擬穴青蟹兩種新C-型凝集素基因的克隆與表達分析

段利朋 黃 貝 周立紅 梁 英 聶 品 黃文樹

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擬穴青蟹兩種新C-型凝集素基因的克隆與表達分析

段利朋1, 2黃 貝1, 2周立紅1, 2梁 英1, 2聶 品1黃文樹1, 2

(1. 集美大學水產學院, 廈門361021; 2. 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心, 廈門361021)

為研究擬穴青蟹()中C-型凝集素(C-lectin)的功能, 從其肝胰腺中克隆獲得全長858 bp和598 bp的兩個C-型凝集素分子, 分別命名為Sp-lectin3和Sp-lectin4, 其推導的氨基酸序列含有信號肽和一個CRD, 其中Sp-lectin4還具有糖類結合的特征性基序“QPD”。Sp-lectin3和Sp-lectin4的開放閱讀框分別由5個和4個外顯子編碼。在正常養殖青蟹的肝胰腺中該兩個基因表達量最高, 其次是射精管(Sp-lectin3)或腸(Sp-lectin4); 除腦和儲精囊外的所檢測組織/器官中, Sp-lectin4表達量均高于Sp-lectin3。隨著胚胎的發育, 該兩個基因表達量逐漸升高, 峰期為溞狀幼體, 而大眼幼體期的表達量急劇下降, 仔蟹期再回升; 在胚胎發育階段除囊胚期外, Sp-lectin4表達量極顯著高于Sp-lectin3(<0.01), 相反, 在胚后發育階段除大眼幼體II期外, Sp-lectin3表達量卻極顯著高于Sp-lectin4(<0.01)。副溶血弧菌() 人工感染, 可誘導Sp-lectin3在儲精囊和射精管中的表達, 分別在感染后12h和6h顯著上調(<0.05); 同時, 可誘導Sp-lectin4在肝胰腺中的表達, 并在感染后12h和18h顯著上調(<0.05)。結果表明, Sp-lectin3和Sp-lectin4可能參與擬穴青蟹的抗細菌感染免疫反應, Sp-lectin3側重于生殖系統如射精管和儲精囊中發揮作用, 而Sp-lectin4側重于在肝胰腺。

擬穴青蟹; C-型凝集素; 胚胎發育; 副溶血弧菌

凝集素(Lectin)是一類糖結合蛋白, 其結構特征是至少含有一個糖類識別結構域(Carbohydrates recognition domain, CRD)[1]。雖然首先在植物中發現, 但是研究發現其廣泛存在于植物、動物和微生物等所有生物體中, 主要參與病原識別、細胞間互作、蛋白質合成與轉運以及信號傳導等生命活動過程[1]。凝集素種類繁多, 結構各異, 僅僅動物凝集素根據其結構和功能不同可分為13類, 即C-型凝集素、R-型凝集素、唾液酸結合凝集素(Siglecs)、半乳凝集素(Galectin)、鈣聯結蛋白(Calnexin)、L-型凝集素、M-型凝集素、P-型凝集素、F-box凝集素、ficolin、chitinase-like凝集素、F-型凝集素和內凝集素(Intelectins) (http://www.imperial.ac.uk/research/ani-mallectins/ctld/lectins.html)。前四大類為胞外凝集素, 分泌到胞外基質或體液, 或定位于質膜上, 介導細胞黏附、細胞信號轉導, 糖蛋白清除以及病原識別等功能, 其中研究最為廣泛和深入的是C-型凝集素[2], 它們廣泛存在于從線蟲到人類的后生動物[3]。

典型C-型凝集素分子至少含有一個由120— 130個氨基酸殘基結構域, 即C-型CRD, 或Ca2+依賴型CRD, 該結構域折疊形成內、外雙環結構, 其中內環也稱為長環區, 參與鈣離子介導的糖類互作[1]。此外, 發現C-型凝集素家族的許多新成員, 雖然其氨基酸序列和高級結構均與典型C-型凝集素的CRD結構域同源性很高, 但是沒有結合碳水化合物的能力, 建議采用C-型凝集素樣結構域(C-type lectin like domain, CTLD)[4, 5]以區別典型的C-型CRD。根據結構差異, 脊椎動物C-型凝集素可分為16亞類 (Group1-16, http://www.imperial.ac.uk/research/ animallectins/ctld/lectins.html)。然而, 無脊椎動物的C-型凝集素似乎更為復雜多樣, 例如, 在果蠅()基因組中至少有 32 個編碼C型凝集素的序列[6], 而進化地位更低等的線蟲()發現至少278個基因[7]。

近年, 由于甲殼動物尤其是十足類的重要經濟價值, 其免疫抗病相關研究倍受關注。C-型凝集素是甲殼動物的重要模式識別受體之一, 也就成為研究熱點之一。在經濟十足類動物中, C-型凝集素的數量較多, 截止2014年3月1日, 在NCBI數據庫中, 收錄的中國明對蝦() C-型凝集素基因序列有9條, 凡納濱對蝦 () 7條, 克氏原螯蝦() 5條, 斑節對蝦() 3條, 中華絨螯蟹()10條, 擬穴青蟹() 5條 (包括本研究2條), 遠洋梭子蟹() 2條, 三疣梭子蟹() 1條等。它們不僅結構(一個或2個CTLD)多樣, 而且功能也各不相同。絕大多數C-型凝集素具有免疫識別和細菌凝集活性[2, 8—15], 有些可以直接殺滅細菌[9, 16]或抗病毒[17—20]; 有些通過介導酚氧化酶原活化發揮調理素功能[21]或增強調理素功能[22, 23]; 有些主要起細胞免疫作用[3, 16, 23]。

擬穴青蟹()是中國南方重要的海水養殖種類[24]。在養殖過程中, 細菌性疾病頻發并造成巨大經濟損失。例如, 2010年副溶血弧菌() 和嗜水氣單胞菌 () 等細菌感染, 導致中國汕頭地區青蟹產量下降近60%[25]。與其他無脊椎動物相似, 擬穴青蟹也缺乏獲得性免疫體系, 完全依賴先天性免疫體系來識別及抵抗外源病原體[26, 27], C-型凝集素是其重要模式識別受體之一。因此, 克隆和鑒定擬穴青蟹的C-型凝集素基因, 研究其功能, 將有助于理解青蟹的免疫防御機制, 并制訂有效的病害防控方法。然而, 與對蝦和中華絨螯蟹相比, 擬穴青蟹的C-型凝集素研究較為薄弱, 迄今僅報道2條擬穴青蟹的C-型凝集素基因序列, Sp-lectin1和Sp-lectin2[28]。本研究從擬穴青蟹肝胰腺中克隆獲得兩條新的C-型凝集素基因序列, 即Sp-lectin3與Sp-lectin4, 揭示其開放閱讀框的基因組結構, 研究其轉錄表達譜, 以及病原人工感染后該兩個基因的轉錄表達變化規律, 為全面揭示青蟹C-型凝集素的功能積累重要資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和樣品采集

擬穴青蟹購自福建省漳州市某養殖場, 體質量(150±5) g, 殼長(CL) (56±3) mm。實驗水溫(25±3)℃, 每天喂兩次花蛤。暫養1周后, 采集血液、肝胰腺、鰓、腦、肌肉、胃、心、小腸、精巢、儲精囊和射精管等組織/器官, 分別用液氮冷凍后–80℃保存。

基因克隆及組織分布研究時, 取外觀健康的青蟹8只采集上述組織/器官樣品。細菌人工感染試驗: 擬穴青蟹體質量(150±8) g, 殼長 (CL) (57±5) mm。實驗組每只注射200 μL副溶血弧菌 (, 7.5×105CFU/mL), 對照組每只注射200 μL 0.8% NaCl。注射后6h、12h、18h和24h解剖青蟹, 采集肝胰腺及性腺, 每組每個時間點各采集青蟹4只。

凝集素基因在不同發育時期表達情況研究時, 采集了囊胚期、原腸期、眼點期、色素沉積期、溞狀幼體期、大眼幼體I期、大眼幼體II期以及幼蟹8個發育期的樣品。

1.2 核酸提取

RNA提取: 約100 mg的組織/器官中加入1 mL Trizol?reagent (Invitrogen, CA, USA) 和5顆直徑3 mm玻璃微珠后進行組織勻漿(3000 r/min, 20s, Retsch MS100, Japan), 參照Trizol?reagent (Invitrogen, CA, USA)說明書提取RNA?；蚪M提取: 約100 mg青蟹肌肉, 采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0 (TaKaRa, Japan) 試劑盒提取其基因組DNA。分光光度法(Thermo, NanoDrop 2000, USA)檢測總RNA/DNA的濃度及純度, 瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA/DNA的完整性。

1.3 First-strand cDNA 的合成

cDNA克隆時, 取肝胰腺總RNA (2 μg) 進行反轉錄(SMARTerTMRACE cDNA Amplification kit, Clonetech, USA)。Realtime-PCR試驗的總RNA樣品, 經預處理(RNase-free DNase I, New England Biolabs Inc.)后, 再反轉錄(GoScriptTMReverse Transcription System, Promega, USA), 20 μL反應體系中加入3 μg處理后的總RNA, 反轉錄產物用TE buffer稀釋10倍后, 于–20℃保存, 備用。

1.4 青蟹凝集素基因全長cDNA的克隆

從擬穴青蟹肝胰腺cDNA文庫中, 通過blastx 篩選到3條與南美白對蝦Lv-lectin 2(HQ153048.1)基因高度同源的EST序列, 另一條與中國對蝦Fc-lectin3 (EU834292.1)高度同源性。根據 上述EST序列, 設計特異性引物(Primer Premier 6.0 軟件), 通過RACE (SMARTerTMRACE cDNA Amplification kit, Clonetech)擴增和巢式PCR獲得青蟹凝集素(Lectin簡稱Sp-lectin) cDNA的3′和5′末端序列。具體方法如下, 第一輪PCR反應體系: 總體積 25 μL, cDNA模板 0.5 μL,DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.25 μL, 2 ×TMReaction Mix (Tiangen biotech, China) 12.5 μL, 特異性引物(lectin3-GSPF1, lectin3-GSPR1, lectin4-GSPF1或lectin4-GSPR1, 10 μmol/L,表1) 1 μL, Universal Primer A Mix (UPM, Clonetech, USA, 表1) 1 μL , 超純水9.75 μL, 總體積為25 μL。第二輪PCR反應: 第一輪PCR反應產物1 μL,DNA 聚合酶 (2.5 U/μL) 0.5 μL, 2×TMReaction Mix (DS, China) 25 μL, 特異性引物(lectin3-GSPF2, lectin3-GSPR2, lectin4-GSPF2或lectin4-GSPR2, 10 μmol/L, 表1) 1.6 μL, Nested Primer (NUPM, Clonetech, USA, 表1) 1.6 μL, 超純水20.3 μL。第一輪PCR反應參數: 94℃ 3min; 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 1min, 35個循環; 72℃ 10min。第二輪PCR參數: 94℃ 3min; 94℃ 30s, 64℃ 30s, 72℃ 1min 共38個循環; 72℃ 10min。

拼接5′RACE和3′RACE序列后, 再設計兩對引物以驗證全長cDNA序列。PCR反應體系: cDNA模板0.5 μL,DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.25 μL, 2 ×TMReaction Mix (Tiangen biotech, China) 12.5 μL, 正反向引物(lectin3-gF和lectin3-gR或lectin4-gF和lectin4-gR,10 μmol/L)各1 μL, 超純水9.75 μL, 總體積 25 μL。PCR反應參數: 94℃ 3min, 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 1min, 共38個循環; 72℃ 10min。

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測及純化, 回收(E.Z.N.A?Gel Extraction Kit,OMEGA, USA), 連接pMD19-T vector (TaKaRa, Japan), 轉化大腸桿菌DH5α及陽性克隆(M13引物, 表1)鑒定, 送測序(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.5 青蟹凝集素基因組序列克隆

根據已獲得的全長cDNA 序列, 設計特異性引物(表1)分別擴增兩個凝集素基因開放閱讀框的DNA序列。PCR 反應體系如下: 基因組 DNA模板1 μL, LADNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.5 μL, 10 × LA PCR Buffer II (Mg2+Plus) (TakaRa, Japan) 5 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 8 μL, 正向引物(10 μmol/L) (lectin3-gF和lectin3-gR或lectin4-gF1 和lectin4- gR1)各2 μL, 超純水31.5 μL, 總體積50 μL。PCR反應參數: 94℃ 1min, 98℃ 10s, 66℃ 10min (Sp-lectin3)或58℃ 15min(Sp-lectin4), 共30個循環; 72℃ 10min。PCR產物鑒定及測序如1.4。

1.6 定量PCR檢測

利用Lightcycler 480 SYBR Green I 試劑盒 (Roche, Germany) 在 LightCycler 480 II實時PCR儀 (Roche, Germany)上進行分析。以-actin為內參比基因。反應總體積20 μL, 稀釋的cDNA模板3 μL, 正反向引物 10 μmol/L各0.8 μL, 2× Light Cycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche) 10 μL, PCR-Grade water 5.4 μL。PCR反應參數: 95℃變性 10min, 95℃ 20s, 63℃ 20s, 72℃ 25s, 熒光采集溫度為81℃ 5s, 共40個循環, 并繪制產物的熔解曲線以驗證擴增產物的特異性。同時, 采用系列已知拷貝數的質粒樣品進行擴增, 以獲得標準曲線及擴增效率。數據處理: 以的表達量為基準, 對樣品進行標準化處理。不同組織/器官和不同發育期的基因表達水平以經標準化樣品中靶基因的絕對表達量的1000倍表示。在弧菌人工感染時, 靶基因的表達量倍數變化是以同一時間點對照組為參比。

1.7 生物信息學分析

BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列基礎分析, ORF Finder軟件(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf) 分析開放閱讀框, SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信號肽及酶解位點, PROSITE (http://us.expasy.org/ tools/scanprosite)蛋白質的功能域分析。CLUSTALW 1.8軟件進行序列多重比對。

1.8 數據統計分析

利用單因素變量方差分析法(ANOVA)分析各個樣品之間凝集素的表達量差異, 同時利用 Dunnett-Test (2-sided)進行多重比對。所有數據用平均值±標準誤差(SE)的方式表示,<0.05表示差異顯著,<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 Sp-lectin3與Sp-lectin4的cDNA序列分析

以擬穴青蟹肝胰腺的cDNA文庫中篩選到Lectin同源性EST序列為基礎, 通過RACE和PCR方法克隆獲得2條擬穴青蟹凝集素的全長cDNA序列, 命名為Sp-lectin3和Sp-lectin4, GenBank登錄號分別為AFU52948和KJ631743。Sp-lectin3 cDNA全長858 bp, 其中5′ UTR 為53 bp, 開放閱讀框483 bp編碼160肽, 3′ UTR為322 bp, 并有保守的終止信號(AATAAA)及polyA序列。推導蛋白質分子量為17.94 kD, pI 4.71, 其中帶負電荷氨基酸殘基(D和E)18個, 帶正電荷氨基酸殘基(R和K) 7個, 不穩定指數32.29, 為穩定蛋白質; Sp-lectin4 cDNA序列全長598 bp, 其中5′ UTR為32 bp, 開放閱讀框480 bp 編碼159肽, 3′ UTR 86 bp, 無終止信號, 具有保守polyA序列。推導的蛋白質分子量為17.89 kD, pI 5.12, 其中帶負電荷氨基酸殘基19個, 帶正電荷氨基酸殘基13個, 不穩定指數為37.08, 也屬于穩定蛋白質。SignalP分析結果顯示, 凝集素Sp-lectin3和Sp-lectin4前體蛋白質均含有一個包含19氨基酸殘基的信號肽。PROSITE軟件分析顯示: Sp-lectin3與Sp-lectin4均屬于C-型凝集素中II型糖蛋白。Sp-lectin3的CRD結構域(Carbohydrate recognition domain) 為134肽, 其中半胱氨酸殘基8個, 預測可能是C23與C39、C56與C156間形成二硫鍵, 然而, 并不存在典型的EPN、QPD或WND糖識別特征性基序; 而Sp-lectin4的CRD域為133肽, 半胱氨酸殘基僅4個, 預測可能是C24與C36、C53與C155間形成二硫鍵。與Sp-lectin3不同, Sp-lectin4中存在一個結合半乳糖及其衍生物的特征性基序QPD。

表1 引物列表

將Sp-lectin3和Sp-lectin4與NCBI數據庫的部分蝦蟹類C-型凝集素氨基酸序列進行多重比對, 發現Sp-lectin3與凡納濱對蝦凝集素2(Lv-lectin2)同源性最高達43.9%, 而Sp-lectin4與中華絨螯蟹EsLecA同源性最高達57.2%; 將數據庫登錄的5條擬穴青蟹C-型凝集素蛋白序列多重比對發現: 同源性最高的是SP-lectin1和Sp-lectin2為60.1%, 其余各凝集素間的同源性均較低, 小于30%。

2.2 Sp-lectin3與Sp-lectin4的基因組結構分析

根據SP-lectin3與SP-lectin4全長cDNA序列, 設計引物(lectin3-gF與lectin3-gR, lectin4-gF1與lectin4-gR1, 表1), 獲得Sp-lectin3與Sp-lectin4包含開放閱讀框的基因組序列, 其GenBank登錄號分別為KJ631745和KJ631744。Spidey (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/spidey/)分析結果顯示: Sp-lectin3開放閱讀框由5個外顯子(34、27、186、55和181 bp)共同編碼, 其間被4個內含子(984、977、923和453 bp)所分隔, 其中信號肽由外顯子1和2共同編碼, CRD域由后3個外顯子共同編碼; 與Sp-lectin3不同, Sp-lectin4不僅開放閱讀框編碼的外顯子少, 為4個外顯子(64、73、122和221 bp), 而且外顯子間隔的3個內含子(129、200、251 bp)也均明顯短于Sp-lectin3, 其中信號肽僅由外顯子1編碼, 而CRD域由后3個外顯子共同編碼。兩個基因的內含子剪切均遵從GT-AG規則(圖1)。

內含子用線條表示, 大小顯示于線條下方; 外顯子用方框表示, 大小顯示于方框上方

Introns and exons are shown as lines and boxes respectively. The numbers show the size of individual intron (under line) and exon (above box)

2.3 Sp-lectin3與Sp-lectin4的表達譜

為了闡釋Sp-lectin3和Sp-lectin4的功能, 本研究用Real-time RT-PCR檢測該兩個基因在正常養殖的擬穴青蟹不同組織/器官中的表達情況, 結果顯示: 該兩個基因在所檢測8只青蟹的11個不同組織/器官中均有不同程度的表達(圖2), 而且在肝胰腺中表達量最高, 極顯著高于其他組織(<0.01), 表達量最低的是血細胞和心臟; Sp-lectin3表達量僅次于肝胰臟的是射精管和儲精囊, 而Sp-lectin4卻是腸(圖2); 在絕大多數組織/器官中, Sp-lectin4的表達量均高于Sp-lectin3, 但是在腦和儲精囊中Sp-lectin3表達量卻極顯著高于Sp-lectin4(<0.01)(圖2)。

為了探討該兩個基因在青蟹幼體發育過程中的作用, 本研究檢測其在囊胚期、原腸期、眼點期、色素沉積期、溞狀幼體期、大眼幼體I期、大眼幼體II期以及幼蟹等不同發育階段中的表達情況, 結果顯示: 除Sp-lectin4在囊胚期表達量極低外, 該兩個基因在所檢測發育期內均有不同程度的表達(圖3)。隨著胚胎的發育, Sp-lectin3 和Sp-lectin4表達量逐漸升高, 到溞狀期幼體表達量最高, 分別是囊胚期表達量的836倍和1948倍, 極顯著高于之前的所有發育階段(0.01); 有趣的是, 大眼期幼體(M1和M2)該兩個基因的表達量均極顯著低于溞狀期幼體和仔蟹 (<0.01), Sp-lectin3的表達量僅為溞狀期的8.2%和1.4%, Sp-lectin4的表達量也僅為溞狀期幼體的9.5%和19.5%; 到幼蟹階段, 該兩基因的表達量又恢復到約為其溞狀期幼體的一半(圖3)。此外, 在胚胎發育階段除囊胚期外, Sp-lectin4表達量極顯著高于Sp-lectin3(<0.01), 相反, 在胚后發育階段除大眼幼體II期外, Sp-lectin3表達量卻極顯著高于Sp-lectin4(<0.01)。

2.4 弧菌人工感染對Sp-lectin3與Sp-lectin4基因表達的調控

Sp-lectin3與Sp-lectin4在正常養殖擬穴青蟹的肝胰腺中表達量最高, 在生殖系統中表達量也較高, 為了探討Sp-lectin3與Sp-lectin4是否參與青蟹抗細菌感染的免疫反應, 本研究采用副溶血弧菌進行人工感染青蟹, 用Real-time RT-PCR檢測了細菌對該兩個凝集素基因的調節作用。結果顯示, 與對照組相比, 副溶血弧菌人工感染后6h、12h、18h和24h, 在肝胰腺中該兩個基因的表達量雖然均有不同程度的上調, 但是, 只有Sp-lectin4在感染后12h和18h的表達量顯著增加 (<0.05)。而在生殖系統中, 副溶血弧菌感染只能誘導Sp-lectin3在儲精囊和射精管中的表達量, 并分別于感染后12h和6h顯著上調(<0.05)(圖4)。

3 討論

3.1 Sp-lectin3和Sp-lectin4是青蟹C-型凝集素家族的兩個新成員

Sp-lectin3和Sp-lectin4分子結構特征不同于其他凝集素。脊椎動物的典型C-型凝集素是鈣離子依賴性, 含有一至多個高度保守的CRD結構域, 每個結構域包含4個鈣離子結合位點, 其中糖識別特征基序為EPN或QPD, 位于鈣離子結合位點2。而無脊椎動物的CRD結構域中的糖識別基序更加復雜多樣化, 其中EPN往往由EPD、EPK、EPS或EPQ取代, QPD由QPG、QPS、QPN、QPT或YPT取代[3]。

數據以平均值±標準誤差表示 (= 8)。Hp. 肝胰腺; ED. 射精管; SV. 儲精囊; B. 腦; Hc. 血細胞; G. 鰓; I. 腸; T. 精巢; S. 胃; H. 心; M. 肉。Sp-lectin3和Sp-lectin4表達量的比值也列在表中, 同一組織內兩個基因的表達量經-檢驗后, *表示顯著性差異<0.05, 極顯著性差異:表示0.01, ***表示<0.001

Data are shown as mean±SE of eight crabs. Hp. Hepatopancreas; ED. Ejaculatory Duct; SV. Seminal vesicle; B. Brain; Hc. hemocyte; G. Gill; I. intestine; T. Testis; S. stomach; H. heart; M. Muscle. Expression ratios between Sp-lectin3 and Sp-lectin4 are also shown (below). *<0.050.01 and ***<0.001bytest

數據以平均值±標準誤差表示 (= 3)。B. 囊胚期; G. 原腸期; E. 眼點期; P. 色素沉積期; Z. 溞狀幼體期; M1. 大眼幼體I期; M2. 大眼幼體II期; C. 幼蟹。Sp-lectin3和Sp-lectin4表達量的比值也列在表中, 同一發育期兩個基因的表達量經-檢驗后, *表示顯著性差異0.05, 極顯著性差異:表示0.01, ***表示0.001

Data are shown as mean±SE (=3). B. blastula; G. gastrula; E. eye placode; P. pigment; Z. zoea; M1. megalopa-?; M2. megalopa-Ⅱ; C. crablet. Expression ratios between Sp-lectin3 and Sp-lectin4 are also shown (bellow). *<0.05,0.01 and ***<0.001,by-test

A. 肝胰腺; B. 儲精囊; C. 射精管; 結果用平均值±標準誤差表示(=4); *表示顯著性差異,<0.05

A. hepatopancreas; B. seminal vesicle; C. ejaculatory duct. Data are shown as mean±SE from four crabs.-Values generated by t-tests between stimulated and time-matchedcontrol samples are shown above the bars. *<0.05

在本研究中, Sp-lectin3的CRD結構域中未發現糖識別的特征性基序QPD、EPN或其替代物, 該結果與已報道擬穴青蟹Sp-lectin1和Sp-lectin2、三疣梭子蟹PtLP以及中華絨螯蟹EsLcG結構相近[2, 28, 30]; 而Sp-lectin4的CRD結構域中存在半乳糖結合的QPD基序, 與擬穴青蟹SpMBP(GenBank數據庫)以及中華絨螯蟹EsLecA和EsLecD序列相似[2, 17]。此外, 氨基酸序列多重比對發現, Sp-lectin3與凡納濱對蝦Lv-lectin2同源性最高, 達43.9%, Sp-lectin4卻與中華絨螯蟹EsLecA同源性最高, 達57.2%; 而Sp-lectin3和Sp-lectin4, 以及它們與數據庫中的鋸緣青蟹的其他凝集素的同源性均低于30%。

基因組結構不同。Sp-lectin3開放閱讀框由5個外顯子共同編碼, 其基因組結構與中國明對蝦的凝集素(FcCTL)一致[19]; Sp-lectin4與斑節對蝦PmAV[31]的基因組結構一致, 均含有4個外顯子和3個內含子。由于甲殼動物的其他C-型凝集素的基因組結構數據缺乏, 所以難以較全面理解甲殼動物的C-型凝集素基因組結構特征及其多樣性來源。

Sp-lectin3和Sp-lectin4表達譜不同。目前已報道的擬穴青蟹4條C-型凝集素(Sp-lectin 1—4, Sp- lectin5未見研究報道)基因其在自然養殖過程中的組織分布各不同。雖然所有4個基因在肝胰腺中表達量最高, 但是, Sp-lectin1和Sp-lectin2其表達量僅次于肝胰腺的都是血細胞[28], 而本研究Sp-lectin3和Sp-lectin4分別是生殖腺和腸, 而在血細胞中的表達量極低。因此, Sp-lectin3和Sp-lectin4為青蟹C-型凝集素家族新成員, 推測其與Sp-lectin1和Sp-lectin2功能不同, 或在不同的組織器官中發揮其相應的生物學功能。

3.2 Sp-lectin3和Sp-lectin4維護胚胎及幼體發育中起重要作用

研究發現, 受精卵進入雄性海馬育兒袋后, 雄性海馬釋放C-型凝集素到育兒袋中, 該囊包圍住胚胎, 從而抑制細菌生長, 并促進海馬胚胎發育[32]。Jiang等[28]研究了Sp-lectin1和Sp-lectin2在溞狀幼體不同時期(Z1、Z2、Z3、Z4和Z5)表達的情況, 發現Sp-lectin1在Z2期表達量最高, Sp-lectin2在Z1期表達量最高, Sp-lectin1和Sp-lectin2均在Z3期表達量最低; 此外, 低濃度(2.3×104cfu/mL)弧菌人工感染無法刺激大眼期幼體Sp-lectin1和Sp-lectin2的變化, 中濃度(2.3×106cfu/mL)弧菌人工感染上調大眼幼體中Sp-lectin1和Sp-lectin2表達水平, 并分別在24h和48h達到最高峰, 72h恢復正常水平, 96h再次上調; 高濃度(2.3×107cfu/mL)弧菌人工感染導致幼體死亡, 說明Sp-lectin1和Sp-lectin2可能參與大眼幼體期的抗弧菌感染免疫作用。本研究除Sp-lectin4在囊胚期表達量極低外, 發現Sp-lectin3和Sp-lectin4在胚胎及胚后幼體發育過程中均可檢測到, 推測該兩個基因可能參與維護擬穴青蟹的胚胎及胚后正常發育。此外, 在青蟹不同發育階段, 該兩個基因的表達量顯著, 即在成體的絕大多數組織/器官及胚胎發育(從原腸期到色素沉積期)階段, Sp-lectin4基因的表達量明顯高于Sp-lectin3, 推測在該階段Sp-lectin4發揮比Sp-lectin3更重要的作用。而在胚后發育階段(溞狀幼體、大眼幼體和仔蟹)則相反, Sp-lectin3可能發揮更重要的生理作用。此外, 研究還發現從溞狀幼體轉變為大眼幼體時, 該兩個基因的表達量極顯著下降(<0.01), 其中Sp-lectin3表達量僅分別為溞狀期幼體的8.2%和1.4%, Sp-lectin4表達量也僅為溞狀期幼體的9.5%和19.5%。到幼蟹時, 表達水平又恢復到接近溞狀期的一半左右(圖 5)。有趣的是, 該兩個基因的表達規律與青蟹人工育苗中幼體的畸形或死亡規律較好契合。如Shigeki和Hamasaki[33]以及Hamasaki等[34]報道從剛孵化的溞狀幼體Ⅰ期變態發育到仔蟹, 其總存活率極低, 僅約2.5% ()和10% (), 主要原因是該階段的細菌和真菌等疾病頻發。易受細菌和真菌感染與引發的高死亡率是否與Sp-lectin3和Sp-lectin4基因的表達量的低下相關, 換言之, 可能在大眼幼體抵抗病原感染中起關鍵性作用, 有待進一步研究。

3.3 Sp-lectin3和Sp-lectin4在不同組織/器官中發揮抗弧菌的免疫應答作用

蝦蟹類C-型凝集素對不同病原體及其類似物刺激產生不同的響應。中國明對蝦Fc-lec2, 鰻弧菌刺激2h后, 其在肝胰腺中顯著上調表達[13]; 凡納濱對蝦Lvlec1, 滅活溶壁微球菌刺激后12h, 其在肝胰腺中表達量也顯著上調[29]; 中華絨螯蟹EsLecA, 在LPS刺激后2h、8h、12h和24h, 其在鰓中表達顯著上調, 而在刺激后4h、8h、12h和24h, 其在肝胰腺表達卻顯著下調; 同時, 對于EslecG, 在LPS刺激后2h、4h、8h和12h, 其在鰓的表達顯著上調, 在肝胰腺中2h和8h顯著上調, 而在4h、12h和24h顯著下調[2]。在本研究中, 副溶血弧菌人工感染后, Sp-lectin3在肝胰腺中表達量無顯著性變化(>0.05), 而Sp-lectin4在12h和18h顯著上調(<0.05), 此外, 在肝胰臟中Sp-lectin4的表達量明顯高于Sp-lectin3, 因此, 推測在肝胰腺的抗細菌感染免疫應答中, Sp-lectin4發揮著更重要的作用; 而在生殖系統則相反, 弧菌感染可誘導Sp-lectin3在儲精囊和射精管中的表達, 并分別于人工感染后12h和6h顯著上調 (<0.05), 而細菌感染沒有顯著改變Sp-lectin4在生殖系統中的表達量, 此外, 在正常養殖青蟹的儲精囊中Sp-lectin3表達量極顯著高于Sp-lectin4 (0.01), 射精管中兩者表達量無顯著性差異(>0.05), 因此, 推測在生殖系統抗細菌感染的免疫反應中, Sp-lectin3發揮更重要作用。

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MOLECULAR CLONING, CHARACTERIZATION AND EXPRESSION OF TWO NOVEL LECTINS IN MUD CRAB,

DUAN Li-Peng1, 2, HUANG Bei1, 2, ZHOU Li-Hong1, 2, LIANG Ying1, 2, NIE Pin1and HUANG Wen-Shu1, 2

(1.Fishery College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry, Ministry of Education PRC, Xiamen 361021, China)

C-type lectins are a group of carbohydrate binding proteins which contain one or more Ca2+dependent carbohydrate recognition domains (CRDs). They have been regarded as one of the most important pattern recognition receptors in invertebrates. In this study, we cloned two novel C-type lectins, namely Sp-lectin3 and Sp-lectin4, from the hepatopancreas of. The predicted amino acid sequences of Sp-lectin3 and Sp-lectin4 possessed several conserved properties of C-type lectins, such as a signal peptide, a single CRD, and a QPD motif (only in Sp-lectin4). The open reading frame of Sp-lectin3 consisted of 5 exons and 4 introns, while that of Sp-lectin4 was composed of 4 exons and 3 introns. In normal cultivated crabs expression of both genes could be detected in almost all the eleven tested tissues and organs, such as hepatopancreas, intestine, gill, haemocytes, and different parts of the reproductive duct. The expression of Sp-lectin3 was highest in hepatopancreas and second highest in ejaculatory ducts; for Sp-lectin4 the highest expression was observed also in hepatopancreas and then in the intestine. We further investigated the expression of Sp-lectin3 and Sp-lectin4 at different developmental stages. The results showed that the expression of both genes increased gradually and reached a peak at the embryonic stage of zoea, then declined sharply at the stage of megalopa, and finally recovered at the stage of crablet. When artificially infected with, the expression of Sp-lectin3 in ejaculatory ducts was significantly up-regulated at 6h after the infection, and the expression in seminal vesicles was boosted at 12h post infection (<0.05). For Sp-lectin4, the expression was significantly elevated only in hepatopancreas both at 12h and 18h post infection (<0.05). Our results suggested that the two C-type lectins might be involved in the immune response to bacterial infection in. Sp-lectin3 could mainly function in the reproductive system such as the ejaculatory duct and seminal vesicles, while Sp-lectin4 may mainly function in hepatopancreas.

; C-type lectin; Embryo development;

10.7541/2015.43

S945.6

A

1000-3207(2015)02-0321-10

2014-03-21;

2014-06-07

國家自然科學基金(31172438和30700625); 福建省自然科學基金(2012J06008)資助

段利朋(1988—), 女, 河南新密人; 碩士研究生; 研究方向為水產動物病害防治。E-mail: 906582461@qq.com

黃文樹, 男, 副教授; Tel: 0592-6181597; E-mail: wshuang@jmu.edu.cn