雞新城疫病毒抗原制備參數優化相關性研究

趙英娜 楊平 賈紅梅 陳申秒

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雞新城疫病毒抗原制備參數優化相關性研究

趙英娜 楊平 賈紅梅 陳申秒

（山東濱州沃華生物工程有限公司 256606）

本試驗主要以NDV弱毒株為試驗對象探討了幾種培養因素對雞胚尿囊液收量和血凝效價的影響。試驗選擇 9、10、11 日齡非免疫雞胚以3個接種劑量分別接種NDV Lasota株病毒液于雞胚尿囊腔中。結果表明，選用10日齡雞胚接種劑量為0.1ml／枚時獲得尿囊液量和血凝效價為最高。

新城疫病毒 雞胚尿囊液 接種劑量 血凝效價

新城疫(Newcastle disease, ND)是威脅養禽業發展的一種重要傳染病，給養禽業造成巨大經濟損失，OIE將其與高致病性禽流感一起列為危害養禽業必須報告的疫病，該病在我國時有發生。同時NDV也是誘導全血產生細胞因子的重要誘導劑如NDV誘導生產血源性干擾素[1, 2，3]。近年來，在生產上出現了高致病性的強毒株，甚至超強毒株，一旦發生，難于控制，往往出現極高的死亡率，給養雞業帶來毀滅性的打擊。防制本病的有效方法是對雞群進行免疫接種，常用的疫苗有弱毒疫苗和滅活疫苗。隨著毒株毒力的加強，常常要結合ND油乳劑滅活苗接種才能取得較好的效果而在滅活苗的生產中，目前仍主要采用雞胚作為病毒的繁殖載體。因此，獲得高效價的病毒液(尿囊液)是制苗的關鍵。試驗對如何獲得高效價的尿囊液，確定接種時種毒的最佳濃度及雞胚尿囊液的最佳收集時間進行探討。通過對不同日齡的雞胚接種不同劑量的NDV，觀察其對雞胚尿囊液量及血凝效價的影響，評價最佳種毒接種日齡、接種劑量及其實用性，旨在為ND油乳劑滅活苗的規?；a提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）非免疫雞胚，由濟南、德州等地種雞場提供；（2）新城疫Lasota病毒株，由中國獸醫藥品監察所提供；（3）電熱恒溫培養箱SKP—02.600，購自黃石市恒豐醫療器械有限公司；（4）移液器QY-100ml，購自北京青云卓立精密設備有限公司；（5）1%雞紅細胞懸液，0.01mol /L PBS液(pH值7.4)等按常規方法配制。

1.2 方法

1.2.1 雞胚的孵化 取非免疫種蛋180枚，隨機分為9組，每組20枚，放置同一培養箱孵化，孵化溫度37.0℃，相對濕度51%~55%，每隔2h翻蛋1次。5d頭照檢出無精蛋和死精蛋；9d起每6h照蛋1次，檢出死胚，24h內死亡的剔除。

1.2.2 接種 用NDV -Lasota株分別尿囊腔接種9日齡(I組)10日齡(II組)11日齡(Ⅲ組)雞胚，接種劑量分別為：I--1組、II--1組、Ⅲ--1組0.10ml/枚，I--2組、II--2組、Ⅲ--2組0.15ml/枚，I--3組、II--3組、Ⅲ--3組0.20ml/枚。

1.2.3 檢測方法 接種后96~120h放4℃冰箱過夜，次日收獲。吸出尿囊液置50ml量筒中分別量取每個雞胚中的尿囊液量。用血液凝集試驗(HA)分別測每組雞胚尿囊液中新城疫病毒的平均效價。

2 結果

2.1 尿囊液量與接種劑量的關系

9、10、11日齡雞胚分別按3個不同劑量接種NDV后，各組雞胚產生的尿囊液量的差異(見附表)。

附表 雞胚接種不同劑量NDV對雞胚尿囊液的影響(ml/枚、log2)

項目9日齡10日齡11日齡 I-1I-2I-3II-1II-2II-3III-1III-2III-3 接種劑量0.100.150.200.100.150.200.100.150.20 尿囊液收量13.5413.4413.4313.7313.6313.5913.6713.6413.61 平均HA效價212212212212212212211211211

由附表可以得出，接種0.1ml/枚的收量顯著高于0.2ml/枚的，而接種0.15ml/枚的和0.2ml/枚的則無顯著差異。從生成的尿囊液量多少來看，接種0.1ml/枚的所得尿囊液量最多，0.15ml/枚的次之，0.2ml/枚的最少。

2.2 尿囊液量與接種日齡的關系

表1~3表明，不同接種日齡所取得的尿囊液量有顯著差異，在10、11日齡組中，所取得的尿囊液量顯著高于9日齡所取得的尿囊液量，其平均值分別為13.47ml/枚、13.65ml/枚、13.64ml/枚，10、11日齡之間無顯著差異。

2.3 尿囊液血凝效價與接種劑量、接種日齡的關系

從試驗結果可知，9日齡與10日齡接種組的平均效價無明顯差異，但高于11日齡組的HA效價，尿囊液血凝效價與接種劑量關系不大。

3 討論

（1）試驗結果表明，接種劑量對雞胚尿囊液量有顯著影響，接種劑量增大，則尿囊液量逐漸減少；接種劑量對雞胚尿囊液的效價影響不大；接種日齡對雞胚尿囊液量有顯著影響。（2）NDV接種后的血凝效價受到很多因素的影響，如雞胚種源差異、孵化技術﹑培養溫度、接種劑量、接種日齡、種毒稀釋倍數等，而NDV血凝效價易受接種病毒量的影響，因此，NDV接種量、培養溫度以及接種胚齡的選擇是獲得NDV高收量和高效價的關鍵。本試驗結果表明選擇10日齡接種，接種劑量為0.1ml/枚的Ⅱ-1組為最佳接種組，可獲得多量高效價的尿囊液。（3）雞胚接種受環境影響較嚴重，因此接種操作應嚴格按照有關規定，采用無菌操作，接種雞胚時應避開胚體和血管，以免影響胚體發育，使病毒增殖速度減緩或停止，從而減少尿囊液的收集量。（4）不同病毒的增殖有不同的接種途徑，同一種病毒接種不同日齡雞胚所獲得的病毒量也不同。在實際生產中，應根據不同病毒培養所需要的時間選擇恰當的接種日齡和接種劑量以獲得最高的病毒液量。

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（2015–03–17）

S852.65+9

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1007-1733(2015)07-0006-02