的作用[J]. 中國實驗血液學雜志, 2013, 21(5): 1309-1312.

[12]Kwon SM, Suzuki T, Kawamoto A,etal. Pivotal role of lnk adaptor protein in endothelial progenitor cell biology for vascular regeneration[J].CircRes, 2009, 104(8): 969-977.

[13]閔敏，張雪靜，馬紅，等. 人脂肪間充質干細胞體外向黑素細胞分化的研究[J]. 中華皮膚科雜志，2014, 47(2): 85-89.

[14]Simon C, Dondi E, Chaix A,etal. Lnk adaptor protein down- regulates specific Kit- induced signaling pathways in primary mast cells[J].Blood, 2008, 112(10): 4039-4047.

[15]Sato R, Onda K, Kato H,etal. An evaluation of the effect of age and the peri- parturient period on bone metabolism in dairy cows as measured by serum bone- specific alkaline phosphatase activity and urinary deoxypyridinoline concentration[J].VetJ, 2013, 197(2): 358-362.

[16]Shekaran A, Shoemaker JT, Kavanaugh TE,etal. The effect of conditional inactivation of beta 1 integrins using twist 2 cre, osterix cre and osteocalcin cre lines on skeletal phenotype[J].Bone, 2014, 68: 131-141.

[17]李娜，吳秋月，曹翔，等. 1例成骨不全患者Ⅰ型膠原基因突變的檢測[J]. 臨床檢驗雜志，32(4): 314-316.

Improvement of early-stage healing of diabetic rat alveolar bone defect by regulation of Lnk/SCF- cKit axis

LI Hao*, ZHOU Hai- lun, WANG Qi, LI Wei

(*DepartmentofProsthodontics,theAffiliatedHospitalofStomatology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

AIM: To investigate the changes of early- stage healing of diabetic rat alveolar bone defect by regulation of Lnk/SCF- cKit axis. METHODS: Diabetes was induced and alveolar bone defects were formed in 30 rats. The rats were divided into control group (untransfection), negative control group (control plasmids transfection), and RNAi group (Lnk- targeting RNA interference plasmids transfection). HE staining was used to examine the healing level of alveolar bone defect, and Western blotting was used to examine the expression of Lnk, SCF, and cKit in Lnk/SCF- cKit axis and the osteogenic proteins of ALP, OCN and ColIa1. RESULTS: HE staining showed that Lane-Sandhu scor of RNAi group was higher than that of other diabetic groups (P<0.05). Western blotting analysis demonstrated that the rats in RNAi group had less Lnk expression, and greater expressions of SCF, cKit, ALP, OCN and ColIa1 in bone defect area than the rats in other groups(P<0.05). CONCLUSION: Inhibition of Lnk expression, and activation of SCF- cKit axis may improve early- stage bone defect healing of diabetic rats.

Lnk; SCF- cKit axis; diabetes; bone defect

2015-07-09

國家自然科學基金(81200794); 廣西自然科學基金(2015GXNSFBA139140)

李 昊(1984-)，女，滿族，湖北武漢人。博士, 主治醫師

李 昊, E-mail：sherrylee2011@126.com

R782.1

A

1005-2593(2015)12-0713-05

廣西高?？茖W技術研究項目(KY2015YB060); 廣西醫科大學青年科學基金(GXMUYSF2014017)

大學生創新創業訓練計劃項目[桂醫大教(2015)27號-73]

周海倫為共同第一作者