不同形式蛋氨酸對建鯉生長性能及血清游離氨基酸含量的影響

單玲玲 李小勤, 3, 4 鄭小淼 趙鑫鑫 冷向軍, 3, 4

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不同形式蛋氨酸對建鯉生長性能及血清游離氨基酸含量的影響

單玲玲1, 2李小勤1, 2, 3, 4鄭小淼1趙鑫鑫1冷向軍1, 2, 3, 4

(1. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306; 2. 上海海洋大學農業部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306; 3. 上海市水產養殖工程技術研究中心, 上海 201306; 4. 上海高校知識服務平臺, 上海海洋大學水產動物遺傳育種中心ZF1206, 上海 201306)

為考察不同形式蛋氨酸對建鯉生長的作用效果, 實驗以豆粕、魚粉、棉粕為蛋白源, 配制缺乏蛋氨酸的基礎飼料(對照組, 蛋氨酸含量為0.48%), 在基礎飼料中分別添加晶體蛋氨酸、微囊蛋氨酸、蛋氨酸羥基類似物(MHA)及蛋氨酸羥基類似物鈣鹽(MHA-Ca), 使蛋氨酸含量達到0.58%, 獲得5個飼料處理組, 飼養平均體重為(8.6±1.0) g的建鯉(Jian)8周。結果顯示: 各組魚體增重率分別為343.51%、350.77%、382.80%、384.02%和385.59%; 飼料系數分別為1.58、1.55、1.42、1.42和1.41; 晶體蛋氨酸組魚體增重率、飼料系數與對照組無顯著差異(<0.05), 微囊蛋氨酸組、MHA組、MHA-Ca組增重率較對照組提高11.4%、11.8%、12.2% (<0.05), 飼料系數降低10.1%、10.1%、10.8% (<0.05)。各處理組在肌肉水分、脂肪含量間無顯著差異(>0.05), MHA組肌肉粗蛋白含量較晶體蛋氨酸組顯著下降, 其他各組間無顯著差異(>0.05)。對攝食后不同時間的血清游離氨基酸濃度變化的分析表明, 對照組在攝食后2h或3h達到峰值, 晶體蛋氨酸組、MHA組在攝食后1h達到吸收峰值, 微囊蛋氨酸組在攝食后1h或2h達到峰值, 而MHA-Ca組則在攝食后3h達到峰值。上述結果表明, 在蛋氨酸缺乏的顆粒飼料中補充晶體蛋氨酸, 對建鯉生長性能無改善作用, 而添加微囊蛋氨酸、蛋氨酸羥基類似物、蛋氨酸羥基類似物鈣鹽則顯著提高了魚體生長性能, 降低飼料系數。

建鯉; 晶體蛋氨酸; 微囊蛋氨酸; 蛋氨酸羥基類似物; 生長; 血清游離氨基酸

由于魚粉資源的緊缺和價格的不斷上漲, 越來越多的植物蛋白源被應用于水產飼料, 其中豆粕是應用最為廣泛的植物蛋白源之一。在豆粕中蛋氨酸較為缺乏, 而蛋氨酸是必需氨基酸, 對魚體正常生長及新陳代謝有重要作用[1], 飼料中蛋氨酸的缺乏會對動物生長造成不利影響[2]。因此, 補充外源性蛋氨酸成為提高豆粕營養價值的重要措施。目前, 研究應用過的蛋氨酸有晶體DL-蛋氨酸、微囊DL-蛋氨酸、蛋氨酸羥基類似物(MHA)、蛋氨酸羥基類似物鈣鹽(MHA-Ca)等[3]。

在飼料中添加晶體DL-蛋氨酸, 對虹鱒()[4]、真鯛()[5]、五條()[6]、尖吻鱸()[7]、羅非魚()[8]等生長具有改善作用; 但在草魚()[9]、胭脂魚()[10]、鯉()[11]、異育銀鯽()[12]、斑節對蝦()[13]的研究中, 飼料中補充晶體氨基酸對生長性能并無顯著改善。水產動物對晶體氨基酸利用效果不佳的原因, 通常認為與晶體氨基酸和飼料中蛋白態氨基酸吸收不同步有關[14]。為改善水產動物對晶體氨基酸利用, 通常的做法是對晶體氨基酸進行緩釋處理, 如包膜、微膠囊化等, 目前, 氨基酸緩釋處理后改善了利用性的報道, 已見于鯉[11]、異育銀鯽[12]、草魚[9]、斑節對蝦[13], 在羅非魚飼料中添加微囊蛋氨酸較添加晶體蛋氨酸具有更好的改善生長的效果[8]。

蛋氨酸羥基類似物(MHA), 是蛋氨酸的氨基被羥基替代所形成的具有蛋氨酸活性的物質, 呈液態; 由于液體在運輸、儲存和使用中存在諸多不便, 因此, 在MHA基礎上, 又進一步發展了其固體的鈣鹽形式, 蛋氨酸羥基類似物鈣鹽(MHA-Ca)。MHA有L型、D型兩種異構體, MHA進入機體后需轉化成L-蛋氨酸才能被機體利用。在小鼠[15]和肉雞[16]的研究中, MHA在通過腸道黏膜上皮細胞擴散時就開始發生轉化: 在過氧化物酶體系下發生氧化生成酮型蛋氨酸(KMB), KMB經轉氨基作用生成L-蛋氨酸, 所有的氨基酸都可提供氨基[17]。催化L-MHA、D-MHA氧化的酶分別是L-2-羥基酸氧化酶(L-HAOX)、D-2-羥基酸脫氫酶(D-HADH); L-HAOX主要存在于肝臟和腎臟[18, 19], D-HADH存在于全身的線粒體細胞中[16]。

蛋氨酸羥基類似物在動物養殖上的作用效果并不一致。在仔豬飼料中添加DL-蛋氨酸、MHA-Ca均改善了生長性能, 提高了氮保留率[20]; MHA-Ca可提高肉雞對植物性飼料的利用率, 并達到了與D-蛋氨酸同樣的作用效果[21]; 而且MHA較DL-蛋氨酸能更好地促進肉雞肌肉生長, 改善肌肉品質及質構特性[22]。在魚類的研究中, 在植物性飼料中添加L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸及蛋氨酸羥基類似物, 均能顯著提高紅鼓魚()增重率、飼料轉化效率和蛋白質轉化效率[23]; 在豆粕型飼料中添加0.135%蛋氨酸羥基類似物鈣鹽, 可顯著提高建鯉()增重率和飼料利用效率[24]; 雜交條紋鱸()[25, 26]也能有效利用蛋氨酸羥基類似物。然而, Robinson等[27]發現斑點叉尾() 對蛋氨酸羥基類似物利用率只有L-蛋氨酸的26%(以增重率為指標); 雜交狼鱸()[28, 29]、虹鱒()[30]等對蛋氨酸羥基類似物的利用效果均不如DL-蛋氨酸, 在肉雞上也有類似報道[31]。

建鯉是以荷包紅鯉和沅江鯉為親本選育的良種, 具有生長速度快、抗病能力強、含肉多等特點, 是我國淡水養殖的重要品種之一。目前, 建鯉對蛋氨酸的需求量并沒有標準, 多是參考普通鯉的需求量。有研究表明, 在飼料蛋白質水平為35%條件下, 蛋氨酸水平為1.16%時, (12—20) g幼建鯉生長最佳[32]。本實驗以豆粕為主要蛋白源, 配制了蛋氨酸缺乏的基礎飼料, 在此基礎上添加晶體蛋氨酸、微囊蛋氨酸、蛋氨酸羥基類似物、蛋氨酸羥基類似物鈣鹽, 形成4組實驗飼料, 飼喂建鯉, 以比較不同形式蛋氨酸對建鯉的作用效果, 并檢測各組建鯉攝食后血清中游離氨基酸的變化情況, 為不同形式蛋氨酸在水產飼料中的合理應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以豆粕、棉粕、魚粉為蛋白源, 配制蛋氨酸缺乏的基礎飼料(蛋氨酸0.48%)。根據NRC標準(2012)[33], 鯉對賴氨酸的需求量為2.2%, 蛋氨酸0.7%, 依據賴氨酸與蛋氨酸的比值為0.318, 在基礎飼料(對照組)中分別添加晶體蛋氨酸、微囊蛋氨酸、MHA及MHA-Ca, 使蛋氨酸含量達到0.58%?；A飼料配方見表1。上述5組飼料原料全部粉碎過40目篩, 充分混勻, 加水攪拌均勻, 以平模制粒機制成粒徑為2 mm的顆粒飼料[制粒溫度為(70±5)℃], 共5種飼料, 即對照組(C)、晶體蛋氨酸組(CM)、微囊蛋氨酸組(EM)、MHA組及MHA-Ca組。所用晶體蛋氨酸為DL-Met, 有效含量98%; 微囊蛋氨酸有效含量49%; MHA有效含量88%; MHA-Ca有效含量86%。

1.2 實驗魚及飼養管理

實驗用建鯉購回后, 暫養于循環水養殖桶中, 飼喂商業配合飼料(粗蛋白含量33%, 粗脂肪含量5%)。暫養期結束, 挑選體格健壯、體重8.6 g左右的450尾建鯉, 隨機分配于15個自動充氣循環的玻璃水族缸(0.6 m×0.55 m×0.5 m), 共5個處理組, 每處理組3個平行(缸), 每缸25尾魚。每天于8:00、12:00和17:00投喂, 實驗初期投飼量為魚體重的3%—5%, 并根據天氣和攝食情況作適當調整, 以投飼后5min內食完為宜, 各箱投飼量保持一致。養殖期間, 水溫為(23—27)℃, pH 7.0—8.0, 溶氧>7 mg/L, 氨氮≤0.1 mg/L。

1.3 樣品采集

在養殖過程中, 每兩周以缸為單位稱量魚體重并計數(稱量前饑餓24h), 計算增重率、成活率。養殖8周實驗結束后, 禁食24h, 每缸取4尾魚, 解剖取內臟、肝臟并稱重, 取肌肉保存于–80℃用于肌肉常規營養成分測定。

在養殖實驗結束后, 實驗魚正常飼喂3d, 禁食24h, 飽食投喂, 分別在飼喂前(0h)及飼喂后1h、2h、3h、4h、5h, 每缸取3尾魚, 于尾靜脈處采血, 3000 r/min離心10min、取血清, –80℃凍存以測定游離氨基酸水平。

1.4 測量指標及方法

生長性能增重率=(末重–初重)/初重×100%

飼料系數=飼料攝入量/(末重–初重)×100%

蛋白質效率()=體重增加量/(飼料攝取量×飼料蛋白質含量)×100%

肝體比=肝胰腺重/體重×100%

臟體比=內臟重/體重×100%

肌肉營養成分肌肉成分分析按照AOAC (1995)[34]標準方法。將肌肉解凍制成肉糜進行常規分析, 水分含量、粗蛋白含量及粗脂肪含量的測定分別采用105℃烘干法、凱氏定氮法、索氏抽提法。

血清游離必需氨基酸的測定 在血清4℃解凍后, 取400 μL于離心管, 加入100 μL 10%的磺基水楊酸, 8000 r/min離心10min, 取上清, 重復以上步驟2次以去除血清中的蛋白質。所得上清液按體積比1︰1加入乙酸乙酯(HPLC), 混勻, 離心, 取下層液, 重復三次, 去除血清中脂類。將處理好的血清樣品按體積比1︰2加入鋰鹽稀釋液, 以0.22 μm的濾膜過濾, 用Sykam S-433D全自動氨基酸分析儀(德國)測定血清中游離氨基酸含量。

表1 實驗飼料組成營養成分含量

注: 1. 礦物質預混料配方(mg or g/kg 飼料): I, 0.4 mg; Co, 0.1 mg; Cu, 4 mg; Fe, 150 mg; Zn, 80 mg; Mn, 20 mg; Se, 0.1 mg; Mg, 100 mg; 沸石粉, 3.539 g; 2. 維生素預混料配方(mg or IU/kg 飼料): VA, 6000IU; VB1, 15 mg; VB2, 15 mg; VB3, 30 mg; VB5, 35 mg; VB6, 6 mg; VB12, 0.03 mg; VC, 200 mg; VD3, 2000IU; VE, 50 mg; VK3, 5 mg; 肌醇, 200 mg; 葉酸, 3 mg; 生物素, 0.2 mg

Note: 1. Ingredient of mineral permix (mg or g/kg diet): I, 0.4 mg; Co, 0.1 mg; Cu, 4 mg; Fe, 150 mg; Zn, 80 mg; Mn, 20 mg; Se, 0.1 mg; Mg, 100 mg; zeolite power, 3.539 g; 2. Ingredient of vitamin permix (mg or g/kg diet): VA, 6000IU; VB1, 15 mg; VB2, 15 mg; VB3, 30 mg; VB5, 35 mg; VB6, 6 mg; VB12, 0.03 mg; VC, 200 mg; VD3, 2000IU; VE, 50 mg; VK3, 5 mg; inositol, 200 mg; folic acid, 3 mg; biotin, 0.2 mg

1.5 數據分析

數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和Duncan’s 多重檢驗及獨立樣本檢驗, 用平均數± 標準差表示,<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 生長性能

養殖期間各階段(2、4、6、8周)的建鯉體重見圖1。在第2周, MHA-Ca組的魚體重顯著高于晶體蛋氨酸組(<0.05), 其他各組間無顯著差異(>0.05); 在第4、第6周, 微囊蛋氨酸組、MHA組、MHA-Ca組體重較對照組、晶體蛋氨酸組有增加趨勢(<0.10);在第8周, 微囊蛋氨酸組、MHA組、MHA-Ca組建鯉體重均顯著高于對照組和晶體蛋氨酸組(<0.05)。

在養殖8周后, 各組建鯉成活率均為100% (表3)。在顆粒飼料中補充晶體蛋氨酸對魚體生長性能無改善(>0.05), 補充微囊蛋氨酸、MHA、MHA-Ca分別提高增重率11.4%、11.8%、12.2%(<0.05), 降低飼料系數10.1%、10.1%、10.8%(<0.05); 微囊蛋氨酸組、MHA組、MHA-Ca組蛋白質效率較對照組、晶體蛋氨酸組也顯著提高(>0.05)。

各組建鯉在臟體比、肝體比方面沒有表現顯著差異(>0.05), 但各蛋氨酸添加組的肝體比較對照組呈現出降低的趨勢(<0.10)。

同一階段的柱形圖上, 具不同字母者, 表示差異顯著(<0.05)

Values in the column at the same time with different letters are significantly difference (<0.05)

表2 不同形式蛋氨酸對建鯉生長性能的影響

注: 同行上標小寫字母不同表示兩者之間有顯著差異 (<0.05); 下同

Note: Values in the same row with different letters are significantly difference (<0.05); the same applies bellow

2.2 肌肉成分

從表3可見, MHA組肌肉蛋白質含量顯著低于晶體蛋氨酸組(<0.05), 其他各組沒有顯著差異(>0.05); 水分、粗脂肪含量在各組間無顯著差異(>0.05)。

2.3 攝食后不同時間段血清游離氨基酸變化

從圖2可見, 對照組在攝食后2h或3h達到峰值, 晶體蛋氨酸組、MHA組在攝食后1h達到吸收峰值, 微囊蛋氨酸組在攝食后1h或2h達到峰值, 而MHA-Ca組則在攝食后3h達到峰值。這說明, 與對照組相比, 晶體蛋氨酸組、MHA組的氨基酸吸收峰出現時間提前; 與晶體蛋氨酸組相比, 微囊蛋氨酸組、MHA-Ca組的氨基酸吸收峰出現時間有了一定的延滯。

表3 不同形式蛋氨酸對建鯉肌肉成分的影響(濕重)

Tab.3 Influence of five diets with adding crystal methionine, encapsuled methionine, MHA and MHA-Ca on the nutrition composition of Jian carp (%)

3 討論

一些水產動物不能有效利用外源添加的晶體氨基酸, 這與晶體氨基酸與飼料結合態氨基酸不能同步吸收有關[9, 14, 35]。在晶體蛋氨酸被攝食后, 在腸道被機體快速吸收, 而飼料中其他結合態氨基酸(完整蛋白質)要經水解作用, 分解成小肽或游離氨基酸再被吸收, 兩種形態的氨基酸被腸道吸收的不同步性, 造成了較早被吸收的晶體蛋氨酸不能及時參與蛋白質合成, 而被氧化分解或排出體外[36, 37]。蛋氨酸經包被、微囊處理, 起到了緩釋作用, 從而縮短了與結合態氨基酸的吸收時間差, 使之可以得到有效利用, 從而促進魚體生長。在本實驗中, 建鯉攝食含晶體蛋氨酸飼料后, 其氨基酸峰值出現時間較對照組提前, 而微囊蛋氨酸組峰值則較晶體氨基酸組延遲, 這說明蛋氨酸經微囊處理后延長了在腸道的滯留時間, 提高了蛋氨酸利用率, 從而促進了建鯉生長。這與本實驗室之前在鯉[11]、異育銀鯽[12]上的實驗結果一致。

蛋氨酸羥基類似物作為蛋氨酸添加劑, 其生物效價一直存在爭議。雜交條紋鱸攝食含L-蛋氨酸、MHA-Ca或MHA與鋅混合物的飼料后, 其生長性能顯著改善且各組間無顯著差異[25]; 在蛋氨酸缺乏的飼料中添加DL-蛋氨酸、MHA均提高了紅鼓魚增重率、飼料轉化率和蛋白質效率[23]; 類似的報道也見于建鯉[24]、虹鱒[30]等魚類; MHA的添加, 還提高了建鯉免疫力[38]。在本實驗中, 添加MHA或MHA-Ca, 提高了魚體增重率11.8%、12.23%, 與上述研究結果相一致。這表明, 對于建鯉, 蛋氨酸羥基類似物是一種有效的蛋氨酸添加劑。然而在虹鱒的研究中, 用豆粕部分替代魚粉, 并補充MHA, 并未改善其生長效果[39]; 斑點叉尾對蛋氨酸羥基類似物的利用效果僅為L-蛋氨酸的26%[27]; 鱸對蛋氨酸羥基類似物鈣鹽的利用效果相當于L-蛋氨酸的75%[28]。由上可見, 魚類對蛋氨酸羥基類似物的利用可能存在種屬間差異, 這尚有待于進一步研究。

MHA進入機體后需轉化成L-蛋氨酸才能被機體利用。在小鼠[15]和肉雞[16]中, 這個轉化過程在MHA通過腸道黏膜上皮細胞擴散時就開始發生, 在魚類是否也存在類似機制, 目前尚未見報道。在本次實驗中, 建鯉攝食含MHA飼料后, 血清游離必需氨基酸峰值出現在攝食后1h, 與晶體蛋氨酸組相類似, 這說明MHA能被機體迅速吸收并轉化為蛋氨酸, 根據前述理論, 這樣可能存在與結合態氨基酸吸收不同步的問題, 但MHA卻為建鯉所有效利用, 并改善了生長性能, 其原因有可能是MHA進入機體后, 轉化為蛋氨酸的過程需要一定的時間, 盡管這個時間并不長, 但也在一定程度上緩解了吸收不同步問題。在本次實驗中, 攝食后的采血時間間隔為1h, 可能仍然偏長, 不足以反映出MHA組和晶體氨基酸在血液氨基酸峰值上的時間差異, 這有待于今后更為細致的研究。

在本實驗中, MHA-Ca組在攝食后3h出現血液游離氨基酸峰值, 較MHA組和晶體蛋氨酸組延緩。對于呈酸性的MHA-Ca, 在建鯉堿性的腸道環境中其結構會被破壞, 分離出鈣離子, 再進入腸上皮細胞進行L-蛋氨酸的轉化。在腸道中解離鈣離子的過程使得MHA進入細胞的時間延遲, 這可能是MHA-Ca組的血清氨基酸吸收峰較MHA組延緩的原因。

另外, 本次研究雖然在飼料中只補充了蛋氨酸, 但在攝食后不同時間段的血清氨基酸中, 并非只有蛋氨酸水平出現了變化, 其他氨基酸的吸收峰值也表現出一定程度的延遲或提前, 也就是說不同形式蛋氨酸的添加影響了其他氨基酸的吸收時間。是否蛋氨酸(或蛋氨酸羥基類似物)或其分子結構中的某一個基團作為一種信號因子, 影響了其他氨基酸吸收, 尚有待于今后進一步研究。

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EFFECTS OF DIFFERENT FORMS OF DIETARY METHIONINE ON THE GROWTH AND FREE AMINO ACIDS IN SERUM OF JIAN CARP

SHAN Ling-Ling1, 2, LI Xiao-Qin1, 2, 3, 4, ZHENG Xiao-Miao1, ZHAO Xin-Xin1and LENG Xiang-Jun1, 2, 3, 4

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources, Ministry of Aquaculture, P. R. China, Shanghai 201306, China; 3. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai 201306, China; 4. Shanghai University Knowledge Service Platform, Shanghai Ocean University Aquatic Animal Breeding Center (ZF1206), Shanghai 201306, China)

In the present study, a methionine-eficient (0.48% methionine) diet was formulated as control. Crystal methionine, encapsulated methionine, methionine hydroxy analogue (MHA), and methionine hydroxyl analog calcium salt (MHA-Ca) were added separately into the control diet to form four experimental diets with the methionine level at 0.58%. Jian carp with an initial body weight of 8.6 g were fed with these five diets and their growth rates were compared after eight weeks. The weight gain (WG) of the control group, crystal methionine group, encapsulated methionine group, MHA group and MHA-Ca group were 343.51%, 350.77%, 382.80%, 384.02%, 385.59% respectively; the feed conversion ratios () of the five groups were 1.58, 1.55, 1.42, 1.42, 1.41 respectively. Compared to the control group, the WGincreased by 11.4%, 11.8%, 12.2% in the encapsulated methionine group, the MHA group and the MHA-Ca group respectively (<0.05); thedecreased by 10.1%, 10.1%, 10.8% respectively (<0.05). However the growth was not affected by the addition of crystal methionine. There were no significant differences in the muscle moisture and crude fat contents between the five groups. The crude protein content in the muscles from the MHA group was significantly lower than that from the crystal methionine group. The free essential amino acids (FEAA) in the serum peaked at the first hour after feeding for both the crystal methionine group and the MHA group, which was one hour earlier than the control group. The serum FEAA of the encapsulated methionine group reached the maximum around the same time as the control group. The serum FEAA of the MHA-Ca group was observed to peak three hours after feeding. These results indicated that the growth of Jian carp could be improved by the addition of dietary encapsulated methionine,MHA, and MHA-Ca, but not crystal methionine.

Jian carp; Crystal Met; Encapsulated Met; MHA; Growth; Serum free amino acids

10.7541/2015.34

S965.1

A

1000-3207(2015)02-0259-08

2014-03-20;

2014-06-21

上海市農委“科技興農”重點攻關項目(2009-6-6); 上海市重點學科建設項目(Y1101)資助

單玲玲(1988－), 女, 山東省濰坊人; 碩士研究生; 主要研究方向為水產動物營養與飼料科學。E-mail: 893613053@qq.com

冷向軍, 博士生導師; E-mail: xjleng@shou.edu.cn