飼喂蠶豆對草魚抗氧化能力及免疫機能的影響

吳 康 黃曉聲 金潔南 李 男 張學振

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飼喂蠶豆對草魚抗氧化能力及免疫機能的影響

吳 康1, 2, 3黃曉聲4金潔南1, 2李 男4張學振1, 2

(1. 華中農業大學水產學院, 武漢 430070; 2. 淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心, 武漢 430070; 3. 湖北省農業科學院經濟作物研究所, 武漢 430064; 4. 中山市水產技術推廣中心站, 中山 528403)

投喂蠶豆100d左右, 草魚肌肉的彈性和咀嚼性增強, 肌肉品質顯著改善, 此種模式養殖的草魚俗稱“脆肉鯇”。實驗比較了投喂蠶豆與商用配合飼料的草魚, 在養殖過程中(30d、60d、100d)機體抗氧化能力及免疫機能的異同, 以了解脆肉鯇肌肉品質改變過程中魚體的生物學變化。實驗結果表明, 投喂蠶豆顯著影響了草魚血清總抗氧化能力(T-AOC)、血清丙二醛(MDA)含量及肝胰臟超氧化物歧化酶(SOD)活力, 但對肝胰臟T-AOC、MDA含量、谷胱甘肽(GSH)含量及血清SOD活力無顯著影響。實驗30d和60d時, 投喂蠶豆的草魚機體抗氧化能力強于投喂配合飼料的草魚, 但實驗100d時兩種養殖模式的草魚機體抗氧化能力無顯著差異。投喂蠶豆對草魚免疫機能有一定的影響, 實驗100d時, 投喂蠶豆的草魚血液紅細胞數量(RBC)及白細胞數量(WBC)顯著高于投喂配合飼料的草魚。投喂蠶豆的草魚血清TP、ALB、GLB含量在實驗30d時顯著低于投喂配合飼料的草魚, 在實驗60d時與投喂配合飼料的草魚無顯著差異, 在實驗100d時又顯著低于投喂配合飼料的草魚。投喂蠶豆顯著影響了草魚脾指數及脾臟中免疫相關基因的表達, 實驗末期, 在投喂蠶豆的草魚脾臟中、Ⅱ、1、的表達量顯著高于投喂配合飼料的草魚。以上結果表明, 投喂蠶豆初期魚體抗氧化能力增強, 隨著投喂時間的增加, 魚體抗氧化能力降低至與投喂配合飼料相當的水平; 投喂蠶豆使草魚產生了免疫應答。

草魚; 蠶豆; 脆肉鯇; 抗氧化; 免疫

使用蠶豆()喂養草魚(), 可提高草魚的肌肉品質, 這種獨特的養殖方式最早出現在20世紀70年代的廣東省中山市。人們使用浸泡24h的去殼蠶豆連續投喂草魚100d左右, 養成的草魚的肌肉較使用商用配合飼料養出的草魚的肌肉具有更高的硬度和咀嚼性[1—6], 這種使用蠶豆喂養出的草魚俗稱“脆肉鯇”, 其因肌肉久煮不爛、耐咀嚼而深受人們喜愛。投喂蠶豆不僅可以改變草魚的肌肉品質, 鯽()[1, 7]、羅非魚()[8]、斑點叉尾()[9]在投喂蠶豆后, 肌肉品質也會發生變化。

近年來, “蠶豆改變草魚肌肉品質”的這一現象吸引了諸多學者的注意力, 但大多數研究集中在探討脆肉鯇肌肉質構特性及肌肉營養成分方面, 關于脆肉鯇在養殖過程中的生理生化變化鮮有報道。已有研究表明, 魚體的營養狀況與免疫狀況密切相關[10, 11]; 營養物質不僅促進魚體生長, 同時也刺激魚體的免疫系統[12]。此外, 抗營養因子也對動物的健康具有不良影響[13]。蠶豆的營養成分并不能較好滿足草魚的營養需求, 且蠶豆中含有大量抗營養因子, 長期投喂蠶豆, 容易導致草魚營養不良, 其免疫機能也可能受到影響。此外, 生產實踐表明, 脆肉鯇肌肉變化是一個時間依賴性的過程, 在養殖后期肌肉的變化更為明顯?；诖? 本研究主要探討飼喂蠶豆及養殖時間對草魚抗氧化能力及免疫機能的影響, 以期為進一步探索脆肉鯇肌肉品質改變的原因提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗魚及管理

實驗在廣東省中山市大涌鎮一養殖場(北緯22°26′48″; 東經113°15′22″)的一個池塘中進行, 該池塘平均水深1.5 m, 池塘中設置6個圍隔, 每圍隔面積約100 m2。300尾規格均勻的草魚被隨機均分到6個圍隔中, 在進行兩周的馴養過程中, 每天用等量的商用配合飼料兩次飽食投喂(9:00和18:00)。在馴養期后, 將6個圍隔分為兩個處理組, 每處理組3個重復。其中一個處理組投喂商用配合飼料(Formula feed, FF, 中山市新泰飼料廠, 903魚料), 另一處理組投喂用池塘水浸泡過24h的去殼蠶豆(Faba bean, FB), 每天兩次飽食投喂(9:00和18:00)。實驗從2012年7月中旬開始至2012年11月上旬結束。蠶豆和商用配合飼料常規成分見表1。

1.2 取樣

在馴養期結束后的第30、第60和第100天分別從每個圍隔中取6尾魚, 經MS-222麻醉后稱重(各時間點魚體重如表2所示)。臀鰭后方尾動脈或尾靜脈取血(抗凝血和非抗凝血各一份), 抗凝血立即進行紅、白細胞計數, 計數操作按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行(僅對養殖100d時的血液紅、白細胞進行了計數, 且每圍隔僅挑選了1尾魚的抗凝血進行計數); 非抗凝血以3500 r/min離心15min后, 取上層血清。之后將實驗魚解剖, 分離肝胰臟及脾臟, 并稱重以計算脾指數(脾指數為脾重占體重的百分比)。用于測定酶活力的肝胰臟組織置于液氮中; 用于Real-time PCR的脾臟組織浸于sample protector (TaKaRa)中, 之后置于液氮中。所有樣品經液氮速凍后, 用干冰轉運至實驗室后置于–80℃保存。

1.3 抗氧化相關指標的測定

同一取樣點同一圍隔6尾魚的血清樣品等量混勻后, 按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書測定血清總抗氧化能力(Total antioxidative capacity, T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活力及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量。同一取樣點同一圍隔6尾魚的肝胰臟樣品等量混合后, 按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書測定肝胰臟T-AOC、SOD活力、MDA及谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量。

1.4 血清TP、ALB、GLB的含量測定

同一取樣點同一圍隔的6尾魚的血清等量混勻后, 使用西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀測定血清總蛋白(Total protein, TP)、白蛋白(Albumin, ALB)及球蛋白(Globulin, GLB)含量。

1.5 總RNA的提取及反轉錄

同一取樣點同一圍隔的6尾魚的脾臟樣品等量混合后, 依照RNAiso Plus (TaKaRa)說明書提取脾臟總RNA, 瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性。通過OD260對RNA定量后, 取1 μg RNA使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)進行基因組DNA去除反應及反轉錄, 所得的cDNA –20℃保存備用。

表1 蠶豆與配合飼料的常規成分(平均值±標準差,n=3)

表2 各取樣點實驗用魚的體重(kg, 平均值±標準誤,n=3)

1.6 熒光定量PCR

使用Primer premier 5.0設計各基因的特異性跨內含子引物(引物序列見表3), 擴增的PCR產物經測序無誤后進行Real-time PCR。Real-time PCR在Rotor-Gene Q(QIAGEN)上進行, 擴增體系使用SYBR Premix ExII (TaKaRa)推薦的體系進行。PCR反應程序使用95℃預變性5min, 95℃ 5s、退火30s、72℃ 30s、40個循環, 之后進行溶解曲線分析。每份樣品做3個復孔。結果分析采用2–ΔΔCt方法進行。

表3 Real-time PCR中所用引物

1.7 數據分析

對100d兩處理組的紅、白細胞數據分別進行檢驗。其他數據以養殖時間和飼料類型作為固定因素采用SPSS 17.0進行雙因素方差分析, 并結合Duncan氏法進行多重比較。

2 結果

2.1 在飼喂蠶豆過程中草魚肝胰臟抗氧化能力的變化

由表4可知, 養殖時間顯著影響草魚肝胰臟T-AOC、SOD活力、MDA及GSH的含量(<0.05)。具體表現在: 100d時肝胰臟的T-AOC、SOD活力、MDA及GSH的含量均顯著低于60d時的(<0.05); 60d時, 肝胰臟的T-AOC及MDA含量均顯著高于30d時的(<0.05), 而肝胰臟的SOD活力與30d時差異不顯著(>0.05), 肝胰臟GSH含量顯著低于30d的(<0.05); 100d時肝胰臟的T-AOC、SOD活力及GSH的含量均顯著低于30d時的(<0.05)。不同飼料對草魚肝胰臟T-AOC、MDA及GSH的含量沒有顯著影響(>0.05), 但對肝胰臟SOD活力有顯著影響(<0.05), 投喂FB的草魚其肝胰臟SOD活力顯著高于投喂FF的草魚(<0.05)。

飼養時間和飼料對草魚肝胰臟SOD活力及GSH含量表現出交互作用(<0.05)。表現在: 100d時, 投喂FB的草魚的肝胰臟SOD活力顯著低于投喂FF的草魚(<0.05); 60d時, 投喂FB的草魚肝胰臟GSH含量顯著高于投喂FF的草魚(<0.05); 30d時, 投喂FB的草魚肝胰臟GSH含量顯著低于投喂FF的草魚(<0.05); 投喂FB的草魚肝胰臟GSH含量在60d時與30d時差異不顯著(>0.05)。

2.2 在飼喂蠶豆過程中草魚血清抗氧化能力的變化

由表5可知, 養殖時間顯著影響草魚血清T-AOC、MDA含量及SOD活力(<0.05)。100d時血清T-AOC顯著低于60d及30d時的(<0.05), 60d時血清T-AOC顯著低于30d時的(<0.05); 100d時血清MDA含量與60d時無顯著差異(>0.05), 均顯著低于30d時的(<0.05); 100d時血清SOD活力與30d時無顯著差異(>0.05), 均顯著高于60d時的(<0.05)。不同飼料對草魚血清SOD活力沒有顯著影響(>0.05), 但對血清T-AOC及MDA含量有顯著影響(<0.05)。投喂FB的草魚血清T-AOC顯著高于投喂FF的草魚(<0.05), 而血清MDA含量顯著低于投喂FF的草魚(<0.05)。

飼養時間和飼料對草魚血清T-AOC及SOD活力表現出交互作用(<0.05)。100d時, 投喂FB的草魚與投喂FF的草魚血清T-AOC無顯著差異(>0.05); 100d時, 投喂FB的草魚血清SOD活力顯著高于投喂FF的草魚(<0.05); 60d時, 投喂FB的草魚血清SOD活力顯著低于投喂FF的草魚(<0.05); 投喂FF的草魚60d時的血清T-AOC與30d及100d時的血清T-AOC均無顯著差異(>0.05);投喂FF的草魚血清SOD活力在30d、60d及100d時差異不顯著(>0.05)。

表4 飼喂蠶豆對草魚肝胰臟抗氧化能力的影響(平均值±標準誤, n=3)

注: 在相同的一組數據中若標有不同的字母, 則代表差異顯著(<0.05); 下同

Note: Means with different superscripts are significantly different (<0.05); the same applies bellow

表5 飼喂蠶豆對草魚血清抗氧化能力的影響(平均值±標準誤,n=3)

2.3 飼喂蠶豆過程中草魚血清TP、ALB、GLB含量的變化

由表6可知, 養殖時間對草魚血清TP、ALB及GLB含量無顯著影響(>0.05), 而不同飼料顯著影響草魚血清TP、ALB及GLB含量(<0.05)。投喂FB的草魚血清TP、ALB及GLB含量顯著低于投喂FF的草魚(<0.05)。

飼養時間和飼料對草魚血清TP、ALB及GLB含量表現出交互作用(<0.05)。60d時, 投喂FB的草魚血清TP、ALB及GLB含量與投喂FF的草魚無顯著差異(>0.05); 30d時, 投喂FB的草魚血清GLB含量與投喂FF的草魚無顯著差異(>0.05); 投喂FB的草魚在60d時的血清TP及GLB含量顯著高于30d時及100d時的(<0.05); 投喂FF的草魚在60d時的血清ALB含量顯著高于30d時及100d時的(<0.05)。

表6 兩處理組草魚血清總蛋白、球蛋白和白蛋白含量(平均值±標準誤, n=3)

2.4 飼喂蠶豆對草魚血液紅細胞及白細胞數量的影響

在養殖100d后, 兩處理組草魚的血液紅細胞及白細胞的數量見表7。結果顯示, 100d時投喂FB的草魚血液的紅細胞數量及白細胞數量均顯著高于投喂FF的草魚(<0.05)。

2.5 飼喂蠶豆過程中草魚脾指數的變化

由圖1可知, 養殖時間對草魚脾指數無顯著影響(>0.05); 不同飼料對草魚脾指數有顯著影響(<0.05), 投喂FB的草魚的脾指數顯著低于投喂FF的草魚<0.05); 養殖時間和飼料對草魚脾指數沒有交互作用(>0.05)。

表7 養殖100d時兩處理組草魚血液紅細胞數量及白細胞數量(平均值±標準誤, n=3)

2.6 飼喂蠶豆過程中草魚脾臟中免疫相關基因表達的變化

脾臟中免疫相關基因白介素-1β()、主要組織相容性復合體Ⅱ(Ⅱ,Ⅱ)、Ⅰ型干擾素(1,1)、腫瘤壞死因子-α(,)的表達情況如圖2所示。由圖2可知, 飼料、養殖時間均顯著影響草魚脾臟Ⅱ、、基因的表達(<0.05)。投喂FB的草魚脾臟、的表達量均顯著高于投喂FF的草魚(<0.05), 而Ⅱ的表達量顯著低于投喂FF的草魚(<0.05)。100d時, 脾臟Ⅱ、-、基因的表達量均顯著高于30d時的和60d時的(<0.05)。

飼養時間和飼料對草魚脾臟Ⅱ、、基因的表達有交互作用(<0.05)。30d及60d時,在投喂FB的草魚脾臟中的表達量與投喂FF的草魚脾臟中的表達量差異不顯著(>0.05); 100d時,Ⅱ在投喂FB的草魚脾臟中的表達量顯著高于投喂FF的草魚(<0.05); 30d時,在投喂FB的草魚脾臟中的表達量顯著低于投喂FF的草魚(<0.05)。

柱上不同字母表示差異顯著(<0.05)

Bars with different superscripts are significantly different (<0.05); the same applies bellow

3 討論

相比于大豆, 同為蝶形花亞科的蠶豆, 在水產動物飼料領域研究較少。在畜禽研究領域, 僅在20世紀80年代有少數學者研究過飼料中添加蠶豆對雞、豬生長性能的影響。相關結果表明飼料中蠶豆添加量高于20%時, 就會對豬的生長性能產生不利影響; 在母雞飼料中, 蠶豆的添加量上限為25%。然而脆肉鯇這種養殖模式是以蠶豆作為唯一飼料, 長期飼喂蠶豆可能會造成草魚營養缺乏, 且已有研究表明其生長性能較低[1], 因而推測脆肉鯇在養成后, 其機體生化指標可能與投喂配合飼料的草魚有所區別。故本實驗從飼喂蠶豆對草魚抗氧化能力及免疫機能兩方面入手, 探討脆肉鯇肌肉發生變化過程中, 魚體抗氧化能力及免疫機能的變化, 以為研究脆肉鯇肌肉變化的原因提供參考。

3.1 飼喂蠶豆對草魚抗氧化能力的影響

蠶豆除了含有單寧、多酚等抗營養因子, 還含有胰蛋白酶抑制因子及血球凝集素等不良因子。有研究表明, 胰蛋白酶抑制因子能夠使小鼠體內的自由基增加, 導致氧化應激的產生[14]; 而血球凝集素具有刺激淋巴細胞轉化及分裂的作用。在本實驗中, 不同飼料顯著影響了草魚血清T-AOC及血清MDA含量, 投喂蠶豆的草魚血清T-AOC顯著高于投喂配合飼料的草魚, 而血清MDA含量顯著低于投喂配合飼料的草魚。隨著養殖時間的推移, 初期投喂蠶豆的草魚血清T-AOC高于投喂配合飼料的草魚, 血清MDA含量及SOD活力差異不顯著; 后期兩處理組草魚血清T-AOC無顯著差異, 而投喂蠶豆的草魚其血清SOD活力高于投喂配合飼料的草魚, 其血清MDA含量低于投喂配合飼料的草魚。這些結果表明, 與投喂配合飼料相比, 投喂蠶豆可提高草魚血清的抗氧化能力, 降低機體脂質過氧化。而隨著養殖時間的推移, 血清總抗氧化能力會降低至與投喂配合飼料的草魚相當的水平。

對肝胰臟抗氧化能力而言, 不同飼料對草魚肝胰臟T-AOC、GSH及MDA含量無顯著影響, 但對肝胰臟SOD活力有影響。60d時投喂蠶豆的草魚肝胰臟T-AOC、SOD活力及GSH含量均顯著高于投喂配合飼料的草魚, 至100d時兩處理組肝胰臟T-AOC及GSH含量差異不顯著。這表明投喂蠶豆初期肝胰臟抗氧化能力高于投喂配合飼料的草魚, 后期與投喂配合飼料的草魚相當。這可能是因為, 投喂蠶豆初期機體有應激反應, 而隨著時間的推移, 機體逐漸適應了投喂蠶豆的養殖模式。

3.2 飼喂蠶豆對草魚免疫機能的影響

在抵御病原生物侵襲過程中, 魚類的非特異性免疫發揮著重要作用。白細胞在魚類非特異性免疫中扮演著重要作用。在本研究中, 100d時, 飼喂蠶豆的草魚血液白細胞數量高于飼喂配合飼料的草魚, 這與唐湘北[15]的研究結果一致, 表明投喂蠶豆100d對草魚機體的免疫系統有一定的刺激。這可能是由于蠶豆營養成分并不完全符合草魚的營養需求, 長期以蠶豆作為單一飼料, 對草魚的免疫機能造成了影響。

脾臟是魚類的主要免疫器官, 在魚類的免疫保護方面具有重要意義, 脾指數可以反映免疫器官的生長發育狀態[16]。在本實驗中, 飼料對草魚脾指數有顯著影響, 而養殖時間不影響草魚脾指數, 且60d及100d時飼喂蠶豆的草魚與飼喂配合飼料的草魚的脾指數差異不顯著。這表明雖然蠶豆的營養成分不均衡, 但尚未對脾臟造成損傷。

總蛋白(TP)由白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)組成, 其濃度是魚體健康狀況的基本指標[17]。較高的血清球蛋白含量對應著較強的免疫力[18], 較高的血清白蛋白標志著較快的生長速度。在本研究中, 飼喂蠶豆的草魚其血清TP、ALB、GLB含量均顯著低于飼喂配合飼料的草魚, 血清ALB含量較低可能是脆肉鯇生長較普通草魚慢的一個原因, 而血清GLB含量較低提示飼喂蠶豆的草魚免疫力較飼喂配合飼料的草魚弱。從養殖時間上來看, 30d時飼喂蠶豆的草魚其血清TP及ALB均顯著低于飼喂配合飼料的草魚, 60d時兩處理組血清TP、ALB、GLB無顯著差異, 100d時飼喂蠶豆的草魚其血清TP、ALB及GLB又都顯著低于飼喂配合飼料的草魚。這可能是由于養殖初期草魚攝食蠶豆造成營養缺乏, 而中期機體代謝系統發揮作用以代償營養缺乏, 但養殖末期魚體無法再補償蠶豆的營養缺乏, 從而造成100d時血清TP、ALB及GLB含量低于飼喂配合飼料的草魚。

主要組織相容性復合體(MHC)的主要功能是呈遞抗原, 使其為T細胞所識別, 激活體液免疫和細胞免疫。魚類MHC主要分為MHC Ⅰ和MHC Ⅱ兩類, 通常MHC Ⅰ應答細胞內的病毒感染, 而MHC Ⅱ應答細菌的體液反應[19]。干擾素(IFN)除了具有抑制病毒復制的生物學活性, 還具有促進巨噬細胞吞噬殺菌、調節淋巴細胞轉化等功能[20]。IL-1β及TNF-α是由單核吞噬細胞分泌的, 是引起炎癥反應、抵抗細菌感染的主要介質。投喂蠶豆的草魚其脾臟中、、的表達量顯著高于投喂配合飼料的草魚, 且隨著實驗的進行, 投喂蠶豆的草魚脾臟中、、Ⅱ、的表達量不斷升高。這可能是由于蠶豆營養成分不均衡, 或因蠶豆含有血清凝集素等因子, 從而刺激脾臟免疫相關基因高表達。

綜上所述, 投喂蠶豆初期魚體抗氧化能力強于投喂配合飼料的草魚, 而隨著養殖時間的推移, 魚體抗氧化能力逐漸恢復至與投喂配合飼料的草魚相當的水平。相比于投喂配合飼料, 飼喂蠶豆會使草魚血液中紅、白細胞數目增多, 會造成草魚血清球蛋白含量降低, 但會促使脾臟中免疫相關基因的表達量升高。然而, 脆肉鯇肌肉品質的改變是否與魚體免疫機能發生變化有關, 則需要進一步的研究探明。

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EFFECTS OF FEEDING WITH FABA BEAN () ON THE ANTIOXIDANT CAPABILITY AND IMMUNE FUNCTIONS OF GRASS CARP ()

Wu Kang1, 2, 3, Huang Xiao-sheng4, Jin Jie-nan1, 2, Li Nan4and Zhang Xue-zhen1, 2

(1. Fisherise College, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China; 3. Institute of Industrial Crops, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China; 4. Fisheries Technical Extension Center of Zhongshan City, Zhongshan 528403, China)

Crisp grass carp is a common name forthat is fed with faba bean () for 100 days and thus has improved flesh quality, flexibility and mastication properties compared to grass carp fed with regular formula. To better understand the changes in the physiology of crisp grass carp, we explored and compared the antioxidative status and immune functions of crisp grass carp (grass carp fed with faba bean, FB) and common grass carp (grass carp fed with formula feed, FF). Both the FB and FF groups were reared for 30 days, 60 days and 100 days before sampling. The results showed that FB markedly affected the SOD activity in the liver, and T-AOC and MDA in the serum. However, it had little impact on T-AOC and MDA in the liver, GSH in the liver, and the SOD activity in the serum. Fish fed with FB possessed higher antioxidative capability than those fed with FF when tested on the 30th and the 60th day; however on the 100th day the antioxidative capabilities of the two groups were similar. On the 100th day WBC and RBC of the FB group were significantly higher than those of the FF group. On the 30th and the 100th day levels of TP, ALB and GLB in the serum were significantly decreased by feeding with FB compared to the FF group. In the contrast, there was no difference in the serum TP, ALB and GLB between the two groups on the 60th day. The spleen index and the transcription of some immunity-related genes in the spleen could also be altered by diet. On the 100th day, the transcription of,Ⅱ,1 andin the spleen of the FB group was significantly higher than that of the FF group. These results indicated that antioxidative capability of grass carp could be initially enhanced by feeding with faba bean, followed by a decrease to the level of grass carp fed with formula feed. The immune functions of grass carp could also be changed by feeding with faba bean.

;; Crisp grass carp; Antioxidant capability; Immune function

10.7541/2015.33

S917

A

1000-3207(2015)02-0250-09

2014-04-14;

2014-08-19

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-46-15A); 中山市水產技術推廣中心站項目資助

吳康(1988—), 男, 陜西安康人; 碩士; 研究方向為水產動物營養與飼料。E-mail: wuk@webmail.hzau.edu.cn

張學振, E-mail: xuezhen@mail.hzau.edu.cn