一株水貂源偽狂犬病毒株的分離鑒定

李富金 王蕾 李金波 秦緒偉

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一株水貂源偽狂犬病毒株的分離鑒定

李富金 王蕾 李金波 秦緒偉

（齊魯動物保健品有限公司 山東濟南 250100）

從遼寧大連疑似水貂偽狂犬病發病死亡水貂腦、內臟中及飼喂的豬肝中分離到1株病毒并進行了鑒定。該分離毒株接種BHK-21細胞24 h后出現圓縮、聚集、脫落等典型的細胞病變(CPE)；分離毒株能夠被偽狂犬病病毒標準陽性血清中和；分離病毒接種家兔后，引起家兔出現奇癢等典型的偽狂犬病臨床癥狀；同時根據GenBank公布的PRV的基因設計引物并擴增出特異性的目的片段，擴增產物經過測序比較，表明擴增產物序列為豬偽狂犬病毒gE基因序列。以上結果表明，該病毒為偽狂犬病毒，依據來源確定為水貂源性偽狂犬病病毒株。

偽狂犬病是由皰疹病毒科偽狂犬病毒引起豬、馬、牛、羊等家養動物，犬、貓等伴侶動物，家兔和小鼠等實驗動物，以及水貂、狐貍等毛皮動物等多種動物的一種傳染病[1]。在獸醫臨床上豬的偽狂犬病最為常見，隨著我國養豬業集約化、規?；陌l展，20多個省、市(區)相繼報道了本病的發生，并且引起新生仔豬的急性死亡及4周齡以上的仔豬表現神經癥狀[2]。近幾年狐、貉、貂等毛皮動物養殖者為了減低成本，用豬、牛、羊、兔的下腳料作為蛋白日糧，如果日糧污染了偽狂犬病毒，就會引起毛皮動物感染，貂、狐、貉感染后出現奇癢和腦脊髓炎，動物出現自咬、呼吸困難等臨床表現。筆者最近接診遼寧大連一例病例，近1000水貂及2000只狐貉死亡，筆者從疑似偽狂犬病的病死水貂腦、內臟及飼喂的豬肝內分離到同一株病毒，并進行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）病料：無菌采集疑似偽狂犬病死水貂腦、肺、淋巴結及日糧原料豬肝為分離病毒病料。（2）細胞：倉鼠腎細胞(BHK-21)由齊魯動物保健品有限公司研究所保存。（3）DMEM：培養基細胞生長液：10%血清的DMEM營養液，細胞維持液：2%血清的DMEM營養液，購自GIBICO。（4）標準陽性血清、陰性血清及PRV標準強毒株，由齊魯動物保健品有限公司研究所保存。（5）實驗動物：家兔、小白鼠，由齊魯動物保健品有限公司質檢部提供。（6）聚合酶鏈反應(PCR)儀。

1.2 方法 （1）按照偽狂犬病毒分離方法進行[3]。（2）病料處理：無菌取病水貂腦組織、淋巴結、肺等組織，用滅菌生理鹽水配成1:5乳懸液，勻漿，反復凍融3次，以3000r/min離心10min，取上清液加入青霉素和鏈霉素溶液，置4℃冰箱中作用12h備用；作為日糧組分的豬肝用滅菌生理鹽水配成1:5乳懸液，勻漿，反復凍融2~3次后，以3000r/min離心10min，取上清液加入青霉素和鏈霉素溶液，置4℃冰箱中作用12h備用。（3）家兔接種試驗：取2只健康成年家兔，頸部皮下注射2ml，另設注射無菌生理鹽水的2只為對照。（4）小鼠接種試驗：取8只小白鼠皮下注射病料濾液0.2ml/只，另設注射無菌生理鹽水的2只為對照。（5）病毒培養與傳代：在長成單層的BHK-21細胞上接種0.5ml病毒濾液，在37℃濃度為5%的CO2中培養4~6d。每天觀察細胞病變(CPE)，當出現70%CPE收獲病毒，經3次反復凍融，以5000r/min離心，用上清液接種細胞。（6）毒價測定：取病毒培養物，經10倍系列稀釋，按0.1ml接種96孔細胞培養板，每個稀釋度設8個孔，每天觀察CPE產生情況，按Reed-Muench法計算TCID50。（7）中和試驗：將PRV陽性血清和陰性血清分別進行10倍系列稀釋，加等量的200TCID50，37℃作用20min。分別接種96孔板單層 BHK-21細胞，每孔0.1ml，每個稀釋度接種8孔，第11列為空白對照，第12列為標準強毒株對照(200TCID50)。記錄各個梯度的細胞病變數，連續觀察5d。同時設標準強毒株與陽性血清及標準強毒株與陰性血清對照。方法同上。（8）引物設計：根據GenBank已公布的PRVgE基因序列設計一對引物，對病毒進行鑒定。上游引物：5'-GCCCACGCACGAGGACT ACTACGA-3'下游引物：5'-TTAAGCGGGGCGGGACAT CAACAG-3'，擴增長度298bp。（9）聚合酶鏈式反應(PCR)：將病毒接種BHK-21細胞，當細胞病變達70%以上時收集細胞，酚-仿法提取病毒DNA，PCR反應程序如下：94℃預變性5min，94℃ 30s，65℃30s，72℃ 30s，30個循環。72℃延伸8min，最后取PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。

2 結果

2.1 家兔接種試驗 水貂內臟及豬肝病料處理濾液在接種家兔后24~36h體溫升高，因接種部位奇癢而用嘴啃咬，致使接種部位脫毛，皮膚潰爛出血。家兔躁動不安，不時轉圈，呼吸急促，至48h四肢麻痹，抽搐而死。對照組家兔健康無發病。

2.2 小白鼠接種試驗小鼠接種水貂內臟及豬肝病料處理濾液24h內都出現了興奮不安，食欲下降，36h后出現被毛雜亂，用嘴咬接種部位，48h后小鼠全部死亡。對照組小鼠健康無任何癥狀。

2.3 接種細胞的病變 水貂病料接種BHK細胞后，P1代培養96h無CPE，P2代培養72h出現細胞脫落現象，P3代培養24h出現細胞融合、脫落現象。豬肝病料接種BHK細胞后，P1、P2代培養96h無CPE，P3代培養24h出現細胞融合、脫落現象，見圖1。

圖1 病料引起BHK細胞CPE(左圖)和正常BHK細胞(右圖)

2.4 病毒 TCID50測定 按Reed-Muench法測得病毒滴度為104TCID50/ml。

2.5 中和試驗結果 PRV陽性血清能夠抑制細胞病變的產生，表明陽性血清對分離株病毒有中和能力，分離的病毒是偽狂犬病毒。

2.6 PCR擴增及測序結果 水貂病料培養物及豬肝病料培養物均擴增出了特異性片段，長度為298bp，與預期目的片斷相同(見圖2)，二者測序結果相似性99.7%，序列Blast與GenBank收錄的PRV gE基因(AY170318)相似性98%。

圖2 病料接種BHK-21細胞培養物PCR產物電泳圖

左圖：M：Marker DL2000；1：陰性對照；2：水貂病料細胞培養物P3代。右圖：M：Marker DL2000；1：豬肝病料細胞培養物P3代；2：陰性對照。

4 討論

（1）本次遼寧大連水貂發病死亡是飼喂了豬肝后急性發病，本試驗從疑似偽狂犬水貂病料中分離到一株偽狂犬病毒，從飼喂的日糧豬肝中也分離到同一病毒，因此判斷，水貂偽狂犬病毒的來源是豬肝。從而為毛皮動物偽狂犬病實施科學有效防治措施提供依據。（2）一些養殖戶為了降低成本，有時候選用病死豬、牛、羊、家禽作為毛皮獸肉食飼料，而這些飼料安全性比較差，可能含有大量病毒、病菌及毒素等，一旦處理不好就會引起食物中毒。病從口入，預防該病還要從食物上著手，對來源不明的豬、牛、羊、兔等下腳料一定熟喂，并認真檢查是否熟透，還要做到生熟分開，浸泡畜禽副產品的水經消毒后排放。加強滅鼠工作，防止帶毒老鼠污染食物。（3）近幾年河北昌黎、樂亭、石家莊，山東臨沂、濰坊等毛皮動物養殖集中區域都有毛皮獸偽狂犬病發生，損失慘重。臨床調查顯示，發病案例都有飼喂豬、牛下腳料的飼喂史或者挨著豬場比較近，毛皮動物偽狂犬防疫刻不容緩。

[1] 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所. 動物傳染病學(第1版)[M]. 北京: 中國農業出版社. 1999. 177-179.

[2] 陳煥春, 方六榮, 何啟蓋等. 豬偽狂犬病A株的分離鑒定[J]. 畜牧獸醫學報. 1998. 29(2): 156-161.

[3] 殷震, 劉景華主編. 動物病毒學(第2版)[M]. 北京: 科學出版社. 1997. 988-1009.

[4] 王殿永,秦緒偉,許凌涵等.一起狐、貉偽狂犬病的診治[J]. 山東畜牧獸醫. 2013(1).

[5] 趙支國. 食源性偽狂犬病引起多種動物死亡的病例分析[J]. 北方牧業. 2013(4): 27.

（2015–04–08）

S852.65+5

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1007-1733(2015)07-0010-02