適于沙漠地下水培養的耐碳酸氫鈉產油微藻

席瑋芳 高 宏 蘭 波 徐旭東 孔任秋

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適于沙漠地下水培養的耐碳酸氫鈉產油微藻

席瑋芳1, 2高 宏1蘭 波1徐旭東1孔任秋1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

產油微藻; 培養; 沙漠地下水; 18S rDNA

能源危機是全世界面臨的共同問題, 采用可再生能源替代化石能源是出路之一。生物柴油作為一種清潔可再生能源備受矚目[1—3]。目前, 生物柴油主要以大豆和油菜、油棕和麻風樹等油料植物以及動物油脂、廢餐飲油等作為原料。但是動物油脂、廢餐飲油原料有限, 而油料植物生產油脂存在占地面積大、生產周期長等缺點, 不宜作為未來生物柴油的主要來源。相比之下, 產油微藻具有生長周期短、單位面積產量高等優點[4], 被認為是生物柴油的下一代原料。由于我國耕地面積逐年減少[5], 北方土地沙漠化嚴重[6], 利用可耕種土地來培養產油藻顯然不符合我國國情, 利用沙漠和鹽堿灘涂等不適于耕種的土地作為產油藻規?；囵B基地應是我們的選擇。大規模培養微藻時, 會利用當地地下水或其他水源添加無機元素配制培養基, 當地的水質可能影響微藻的生長和產油。因此, 在微藻工業化生產前, 有必要利用當地的水配置培養基進行產油藻種篩選。

庫布齊沙漠是我國第七大沙漠, 西、北、東三面均以黃河為界, 南部為構造臺地, 中部為風成沙丘, 北部為河漫灘地[7]。地下水主要為HCO3-Na、HCO3-Na×Mg型水, 總溶解固體為(0.69—0.97) g/L, 總硬度為(267.15— 3561.45) mg/L[8], 水質鹽度偏高。在庫布齊沙漠地區的東北部建有達拉特旗荒漠藻綜合治沙技術試驗站, 本文將從內蒙古一些鹽堿地區采集分離得到的一些微藻, 利用試驗站內的地下水配制培養基進行培養和油脂含量測定, 篩選生長較快、含油量較高并且可以耐受較高濃度碳酸氫鈉的藻株, 以進一步在庫布齊沙漠地區進行開放式培養研究。

1 材料與方法

1.1 藻種的來源和培養

藻種來自本實驗室從內蒙古各鹽堿地區采集并分離純化得到的46個藻株。使用鄂爾多斯達拉特旗荒漠藻綜合治沙技術試驗站(位于庫布齊沙漠地區的東北部40°22￠23.42N 109°50￠57.72E)井水配制的補加0.1 mol/L NaHCO3的BG11[9]培養基(以下稱為地下水高堿BG11)培養。

1.2 初步篩選

將各藻株接種于含100 mL地下水高堿BG11培養基的三角瓶中, 初始接種時的光密度值(OD680, 使用MAPADA V-1200 spectro photometer測量, 比色皿光程為10mm)為0.05, 在單側光強為50 μE/(m2·s)、溫度為30℃下靜置培養, 每天搖勻3次。觀察各藻株的生長情況, 培養至20d, 測定各藻株OD680值以比較細胞濃度, 收集相等量的藻液提取總脂。

藻細胞的總脂利用氯仿/甲醇萃取的方法[10]提取。薄層層析參照文獻[11]進行。在薄層層析板(Silica gel 60 F254, Merk KgaA Darmstadt, German)的一端約0.5 cm處點樣。以0.02 mg三油酸甘油酯(triolein)標準品(購自Sigma公司)作為參照。展層劑體系為正己烷︰乙醚︰乙酸混合溶液(體積比為70︰30︰1), 層析結束后利用碘蒸氣對硅膠板進行染色[12]。

1.3 耐高堿藻的生長及總脂含量測定

將各藻株接種于含有400 mL地下水高堿BG11培養基的三角瓶中, 每株藻設置三個平行, 初始接種時的680為0.05, 在培養溫度為30℃、單側光強為100 μE/(m2·s)條件下通空氣培養, 隔天測量680, 繪制生長曲線。當藻液的680超過量程時, 使用ddH2O將其稀釋一定的倍數之后再測量, 使測量值在0.1—1.0范圍內, 然后根據稀釋倍數換算得到實際680值。培養20d后, 收集藻液, 凍干后取100 mg干藻粉提取總脂?？傊奶崛⒄瘴墨I[10]進行, 利用稱重法計算總脂含量。

1.4 7株產油藻的顯微照片及18S rDNA序列分析

取藻液于載玻片上, 在Olympus BX41型光學顯微鏡下進行觀察、照相。藻株的基因組DNA用CTAB法[13]提取, 以藻株的基因組DNA為模板, 以通用引物18S-1 (5′-tggttgatcctgccagtagtc-3′)和18S-2(5′-tgatccttctgca-gg-tt cacc-3′)[11]進行PCR擴增獲得相應18S rDNA片段。用0.7%瓊脂糖凝膠電泳和回收試劑盒(購自BioFlux公司)分離、回收和純化DNA片段, 分別克隆到pMD18-T(購自Takara公司)載體上, 送測序。18S rDNA序列均已提交NCBI GenBank。DNA序列用MEGA 5.0進行對位排列比對, 比對中采取默認設置, 并對比對結果進行手工調整。以三角褐指藻()的18S rDNA作為外類群, 使用軟件MEGA 5.0構建鄰接樹、最大簡約樹和最大相似樹。

2 結果

2.1 藻種初篩

將從鄂爾多斯地區鹽堿地分離的46株耐堿產油藻在地下水高堿BG11中培養, 篩選出15株生長較快的藻株, 提取總脂進行薄層層析比較分析。結果發現編號為LB1、NMX451、LB65、LB75和LB96共5株藻的甘油三酯含量明顯高于其他藻株, 而LB39、LB52、LB74和LB80明顯較低; 其余6株藻LB53、LB60、LB71、LB77和LB89的甘油三酯含量相當, 但LB77和LB89生長慢。顯微鏡觀察又發現LB96藻種不純, 因此選擇LB1、NMX451、LB65、LB75、LB53、LB60和LB71 共7株藻用于進一步試驗(見圖1有下劃線的藻株)。

2.2 7藻株的生長及總脂含量的測定

將以上選出的7藻株在含有400 mL地下水高堿BG11的三角瓶中培養生長, 生長曲線如圖2, 總脂含量如表1。生長最快的是LB65, 其總脂含量為30%左右; LB71生長次之, 總脂含量為32%左右。LB53、NMX451和LB60生長較慢, 其中LB60的總脂含量卻是7株藻中最高, 為36%±2.06%, LB53和NMX451藻株的總脂均低于30%。LB1和LB75生長速率中等, 總脂含量均高于34%。

箭頭所指為甘油三酯; LB1-96, 15株耐高堿綠藻; S. 甘油三酯標樣; 帶下劃線的藻株用于進一步研究

The arrow points to triacylglycerol; LB1-96, 15 NaHCO3-tolerant algal strains; S, triolein. The underlined algal strains were used in further investigations

表1 7株藻在沙漠地下水高堿BG11中的的總脂含量

2.3 7株藻的形態觀察和18S rDNA序列分析

通過光學顯微鏡觀察, LB1、LB65和LB75的細胞均為球狀, 直徑為(3—5) μm; LB53、LB60和LB71的細胞形態成新月形或梭形, 長(6—9) μm, 寬為(2—5) μm; 唯獨只有NMX451為橢球形, 長(7—9) μm, 寬為(5—7) μm, 常見2或4個細胞并排分布, 細胞表面具刺或鞭毛狀附屬物(圖3)。對這些藻株的18S rDNA 序列在GenBank中比對, 找到這些藻的相似序列, 以三角褐指藻作為外類群構建分子系統樹。不同系統分析方法構建的18S rDNA 系統樹具有相似的拓撲結構(圖4)。發現LB1、LB65和LB75藻株聚成一簇, 均在小球藻屬分支之中; LB53、LB60、LB71和LB96與單針藻種類聚成一簇; NMX451則與鏈帶藻種類聚在一起。結合顯微觀察和分子系統進化樹, 可以確定LB1、LB65和LB75為小球藻屬的種類, LB53、LB60和LB71為單針藻屬的種類, NMX451為鏈帶藻屬的種類。

3 討論

產油微藻作為生產生物柴油的源料有若干優勢, 但在目前技術條件下其生產成本過高, 仍未在生產中得到應用?，F有的適合開放式規模養殖的藻種, 包括螺旋藻、杜氏鹽生藻和其他一些海洋藻類, 其共同點是可以在較高鹽度或pH的培養基中生長[14]。另一方面, 我國耕地面積短缺, 應該利用好沙漠地區發展微藻產業[15]。我們利用在鄂爾多斯鹽堿地采集分離的藻種, 以達拉特旗地下水配置的培養液進行產油藻篩選, 獲得了一些適應當地水質的藻株。本研究所篩選出的7株藻均為耐堿產油藻, 在大規模培養時更容易具有不易污染的優勢。同時, 培養液中存在碳酸氫鈉還有利于碳的固定和利用, 可以提高生長速率, 有利于生物質的積累。

從7株微藻的形態和18S rDNA序列可以鑒定出, 有3株隸屬于小球藻屬, 2株屬于單針藻, 還有1株是鏈帶藻。鏈帶藻NMX451是我們最早分離得到的一株耐受碳酸氫鈉的產油藻, 在1 m2的跑道池(100 L體積培養液)小規模開放式培養及絮凝采收研究已在另文發表[16]。該藻株在本文描述的生長條件下與以前用武漢地區自來水配置培養液的條件下總脂水平相當, 一般在26%到27%之間。在這些藻株中, 除了兩株生長慢總脂含量也較低的LB53和NMX451之外, 其余5株藻顯示出生長與總脂含量負相關的趨勢。LB65生長最快, 總脂含量在這5株中最低; LB60總脂含量最高, 但生長最慢; LB1、LB71和LB75生長較快且總脂含量較高。通過調整培養基和其他培養條件, 有可能保持LB60較高的含油量而提高其生長, 保持LB65較快的生長速度而提高其含油量, 其余藻株的生長產油能力也可能得到全面的提高。本研究結果顯示,從當地鹽堿地藻種資源中, 有可能篩選出適合于沙漠地區地下水水質特征的優質產油微藻。

標尺: 10 μm; 1. LB1, 2. NMX451, 3. LB53, 4. LB60, 5. LB65, 6. LB71, 7. LB75

Scale bar: 10 μm. 1. LB1, 2. NMX451, 3. LB53, 4. LB60, 5. LB65, 6. LB71, 7. LB75

節點處的數字為支持率: 鄰接樹(1000次重復)、最大相似樹(100次重復)和最大簡約樹(1000次重復); 只顯示節點上支持率大于50的值。藻株后為NCBI GenBank號

Numbers at the nodes indicate support values: neighbor joining (1000 bootstrap replicates), maximum likelihood (100 bootstrap replicates) and maximum parsimony (1000 bootstrap replicates). Only values above 50% were shown. NCBI GenBank accession numbers are indicated following each algal strain number

[1] Chisti Y. Biodiesel from microalgae [J]., 2007, 25(3): 294—306

[2] Gouveia L. Microalgae as a Feedstock for Biofuels [M]. Springer, 2011

[3] Chisti Y. Biodiesel from microalgae beats bioethanol [J]., 2008, 26(3): 126—131

[4] Hu Q, Sommerfeld M, Jarvis E,.Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances [J]., 2008, 54(4): 621—639

[5] Liu D, Feng Z M, Yang Y Z,. Characteristics of grain production and spatial pattern of land carrying capacity of China [J]., 2011, 27(7): 1—6 [劉東, 封志明, 楊艷昭, 等. 中國糧食生產發展特征及土地資源承載力空間格局現狀. 農業工程學報, 2011, 27(7): 1—6]

[6] Wang T, Song X, Yan C Z,. Remote sensing analysis on aeolian desertification trends in northern China during 1975—2010 [J]., 2012, 31(6): 1351—1356 [王濤, 宋翔, 顏長珍, 等. 近35年來中國北方土地沙漠化趨勢的遙感分析. 中國沙漠, 2012, 31(6): 1351—1356]

[7] Cui Y, Li R. Analysis on dynamic change of desertification of Kubuqi Desert [J]., 2010, 8(4): 57—60 [崔琰, 李銳. 庫布齊沙漠土地荒漠化動態變化分析. 中國水土保持科學, 2010, 8(4): 57—60]

[8] Ren Z P, Yan J P. Analysis on the groundwater chemistry characteristics and their forming mechanism, in daladqi plain, inner Mongolia [J]., 1999, 11(3): 30—34 [任增平, 閆俊萍. 內蒙古達拉特旗平原區地下水水化學特征及形成機制分析. 中國煤田地質, 1999, 11(3): 30—34]

[9] Stanier R, Kunisawa R, Mandel M,. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order) [J]., 1971, 35(2): 171

[10] Bligh E G, Dyer W J. A rapid method of total lipid extraction and purification [J]., 1959, 37(8): 911—917

[11] Xu J, Xu X D, Fang X T,Screening and lipid analysis of high oleaginousspecies [J]., 2012, 36(3): 426—432 [徐進, 徐旭東, 方仙桃, 等. 高產油小球藻的篩選及其油脂分析. 水生生物學報, 2012, 36(3): 426—432]

[12] Eizadora T Y, Zendejas F J, Lane P D,. Triacylglycerol accumulation and profiling in the model diatomsand(Baccilariophyceae) during starvation [J]., 2009, 21(6): 669—681

[13] Murray M G, Thompson W F. Rapiddisolation of high molecular weight plant DNA [J]., 1980, 8: 4321—4325

[14] Lee Y K. Enclosed bioreactors for the mass cultivation of photosynthetic microorganisms: the future trend [J]., 1986, 4: 186—189

[15] Zhao T, Su Q F, Liu Z. Optimal choice for China’s desertification regions to develop biodiesel: microalgae [J]., 2011, 33(8): 1529—1536 [趙濤, 蘇青福, 劉朝. 中國荒漠化地區發展生物柴油的最優選擇——微藻. 資源科學, 2011, 33(8): 1529—1536]

[16] Yang X R, Fang X T, Xu X D. Harvesting of a NaHCO3-tolerant oil-producing green alga by flocculation [J]., 2013, 37(5): 989—992 [楊旭瑞, 方仙桃, 徐旭東. 一種耐碳酸氫鈉產油綠藻的絮凝研究. 水生生物學報, 2013, 37(5): 989—992]

Na2HCO3-TOLERANT OIL-PRODUCING MICROALGAE THAT ARE SUITABLE FOR CULTIVATION WITH DESERT GROUNDWATER

XI Wei-Fang1, 2, GAO Hong1, LAN Bo1, XU Xu-Dong1and KONG Ren-Qiu1

(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China;2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Oil-producing microalgae; Cultivation; Desert groundwater; 18S rDNA

10.7541/2015.54

Q949.2

A

1000-3207(2015)02-0414-05

2014-04-14;

2014-06-12

科技基礎性工作專項課題中國產油微藻調查(2012FY112900-04)資助

席瑋芳(1989—), 男, 江西上饒人; 碩士研究生; 主要從事藻類生物技術研究。E-mail: xiweifang@126.com

孔任秋, E-mail: kongr@ihb.ac.cn