IHNV單克隆抗體的制備及其初步應用

曹 歡 景宏麗 王 姝 王靜波 王小亮 徐立蒲

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IHNV單克隆抗體的制備及其初步應用

曹 歡1景宏麗2王 姝1 王靜波1 王小亮1 徐立蒲1

(1. 北京市水產技術推廣站, 北京100021; 2. 中國檢驗檢疫科學研究院動物檢驗檢疫研究所, 北京100029)

傳染性造血器官壞死病毒; 單克隆抗體; 雙抗體夾心ELISA法

傳染性造血器官壞死(Infectious haematopoietic necrosis, IHN) 是嚴重危害我國鮭、鱒魚苗種業的一種病毒性疾病。主要感染虹鱒、硬頭鱒等冷水魚類, 急性感染時累計死亡率可達95%以上[1, 2], 并可垂直傳播給子代。IHN被世界動物衛生組織(OIE)列為必須申報的動物疫病, 被我國列為二類動物疫病。該病最早流行于北美和歐洲一些國家, 目前已經蔓延至我國遼寧、河北、甘肅等主要冷水魚養殖地區, 并造成較大經濟損失[3, 4]。

該病的病原是傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV), 屬彈狀病毒科(), 粒外彈狀病毒屬()。目前我國對IHNV檢測方法的研究相對落后, 主要集中在檢測病毒核酸的PCR方法[5, 6], 由于缺乏IHNV的相應抗體, 免疫學診斷技術的研究比較缺乏。本研究旨在制備抗傳染性造血器官壞死病毒的特異性單克隆抗體, 以期研制出特異、靈敏、快速、大通量的病毒檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

傳染性造血器官壞死病毒(IHNV-UK)由英國Weymouth的OIE參考實驗室贈送給中國檢驗檢疫科學研究院水生動物檢疫實驗室江育林研究員并惠贈給本實驗室。實驗用魚類細胞系及病毒株均由本實驗室保藏, BALB/c小白鼠購自北京軍事科學與醫學研究院。RPMI 1640 購自HYCLONE公司, 特級胎牛血清購自杭州四季青公司, HAT、HT、聚乙二醇(PEG1500)購自GIBCO公司, 二甲基亞砜購自上海生物公司, 辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠Ig、硫酸鹽(TMB)、弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自SIGMA公司, 羊抗鼠IgG亞類檢測試劑盒購自Southern Biotech公司, CKX41倒置相差顯微鏡為OLYMPUS公司產品, 二氧化碳培養箱為SANYO公司產品; Avanti J-30I 超速離心機為BECKMAN公司產品。其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 抗原的制備及動物免疫

培養鯉上皮瘤細胞(EPC), 傳代16—24h內接種IHNV-UK, 加入含10%胎牛血清的培養液置于17.5℃培養。當細胞產生90%病變(CPE)之后凍融1次, 收集病毒液。8000 r/min離心30min, 收集的上清再24000 r/min離心2h以沉淀病毒, 沉淀用適量0.01 mol/L PBS重懸。免疫BALB/c小鼠, 共免疫5次, 首次免疫為病毒加等量弗氏完全佐劑, 第2次免疫為病毒加等量弗氏不完全佐劑, 其余各次免疫僅用全病毒, 免疫劑量為每次0.1 mL純病毒(約15 mg/mL), 免疫途徑為腹腔注射。

1.3 細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選

按照常規方法[7]進行細胞融合, 陽性雜交瘤細胞株的篩選參照文獻[8]中的間接ELISA方法, 不同的是包被抗原用提純的IHNV-UK, 包被抗原濃度為15 mg/L。用羊抗IHNV血清的稀釋度通過做方陣滴定試驗決定。

1.4 陽性雜交瘤細胞株的建立及腹水的制備

將鑒定為陽性的細胞孔中的細胞擴大培養, 并及時凍存, 同時按照有限稀釋法進行亞克隆, 至雜交瘤細胞孔抗體陽性率為100%時, 即可定株。按照常規方法[8]進行小鼠腹水的制備。

1.5 單克隆抗體特性鑒定

mAb效價測定收集雜交瘤細胞培養上清液及腹水, 以2倍比進行稀釋, 用間接ELISA法測定效價。

mAb的亞類鑒定按照SouthernBiotech單抗分型試劑盒介紹的方法進行亞類鑒定。

Werstern-blot分析按常規方法[9]將純化的病毒進行SDS-PAGE和Werstern-blot, 濃縮膠為5%, 分離膠為12%。一抗為制備的腹水單抗(1∶500)二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG(1∶5000), DAB顯色。

中和活性的測定將腹水從1∶20起做倍比稀釋至1︰2560, 將病毒20050/100 mL與各稀釋度腹水等體積混合, 25℃感作1h , 然后接種到新鮮制備的單層EPC細胞上, 每天觀察細胞病變, 連續觀察7d, 按Reed-Muench法計算單抗的中和效價。

1.6 mAb雙夾心ELISA法的建立

mAb雙夾心ELISA法操作步驟用2.5 μg/mL羊抗IHNV多抗包板4℃過夜, 100 μL/孔。PBST洗3遍; 加1︰10的魚組織勻漿上清液, 并設陽性、陰性對照, 100 μL/孔。37℃ 1h, PBST洗3遍; 加單抗 1B10, 100 μL/孔, 37℃ 1h, PBST洗2遍; 加0.1% H2O2, 300 μL/孔, 37℃ 15min, PBST洗2遍; 加羊抗鼠IgG-HRP, 100 μL/孔, 37℃ 1h, PBST洗3遍; 加顯色液(TMB+H2O2) 100 μL/孔, 室溫避光作用5—10min, 用2 mol/L H2SO4溶液終止, 150 μL/孔, 測定OD450。當樣品的OD值＞陰性OD值的平均值+3SD時, 判定為陽性。

mAb雙夾心ELISA法的特異性以5種魚類病毒和8株魚類細胞為樣品, 用建立的mAb雙夾心ELISA法進行檢測。

mAb雙夾心ELISA法的靈敏度純化的IHNV病毒(5.4 mg/mL)以10倍比稀釋, 未純化的病毒 (105.550/100 μL)以2倍比稀釋; 病毒接種EPC細胞, 每24h取樣, 用建立的mAb雙夾心ELISA法進行檢測。

1.7 mAb雙夾心ELISA法的應用

對分離株的測定取9個IHNV分離株, 用建立的mAb雙夾心ELISA法進行檢測, 同時采用Karber法計算50[10]。

對樣品的測定隨機抽取43份盲樣(每個樣品不少于15尾魚), 取肝、腦、脾、腎組織勻漿后, 用0.01 mol/L PBS 1︰10稀釋制成混懸液, 離心取上清, 用建立的mAb雙夾心ELISA法進行檢測。同時, 采用細胞培養分離病毒和PCR鑒定的方法對樣品進行平行檢測, 比較兩種方法的一致程度。

2 結果

2.1 細胞融合

在細胞融合后, 經含HAT的培養基進行篩選, 產生100多個雜交瘤細胞, 用建立的間接ELISA法篩選, 陽性孔經3次克隆純化后, 最終得到1株可高效、穩定分泌抗IHNV-UK抗體的雜交瘤細胞株, 命名為1B10。

2.2 mAb1B10的生物學特性

間接ELISA法測得細胞上清的抗IHNV效價在1︰160以上, 腹水的抗IHNV效價在1︰2.5×105以上。中和試驗結果顯示, mAb 1B10沒有中和IHNV的能力?？贵w亞類鑒定結果顯示, mAb 1B10為IgG1亞類, 輕鏈為Kappa鏈。采用SDS-PAGE和Western-blot方法測定, mAb 1B10針對的抗原決定簇位點位于IHNV-UK的相對分子量(Mt)42000的蛋白條帶上。推斷該蛋白為IHNV核蛋白, 該結果與文獻[11]報道一致, 趙永欣等[12]表達了IHNV- ZYX的核蛋白大小約48 kD, 與本文推斷基本相符。

2.3 mAb雙夾心ELISA法的特異性

用建立的mAb雙夾心ELISA法測定5種病毒和8種魚類細胞的OD值, 結果顯示, 僅IHNV-UK呈陽性反應, 而其他5種病毒和8種魚類細胞均呈陰性反應。

2.4 mAb雙夾心ELISA法的靈敏度測定

將提純的IHNV-UK按1︰10的稀釋度作倍比稀釋后用建立的mAb雙夾心ELISA法檢測, 最低檢出限為540 ng/mL; 將病毒懸液按1︰2稀釋度作倍比稀釋后用建立的mAb雙夾心ELISA法檢測, 檢測靈敏度達到1︰64 (活病毒量為103.750/100 μL); 將病毒接種EPC細胞, 每24h取樣用建立的mAb雙夾心ELISA法檢測, 在EPC細胞接種病毒72h后即可在細胞中檢測到病毒。

2.5 mAb雙夾心ELISA法的初步應用

對各地分離到的毒株的檢測用建立的mAb雙夾心ELISA法對9份來源于不同地區的IHNV毒株以及IHNV-UK進行檢測(表5)。提示該方法的特異性能夠覆蓋分離到的各個IHNV毒株, 但是病毒量和OD值之間并無相關關系。編號為13071的樣品OD平均值最高為0.527, 編號為12096的樣品OD平均值最低為0.259。

表1 mAb雙夾心ELISA法特異性檢測結果

Tab. 1 The reaction of double antibodies sandwich ELISA against fish viruses and cell lines (±S, n=2)

表1 mAb雙夾心ELISA法特異性檢測結果

病毒及細胞系Fish viruses and cell linesA450檢測結果Results 病毒 Fish viruses IHNV-UK0.275±0.016+ 病毒性出血敗血癥病毒(Viral Hemorrhagic Septicemia virus, VHSV)0.066±0.001– 鯉春血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)0.069±0.000– 草魚出血病病毒(Grass carp reovirus, GCRV)0.069±0.001– 傳染性胰臟壞死病病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)0.068±0.001– 流行性造血器官壞死病病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV)0.068±0.000– 細胞系 Cell lines 胖頭鱥肌肉細胞系(Fathead monnow cell line, FHM)0.070±0.000– 虹鱒肝細胞系(Rainbow trout liver cell line, R1)0.068±0.001– 草魚腎細胞系(Grass carp kidney cell line, CIK)0.072±0.004– 草魚卵巢細胞系(Grass carp ovary cell line, CO)0.072±0.001– 藍鰓太陽魚細胞系(Bluegill fry cell line, BF-2)0.069±0.000– 虹鱒性腺細胞系(Rainbow trout gonad cell line, RTG-2)0.074±0.001– 鯉上皮瘤細胞系(Epithelioma papulosum cyprini cell line, EPC)0.070±0.003– 大鱗大麻哈魚胚胎細胞系(Chinook salmon embryo cell line, CHSE)0.065±0.000– 陰性對照 Negative control0.069±0.002–

表2 純化病毒的檢測靈敏度

Tab. 2 The result of sensitivity test by purified IHNV (±S, n=2)

表2 純化病毒的檢測靈敏度

病毒量Quantity (ng/mL)A450檢測結果 Result 5400001.23±0.13+ 540001.18±0.21+ 54000.27±0.07+ 5400.15±0.03+ 540.084±0.02– 5.40.077±0.02–

表3 病毒培養液的檢測靈敏度

Tab. 3 The result of sensitivity test by cell cultured IHNV (±S, n=2)

表3 病毒培養液的檢測靈敏度

稀釋度DilutionA450檢測結果Result 1︰40.213±0.008+ 1︰80.215±0.010+ 1︰160.169±0.001+ 1︰320.121±0.010+ 1︰640.092±0.009+ 1︰1280.080±0.006– 1︰2560.071±0.006–

表4 不同病毒分離時間的檢測靈敏度

Tab. 4 The result of sensitivity test by cell cultured IHNV which was harvested at 24h intervals after infection (±S, n=2)

表4 不同病毒分離時間的檢測靈敏度

培養時間Cultured time (h)A450檢測結果Result 240.071±0.007– 480.087±0.003– 720.096±0.001+ 960.144±0.008+ 1200.362±0.054+ 1440.331±0.007+

對樣品的檢測對43份樣品按OIE規定的方法, 取魚的肝、腦、脾、腎混合制樣, 用mAb雙夾心ELISA法和病毒分離方法同時進行檢測, 以進行比較。和黃金方法相比, ELISA方法在特異性上的符合率達到93.9% (31/33), 在靈敏度上的符合率達到80.0%(8/10); 建立mAb雙夾心ELISA法與病毒分離方法檢測結果的符合率為90.7% (39/43)。

3 討論

IHNV作為制約鮭、鱒養殖業發展的重要病原, 其危害已引起了廣泛的關注。由于病毒病尚無有效的治療方法, 病原的早期、快速檢測對疾病的控制至關重要。目前OIE推薦的諸多診斷方法[13]中, 病毒分離、中和試驗等傳統的病毒檢測方法費時、費力; PCR、核酸探針等新型技術時效性較好, 但假陽性率較高。而ELISA檢測方法具有快速、準確、高通量等特點, 是OIE和許多國外獸醫機構認可的魚類病毒病診斷鑒別方法, 在多個國家得到了普遍應用, 并且取得了良好效果[14—17]。國內由于受到抗體來源的限制, 免疫學技術方面的研究比較缺乏。國內學者先后表達出了IHNV的糖蛋白和核衣殼蛋白, 并制備了抗IHNV糖蛋白的多抗血清[12, 18, 19]。但是由于表達蛋白的免疫原性不穩定、彈狀病毒之間抗原性比較相似等原因, 制備的抗體難以滿足IHNV檢測的特異性要求。本研究以差速離心純化的全病毒作為抗原免疫小鼠, 成功制備了效價在1︰2.5×105以上, 能夠特異性結合IHNV-UK核蛋白的mAb 1B10; 將其應用到ELISA檢測中, 可與IHNV發生反應, 而不與SVCV、VHSV等5種病毒和8種魚類細胞發生交叉反應。檢測的特異性覆蓋從北京、青海、甘肅等不同地區分離到的9個IHNV分離株。該抗體的制備, 為進一步研制傳染性造血器官壞死病毒的快速、高通量檢測及流行病學監測提供了檢測試劑。

表5 mAb雙夾心ELISA法對毒株檢測結果

Tab. 5 The reaction of double antibodies sandwich ELISA against IHNV viruses isolated from Beijing Qinghai and Gansu (±S, n=2)

表5 mAb雙夾心ELISA法對毒株檢測結果

來源Source甘肅Gansu青海Qinghai北京Beijing英國參考株Reference virus of UK 編號Number120741207513066120961219112196121691307112171INHV-UK A4500.379± 0.0080.391± 0.000.510± 0.0280.259± 0.0060.360± 0.0160.449± 0.0080.437± 0.0030.527± 0.0110.328± 0.0160.335± 0.009 病毒量Quantity (TCID50/100 μL)105.17104. 5105.83104.83105.17105.5104.83105.5104.83104.5

利用mAb 1B10和多克隆羊抗血清建立了檢測IHNV的雙抗體夾心ELISA方法。通過對43份盲樣進行檢測, 并與黃金方法進行比較和質量評估, 證明本研究所建立的mAb雙夾心ELISA診斷方法具有良好的特異性(特異性上的符合率93.9%)。但是幾乎所有的檢測方法, 在特異性與靈敏度之間都存在一定矛盾, 難以同時兼顧。在本項目建立的McAb雙夾心ELISA診斷方法中, 靈敏度相對較低, 這可能與建立的McAb雙夾心ELISA檢測技術時的檢測限有關。本項目建立的檢測技術, 可檢測到103.750/100 μL以上的病毒, 但是在病毒隱性感染或發病初期, 魚體內的病毒可能達不到此數量, 導致診斷結果中假陰性的發生。為克服這一問題, 可以通過加大樣品數量來彌補, 或者先在細胞中做短期擴增后再進行檢測。實驗室研究顯示, 將樣品接入細胞72h后, 再采用本方法檢測, 特異性和靈敏度均可達到90%以上。本方法的建立能夠滿足傳染性造血器官壞死病毒的大通量、快速檢測需求, 為大規模篩查該病以及快速篩選帶病魚提供了技術依托。

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PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST IHNV AND ITS PRELIMINARY APPLICATION

Cao Huan1, Jing Hong-li2, Wang Shu1, Wang Jing-bo1, WangXiao-liang1and Xu Li-pu1

(1. Beijing Fisheries Technical Extension Station, Beijing 100021, China; 2. Research Center of Aquatic Animal Diseases, Institute of Animal Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)

Infectious haematopoietic necrosis virus; Monoclonal antibody; Double antibodies sandwich ELISA

10.7541/2015.56

S941.4

A

1000-3207(2015)02-0426-05

2014-04-15;

2014-08-14

北京市科委項目(Z111100074311007); 北京市鱘魚、鮭鱒魚創新團隊(SCGWZJ 20131104-3)資助

曹歡(1981—), 女, 黑龍江牡丹江人; 碩士; 主要從事水產動物病害防治的研究。E-mail: lsen1980@sina.com

徐立蒲(1972—), 男, 黑龍江人; 博士; 主要從事水產動物病害防治的研究。E-mail: bjybk@163.com