己烯雌酚抑制斑馬魚精子發生及其可能的分子機制

譚 號 李英文 尹 盼 劉智皓

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己烯雌酚抑制斑馬魚精子發生及其可能的分子機制

譚 號 李英文 尹 盼 劉智皓

(重慶師范大學生命科學學院, 重慶市高校生物活性物質工程研究中心, 重慶市高校動物生物學重點實驗室, 重慶 401331)

為研究內分泌干擾物己烯雌酚(DES)對魚類精巢發育和配子發生的影響, 研究用DES(0.1、1和10 μg/L, 暴露20d)對內分泌干擾研究的經典模式動物——斑馬魚()雄性成魚進行了處理。組織學研究結果表明, DES嚴重影響斑馬魚精子發生。同時, 研究克隆了斑馬魚與生殖細胞發育和減數分裂相關的、1的部分cDNA, 對其組織和細胞表達模式進行了研究。結果表明,僅表達于精巢的精原細胞、初級精母細胞和卵巢不同時期的生殖細胞; 而1則表達于精巢精母細胞和卵巢卵母細胞發育早期。半定量PCR結果表明, DES處理后的表達沒有明顯變化; 而1的表達則被明顯抑制, 且呈時間依賴性和劑量依賴性效應; 而轉錄因子1和雄激素合成關鍵酶基因450 11的表達也被顯著抑制。因此本研究推測, DES可能通過抑制1和450 11的表達誘導了斑馬魚生殖細胞凋亡; 并通過抑制1的表達阻礙了減數分裂。

己烯雌酚; 斑馬魚; 生殖細胞丟失; 精子發生; 減數分裂

內分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指可干擾動物體內保持自身平衡、調節發育過程的內源激素的合成、分泌、運輸、結合和代謝等過程的外源性化學物質[1]。EDCs廣泛存在于環境中, 主要以環境雌激素為主, 部分EDCs能通過生物富集[2], 嚴重損害雌雄性動物的性腺發育和配子發生, 引起動物產生明顯的雌、雄性化效應[3—5]。由于大多數EDCs最終匯聚于水中, 對終身生活在水中的魚類其生殖、神經和免疫等系統的功能影響極大, 能導致其生殖能力低下、配子數量減少、性腺變小, 甚至發生性反轉[ 6—8]。

據調查, 2012年在我國主要的六大江系中均不同程度存在EDCs的污染[9], 且持續惡化[10]。其中, 己烯雌酚(DES, Diethylstilbestrol), 一種醫用人工合成雌激素, 是長江水系典型的EDCs之一, 主要分布在長江中下游, 濃度高達2.07—2.52 ng/L[10]。哺乳類的研究發現, DES可導致倉鼠()和大鼠()精巢發育障礙、生殖細胞凋亡[11—13]。然而, DES對魚類精巢發育和精子發生影響的研究較少, 大多研究集中在對胚胎的影響14]。

本研究用DES(0.1、1和10 μg/L)對內分泌干擾研究的經典模式動物——斑馬魚(rerio)雄性成魚進行了20d處理, 通過組織學的方法研究了DES對斑馬魚精巢發育和精子發生的影響。同時, 為深入研究其可能的分子機理, 本研究采用RT-PCR的方法, 在斑馬魚克隆了與生殖細胞和減數分裂密切相關的標記基因和1的部分cDNA, 并通過RT-PCR和原位雜交的方法, 研究了上述基因的組織、細胞表達模式及DES對上述基因表達的影響。另外, 本研究還檢測了DES對雄性性別決定基因1和魚類雄激素合成關鍵酶基因450 11表達的影響, 以期探討DES影響斑馬魚精子發生可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

DES, 購自美國Sigma公司; 總RNA提取試劑盒(Trizol), 購于Invitrogen公司; 逆轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit), 型號: RR047A, 購于日本TaKaRa公司。其余試劑為國產分析純。DM2700 M光學顯微鏡, 德國徠卡公司; PCR儀, 型號: My cycler, 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗材料

實驗用斑馬魚雄性成魚(AB系4月齡)為研究組自行繁殖獲得, 平均體重(0.42±0.04) g, 處理前用曝氣除氯后的自來水暫養于的恒溫循環水養殖系統中。

1.3 實驗設計

設置3個實驗劑量組(0.1、1和10 μg/L, 0.05‰ DMSO作為助溶劑), 對照組為0.05‰ DMSO。處理實驗在30 L的玻璃缸中進行, 每缸隨機放入實驗魚50尾; 每天喂食3次, 持續增氧, 每天換水1次, 處理20d。水體溫度控制在(28 ± 1)℃, 光照周期為14h︰10h (光暗比)。在處理后3、6、12和20d, 每組各解剖3尾魚的精巢, 液氮速凍后, 于–80℃備用。處理后20d, 每組各取3尾魚精巢, 波恩氏液固定、包埋, 常規石蠟切片。上述實驗共重復3次。

1.4 組織學研究

將斑馬魚置于冰面上, 麻醉后解剖出斑馬魚精巢, 于波恩氏液固定24h。將材料依次放入梯度乙醇和二甲苯中脫水、透明, 并在60℃包埋。隨后進行常規組織學切片(厚度5 μm)和蘇木精/伊紅(HE)染色, 中性樹膠封片后拍照。

1.5 斑馬魚和1部分cDNA的克隆

解剖斑馬魚雌雄性腺, 用Trizol(Invitrogen)提取總RNA。測定濃度后, 取1 μg總RNA按照Prime-- Script RT reagent Kit (TaKaRa)說明書合成第一鏈cDNA。

根據GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上公布的斑馬魚(BC129275)1(NM_001020782) mRNA序列, 設計基因特異性引物, 并利用已合成的第一鏈cDNA在PCR擴增儀(Bio-Rad IQ5)上擴增部分序列。其擴增條件為: 為94℃ 3min, 35個循環的94℃ 30s, 53℃ 30s, 72℃ 30s, 后延伸7min。擴增片段在1% 的瓊脂糖凝膠上電泳, 溴化乙錠(EB)染色后, 在凝膠成像系統上分析。目的片段用膠回收試劑盒(Geneview)純化后亞克隆入pMD19-T載體(TaKaRa), 挑選陽性菌落, 提取質粒, 測序。本實驗所用引物見表1。

表1 引物序列

1.6 斑馬魚和1mRNA在各組織中的分布

解剖斑馬魚雌雄各組織(T. 精巢、O. 卵巢、B. 腦、L. 肝臟、I. 腸、K. 腎臟、H. 心臟、M. 肌肉、Sp. 脾臟), 提取總RNA, 按照PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa)說明書合成第一鏈cDNA。用和1基因特異性引物研究其在斑馬魚各組織中的表達模式, 并以1作為內參, 以質粒和蒸餾水為模板擴增的產物分別作為陽性和陰性對照。其擴增條件為: 為94℃ 3min, 28個循環的94℃ 30s, 53℃ 30s, 72℃ 30s, 后延伸7min。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳, EB染色后在凝膠成像系統上進行拍照、分析。

1.7 斑馬魚和1 mRNA在細胞中的表達

斑馬魚和1的反義鏈和正義鏈(陰性對照)cRNA探針利用線性化的質粒, 參照地高辛標記試劑盒(Roche, Germany)說明書進行體外轉錄。

解剖出斑馬魚成魚雌雄性腺, 在4% PFA中, 4℃固定16h。隨后在乙醇(DEPC)和二甲苯中脫水、透明, 并在60℃包埋。石蠟組織切片經常規二甲苯脫蠟、梯度酒精復水和0.85×PBS潤洗后, 用蛋白酶K于37℃消化12min, 隨后經4% PFA重新固定和0.25%乙酰酐溶液乙?；? 切片在66%去離子甲酰胺/2×SSC預雜交液中60℃預雜交1h, 隨后分別加入地高辛標記的和1探針, 于60℃雜交16h。雜交后經SSC緩沖液洗滌, BufferⅠ (0.1 mol/L馬來酸, 0.15 mol/L NaCl, pH7.5)洗滌5min, 封閉劑Buffer Ⅱ(BufferⅠ中含1%BSA)室溫封閉30min, 加入1︰2000稀釋的堿性磷酸酶標記的anti-DIG-AP抗體(Roche), 室溫孵育30min, Buffer I洗滌3×15min, 并用NBT和BCIP顯色, 封片、拍照。

1.8 DES對斑馬魚1、1和450 11mRNA的表達量的影響

取–80℃備用的斑馬魚精巢, 提取總RNA, 合成cDNA, 用半定量RT-PCR (Semi-quantitative RT-PCR)方法檢測斑馬魚1、1 (AF439562)和450 11(NM_001080204)mRNA的表達變化, 并以1作為內參, 所用引物參考表1。其擴增條件為和1: 94℃ 3min, 28個循環的94℃ 30s, 53℃ 30s, 72℃ 30s, 后延伸7min;1和450 11: 94℃ 3min, 28個循環的94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s, 后延伸7min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳, EB染色后, 用凝膠成像系統成像, 并用Quantity One(Bio-Rad)進行光密度分析。數據用9個平行樣的平均值±標準誤(Means±SE)表示。結果用SPSS1310軟件(SPSS, Chicago, IL, USA)進行方差分析和差異比較,<0.05, 差異顯著。柱形圖用GraphPad Prism 5(GraphPad Software, San Diego, CA)進行繪制。

2 結果

2.1 DES對斑馬魚精巢影響的組織學觀察

研究結果表明, 對照組斑馬魚精巢生精小管數量眾多, 內有不同發育時期的生精小囊, 囊內的生殖細胞處于同一發育時期, 而相鄰小囊內的生殖細胞處于不同發育階段(圖1A)。不同的是, 所有劑量的DES均對斑馬魚精巢發育和精子發生造成不同程度影響。在低劑量組精巢中, 體細胞增生, 細胞膨大(圖1B); 在中劑量組精巢中, 處于精細胞時期的生精小囊數目減少, 單倍體生殖細胞(尤其是精子細胞)大量丟失, 出現生殖細胞丟失后產生的空腔(圖1C); 而在高劑量組精巢中, 單倍體生殖細胞大部分或全部丟失, 空腔化嚴重, 精母細胞數量也有所減少(圖1D)。

A. 對照組; B-D. DES處理組(0.1、1和10 μg/L); Sg. 精原細胞; PS. 初級精母細胞; SS. 次級精母細胞; SC. 支持細胞; St. 精子細胞; Sz. 精子; *. 生殖細胞丟失形成的空腔; 標尺: 50 μm

A. Control; B-D. DES (0.1, 1 and 10 μg/L). Sg. Spermatogonium; PS. Primary Spermatocyte; SS. Secondary Spermatocyte; SC. Sertoli cell; St. Spermatid; Sz. Spermatozoa; asterisk. cavity resulting from germ cell loss. Scale bar: 50 μm

2.2 斑馬魚和1組織表達模式的研究

組織表達模式研究表明,和1僅在斑馬魚性腺(精巢和卵巢)中表達, 不在其他非性腺組織中表達。其中,在精巢和卵巢中的表達水平相當,1在精巢中的表達略高于卵巢(圖2)。

2.3 斑馬魚和1細胞表達模式的研究

原位雜交結果表明,和1僅表達于斑馬魚性腺生殖細胞中。在精巢中,僅在精原細胞和初級精母細胞中表達(圖3A); 而1則表達于初級和次級精母細胞(圖3C); 在卵巢中,在所有時期生殖細胞都有表達, 主要表達于卵母細胞發育早期, 發育后期卵母細胞表達豐度較低(圖3B); 而1則僅表達于卵母細胞發育早期, 而在初級生長卵母細胞中沒有表達(圖3D)。

T. 精巢、O. 卵巢、B. 腦、L. 肝臟、I. 腸、K. 腎臟、H. 心臟、M. 肌肉、Sp. 脾臟、NC. 陰性對照、PC. 陽性對照、1為內參

T, testis; O, ovary; B, brain; L, liver; I, intestines; K, kidney; H, heart; M, muscle; Sp, spleen; NC, negative control; PC, positivecontrol;1, internal control

Testis. 精巢; Ovary. 卵巢; Sg. 精原細胞; PS. 初級精母細胞; SS. 次級精母細胞; PG. 初級生長卵母細胞; PV. 卵黃發育前期; EV. 卵黃發育早期; MV. 卵黃發育中期; 黑色箭頭, 陽性信號; 黑色三角形: 陰性信號; 插圖: 陰性對照

Sg. Spermatogonium; PS. Primary Spermatocyte; SS. Secondary Spermatocyte; PG. primary growth stage; PV. previtellogenic stage; EV. early vitellogenic stage; MV. midvitellogenic stage; Arrow. positive signal; arrowhead. negative signal; Inset. negative control

2.4 DES處理對斑馬魚中1、1和450 11mRNA水平的影響

半定量RT-PCR結果顯示, 不同劑量的DES對斑馬魚精巢中的表達影響較小。尤其是在各取材時間點,的表達在各組間沒有顯著差異(圖4A)。不同的是, DES能顯著抑制斑馬魚精巢中1、1和450 11的表達。其中處理后6d,1的表達量開始下調, 且呈明顯的時間依賴性和劑量依賴性(圖4B); 處理后6d, DES(10 μg/L)顯著下調1的表達, 呈明顯的時間依賴性(圖4C); 而DES下調450 11的表達則在處理后20d (圖4D)。

大寫字母, 不同時間同組結果的顯著性差異(<0.05); 小寫字母, 相同時間不同組結果的顯著性差異(<0.05)。dat, 處理后天數。=9

Uppercase letters, significant difference in the same group of different time points (<0.05); lowercase letters, significant difference in the same time point of different groups (<0.05). dat, days after treatment.=9

3 討論

大量研究表明, EDCs能導致雄性動物生殖細胞發育障礙, 精子數量和精液量減少等問題[15—17]。作為低等脊椎動物的魚類, 由于其性腺發育和分化的可塑性, 對EDCs更為敏感。在分化早期暴露于EDCs則能產生間性甚至性反轉[18]; 而在性腺分化結束后暴露于EDCs中, 其可能造成性腺發育障礙, 配子發生異常[19—21]。作為典型的EDCs, DES也能造成相似的結果。青鳉()和銀鯽()的研究表明, 1 μg/L和10 μg/L劑量的DES能分別誘導其精巢發育障礙和生殖細胞數量減少[22, 23], 與本研究的結果極為相似。小鼠()和大鼠的研究發現, 雌二醇(E2, Estradiol)能誘導其精母細胞和精子細胞發生凋亡[24—26]。另外, 1 μg/L和10 μg/L乙炔基雌二醇(EE2, 17α-Ethiny-lestradiol)也能誘導青鳉精巢中生殖細胞凋亡[21]。由于DES的生理效應與E2和EE2極為相似, 其暴露后的斑馬魚精巢也產生了與青鳉極為相似的生理學變化, 因而推測DES誘導了斑馬魚精巢中生殖細胞發生凋亡。

為什么DES能誘導雄性斑馬魚生殖細胞凋亡呢？眾所周知, 轉錄因子dmrt1對魚類精子發生起重要作用[27]。尼羅羅非魚()的研究發現, dmrt1缺陷能導致精巢畸形, 精原細胞退化, 甚至出現生殖細胞完全丟失的現象[28]。而本研究結果發現, DES能顯著下調1的表達, 與在其他魚類中的相關研究結果相似[29, 30]。DES誘導的斑馬魚精巢中1表達的下調可能是生殖細胞凋亡的重要原因之一。同時, 作為硬骨魚類主要的雄激素, 11-KT對魚類的精子發生也起重要作用[31, 32], 主要由P450 11β合成[33]。而大量研究表明, 雌激素能明顯下調450 11的表達[34], 與本研究的結果完全相同。與上述結果相對應的是, DES暴露后的斑馬魚精子細胞大量丟失。因此推測, 環境雌激素DES可能通過抑制1和450 11的表達從而誘導了斑馬魚生殖細胞的凋亡。

由于僅表達于斑馬魚精原細胞和初級精母細胞(二倍體)中; 而DES對斑馬魚的表達量沒有顯著影響, 因此, 我們認為DES對二倍體生殖細胞沒有顯著影響, 這也與組織學研究結果一致。不同的是, 減數分裂標記基因1僅表達于減數分裂時期的生殖細胞——初級精母細胞(二倍體)和次級精母細胞(單倍體), 而不表達于精子細胞(單倍體)[35, 36]。與E2能顯著抑制1的表達相同[37], 本研究也發現DES能顯著抑制斑馬魚1的表達。由于1僅在減數分裂過程中表達, 是減數分裂中重組和聯會復合體的關鍵組分[38, 39],1 基因突變或敲除會導致小鼠生殖細胞的同源染色體正常聯會異常, 減數分裂停滯[40, 41]。因此本研究認為, DES暴露可能通過抑制1的表達, 顯著抑制了斑馬魚減數分裂過程, 阻礙了精子細胞的產生。

綜上所述, 在DES處理后, 斑馬魚精巢單倍體生殖細胞數量顯著減少, 其可能的原因有: (1)DES可能通過抑制1和450 11的表達, 誘導了斑馬魚精子細胞的凋亡; (2)DES可能通過抑制生殖細胞的減數分裂, 阻礙了新生精子細胞的產生。但關于DES如何通過抑制1450 11和1的表達, 從而阻礙斑馬魚精子發生, 其內在機制還有待于進一步深入研究。

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MECHANISMS UNDERLYING DIETHYLSTILBESTROL-INDUCED INHIBITION OF SPERMATOGENESIS IN ZEBRAFISH ()

TAN Hao, LI Ying-Wen, YIN Pan and LIU Zhi-Hao

(Chongqing Engineering Research Center of Bioactive Substances, Chongqing Key Laboratory of Animal Biology,College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

Diethylstilbestrol (DES) is a typical endocrine disruptor for aquatic animals in the Yangtze River of China. Here we investigated the effects of DES on testicular development and spermatogenesis of fish. Adult male zebrafish () were used as experimental subjects and were exposed to DES (0.1, 1 and 10 μg/L) for 20 days. The histological results demonstrated that the DES exposure led to severe impacts on zebrafish spermatogenesis. To further elucidate mechanisms underlying this phenomenon, we cloned the cDNAs ofand1 and analyzed their expression patterns at the tissue and cellular levels. Our results showed thatwas exclusively expressed in spermatogonia and primary spermatocytes of testis, and that1 was specifically expressed in spermatocytes of testis. Using semi-quantitative RT-PCR we found that DES dramatically suppressed the expressions of1 in a dose- and time-dependent manner, but did not affect the expression of. Moreover, the expression of1(the male sex determining gene) and450 11(the key enzyme responsible for 11-KT synthesis) were also suppressed by DES exposure. Given that these genes play a role in meiosis and spermatogenesis, we speculated that DES might induce the male germ cell apoptosis in zebrafish by suppressing the expression of1 and P450 11, and might inhibit the expression of1which result in impeded meiosis.

Diethylstilbestrol; Zebrafish; Germ cell loss; Spermatogenesis; Meiosis

10.7541/2015.44

Q492

A

1000-3207(2015)02-0331-08

2014-05-26;

2014-08-16

重慶市科委項目(cstc2012jjA20006); 重慶市教委項目(KJ130622); 重慶師范大學校級項目(13XLZ08、12 xlb005)資助

譚號(1989—), 男, 湖北利川人; 碩士研究生; 主要從事魚類生殖生理和分子內分泌研究。E-mail: hardytam@163.com

劉智皓; E-mail: minenut@163.com