我國草魚野生群體D-Loop序列遺傳變異分析

傅建軍 王榮泉 沈玉幫 宣云峰 徐曉雁 劉承初 李家樂

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我國草魚野生群體D-Loop序列遺傳變異分析

傅建軍1, 2王榮泉3沈玉幫1宣云峰3徐曉雁1劉承初2李家樂1

(1. 上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學食品科學與工程博士后流動站, 上海 201306; 3. 蘇州市吳江水產養殖有限公司, 農業部大宗淡水魚類繁育與健康養殖技術重點實驗室, 蘇州 215221)

利用線粒體DNA的D-Loop區序列, 對來自長江水系(邗江、吳江、九江、石首、木洞和萬州)、珠江水系(肇慶)和黑龍江水系(嫩江)的8個草魚野生群體開展了遺傳變異分析。在424尾魚中檢測到34個變異位點, 34個單倍型, 單倍型多樣性介于0.474—0.708。群體間Kimura雙參數遺傳距離介于0.0020—0.0049。長江下游3個群體間遺傳距離最近, 遺傳分化不顯著(>0.05); 肇慶群體與長江上游3個群體遺傳距離較近, 與九江群體遺傳分化不顯著(>0.05); 嫩江群體與長江上游2個群體遺傳距離較近, 與萬州群體遺傳分化不顯著(>0.05)。遺傳距離與地理距離存在極顯著正相關(=0.61,<0.01)。分子方差分析顯示, 不同流域間遺傳變異占總變異26.24%, 差異極顯著(<0.01)。34個單倍型分為2個分支, 分化極顯著(ST=0.644,<0.01), 推測分化時間為第四紀更新世紀晚期。

草魚; 野生群體; D-Loop序列; 遺傳變異

草魚()為我國土著魚類, 自然分布于長江、珠江及黑龍江水系等流域中[1]。草魚在我國具有悠久的養殖歷史, 其養殖產量在淡水魚類中位居世界第一[2]。近幾十年來, 由于受環境破壞及不當利用等原因[3], 草魚野生資源銳減并存在種質退化風險。當前, 開展良種培育是減少對草魚野生資源過度開發和破壞, 并實現草魚資源可持續利用的有效途徑。

分子標記作為魚類種質資源研究的有效手段[4], 可為制定合理的育種方案提供數據參考。其中, 線粒體DNA(mtDNA)變異可用于魚類親緣關系[5]、種屬分類[6]、遺傳分化[7]和遺傳多樣性[8]等研究。mtDNA標記被廣泛用于草魚群體遺傳研究中。李思發等[9]和張四明等[10]用mtDNA限制性片段長度多態性(RFLP)方法分別對長江中下游和中游水系草魚群體開展了遺傳變異研究; Zhao等[11]基于3個線粒體編碼基因(ND5、ND6和Cyt)和控制區(D-Loop)序列對長江流域草魚群體進行了遺傳結構及演化進行了分析; 宋曉等[12]通過線粒體D-Loop區和Ⅱ基因序列對我國土著群體和國外移居群體進行了遺傳變異分析; 李樹華等[13]基于線粒體D-Loop和Cyt基因序列對長江中游草魚親本增殖放流的遺傳效果進行了評估。此外, 諸如RAPD[14]、TRAP[15]、ISSR[16]和SSR[17—19]等其他分子標記被廣泛用于草魚群體遺傳研究。然而, 眾多研究在樣本采集、研究方法及側重點等方面存在差異, 因此具有進一步開展草魚群體遺傳結構研究的必要。

本研究對長江、珠江和黑龍江水系的8個草魚野生群體的mtDNA D-Loop序列進行PCR擴增和測序, 開展了群體間遺傳變異和系統分化等研究, 旨在補充完善我國草魚野生群體的種質資源研究, 為后期遺傳育種提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與DNA提取

草魚8個野生群體收集于長江、珠江及黑龍江水系(表1), 在前期研究[19]的基礎上補充了一些個體(2013年5月)。實驗樣本為剪取的鰭條組織, 以無水乙醇固定?；蚪MDNA采用苯酚/氯仿法提取, 通過1% 瓊脂糖膠檢測其完整性, 經NanoDrop分光光度儀檢測其純度及濃度。DNA樣品被稀釋成20 ng/μL的終濃度, 保存于–20℃備用。

表1 草魚樣本采集信息

1.2 PCR擴增與測序

根據草魚mtDNA全序列[20](GenBank序列號: NC_010288)設計D-Loop區的引物, 引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物和下游引物序列分別為: DLF: 5￠-CCTAGCGCCCAGAAAAGGGAGAT T-3￠; DLR: 5￠-GCGGGGGATTGAGGGCATACTC-3￠。

PCR擴增體系為50 μL, 包括10× PCR Buffer 5 μL、MgCl2(25 mmol/L)、3 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL、DNA聚合酶(2.5 U/μL) 1 μL、上游及下游引物(10 mmol/L)各1 μL、基因組DNA (20 ng/μL) 2 μL, 補充無菌水33 μL。所需試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR擴增程序為: 94℃預變性3min; 94℃變性30s, 50℃復性30s, 72℃延伸2min, 擴增35個循環; 72℃延伸10min; 4℃保存。擴增反應在Eppendorf梯度PCR儀上完成。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 由上海邁浦生物科技有限公司通過ABI3730XL測序儀進行雙向測序。

1.3 序列整理與數據分析

使用BioEdit 7.0軟件[21]進行序列編輯, 并用Clustal X 1.81軟件[22]進行同源比對和長度確定。采用DnaSP 5.0軟件[23]統計多態性位點數()、單倍型個數()、單倍型多樣性(d)、核苷酸多樣性()、平均核苷酸差異數()和Tajima’s值等遺傳多樣性參數。

利用Arlequin 3.5軟件[24]進行核苷酸組成統計、分子方差分析(AMOVA)和遺傳分化指數(-statistics,ST)計算。利用MEGA 5.1軟件[25]計算群體間的Kimura雙參數模型(Kimura 2 Parameter, K2P)遺傳距離, 并構建鄰接(Neighbor-Joining, NJ)進化樹。根據各采樣點間的地理距離[26], 利用SPSS 16.0軟件[27]分析與遺傳距離間的相關性。

利用MEGA 5.1軟件對單倍型構建最大簡約(Maximum Parsimony, MP)進化樹, 并計算單倍型分支間的K2P遺傳距離, 利用Network 4.6軟件[28]構建單倍型的簡約中介(Reduced-Median, MJ)網絡圖, 并推算單倍型分化時間。

2 結果

2.1 草魚D-Loop序列的變異位點與單倍型分布

共測序獲得424尾草魚的D-Loop區(898 bp)序列。核苷酸組成顯示A+T含量(66.71%)明顯高于G+C含量(33.29%)。在D-Loop區共發現34個變異位點。共檢測到34個單倍型, 其中Hap1、Hap6、Hap20和Hap21為優勢單倍型, 分別占個體數的32.31%、10.14%、28.54%和13.21%; 20個單倍型為除肇慶群體外的各群體所特有(表2)。

表2 草魚群體中的單倍型分布情況

2.2 草魚野生群體遺傳多樣性與群體間遺傳距離

我國草魚野生群體整體單倍型多樣性為0.787(表3)。各群體的單倍型多樣性介于0.474— 0.708, 核苷酸多樣性介于0.0018—0.0037。其中, 吳江群體的遺傳多樣性水平最低(d= 0.474,=0.0018), 肇慶群體的單倍型多樣性最高(d=0.708), 嫩江群體的核苷酸多樣性最高(=0.0037)。群體中性檢驗顯示, 邗江、吳江、九江和石首群體的Tajima’s值為負值; 其余群體為正值, 其中肇慶群體顯著偏離中性(<0.05)。

表3 草魚群體D-Loop區序列遺傳多樣性參數

注:* 表示達到顯著性水平(<0.05)

Note:* means of statistical significant (<0.05)

表4 草魚群體間的K2P遺傳距離(左下角)和遺傳分化指數FST(右上角)

注: * 表示遺傳分化顯著(<0.05); **表示遺傳分化極顯著(<0.01)

Note: * and ** means of significant and extreme significant of genetic differentiation, respectively

我國草魚野生群體間K2P遺傳距離介于0.0020— 0.0049, 如表4(左下角), 其中邗江與吳江群體間遺傳距離最近, 嫩江與邗江群體的遺傳距離最遠。遺傳距離與地理距離具極顯著正相關(=0.61,<0.01, 圖1)?；谌后w間K2P遺傳距離構建NJ樹顯示, 8個群體聚為2支(圖2)。其中一支由長江下游的邗江群體(HJ)、吳江群體(WJ)和九江群體(JJ)首先聚類, 再與肇慶群體(ZQ)聚類; 另一支由石首群體(SS)先與長江上游的木洞群體(MD)和萬州群體(WZ)聚類, 然后與嫩江群體(NJ)聚類; 最后, 以上2個分支聚到一起。

2.3 草魚野生群體間遺傳分化

我國草魚野生群體間的遺傳分化指數如表4(右上角)所示。其中長江下游3個群體(HJ、WJ和JJ)之間及其他4對群體間(JJ與ZQ、SS與MD、MD與WZ、及WZ與NJ)遺傳分化不顯著(>0.05); 其余群體間遺傳分化均達顯著水平(<0.05)或極顯著水平(<0.05)。

基于遺傳分化分析的結果, 將8個群體分成5組, 長江水系分成上游(MD和WZ)、中游(SS)和下游(HJ、WJ和JJ)流域, 及珠江流域(ZQ)和黑龍江流域(NJ), 進行分子方差分析(AMOVA), 結果如表5所示, 不同流域間的方差組分占26.24%, 遺傳分化指數ST為0.262, 達極顯著水平(<0.01), 說明不同水系間及長江水系不同江段間存在顯著遺傳分化。

表5 草魚群體D-Loop序列變異的分子方差分析(AMOVA)

注: **表示差異極顯著(<0.01)

Note: ** means of statistical extreme significant

2.4 草魚單倍型的發生關系

基于草魚單倍型構建MP進化樹(圖3), 34個單倍型被分為2個主分支(LGA和LGB)。其中LGA包含26個單倍型, 有308尾魚, 為優勢分支; LGB包含8個單倍型, 有116尾魚。分支間平均K2P遺傳距離為0.0087, 分化水平極顯著(ST=0.644,<0.01)。

利用單倍型構建的MJ網絡圖與MP進化樹相吻合(圖4)。2個分支各有2個優勢單倍型, 并具有一定的地域性; 其中2個為長江中下游4個群體和肇慶群體所有, 另外2個為長江中上游3個群體和嫩江群體所有。估算4個優勢單倍型間的分化時鐘, 不同分支的優勢單倍型間分化時間介于距今51077—28924年前, 分支內優勢單倍型間分化時間介于距今11414—9464年前, 依此推測2個單倍型分支的分化大約發生在第四紀更新世晚期。

3 討論

3.1 草魚D-Loop區的變異特征

本研究對草魚D-Loop區序列分析表明, A+T含量達到66.71%, 明顯高于G+C含量, 這與Zhao等[11]在草魚中研究發現66.8%的A+T含量相符合。研究發現草魚D-Loop區34個變異位點, 34個單倍型, 高于Zhao等[11]利用4個mtDNA序列的研究結果, 而與宋曉等[12]的研究結果相似。分析造成本研究中草魚D-Loop區多態性較高的原因, 與所用群體數及樣本數較多有關。對比Zhao等[11]的研究, 其樣本數盡管不多, 但其單倍型多樣性水平與本文差異不大, 分析采用更多序列片段易于檢測到較多突變位點和單倍型。因此, 在樣本數充足的情況下, 可只用D-Loop區等序列開展遺傳變異分析, 以降低實驗成本; 而當樣本量不太充足時, 建議增加mtDNA序列片段來開展群體遺傳研究。

3.2 我國草魚野生群體遺傳多樣性

在本研究中我國草魚野生群體, 呈現較高的單倍型多樣性, 說明我國草魚野生資源具有較高遺傳多樣性。各群體的單倍型多樣性水平與Zhao等[11]和李樹華等[13]對長江水系的草魚群體及宋曉等[12]對中國土著群體的研究結果相類似, 明顯高于宋曉等[12]研究中日本群體(Tong)和美國群體(MSB)的單倍型多樣性, 這與旅居群體的原始親本較少有關。比較基于線粒體多態性的草魚群體遺傳研究, 發現結果不盡相同; 李思發等[9]和張四明等[10]利用基于片段長度多態性的RFLP技術檢測到的單倍型數目明顯少于Zhao等[11]和宋曉等[12]利用基于序列突變位點而確定的單倍型數, 可能與檢測技術和研究群體等的差異有關。

本次研究表明吳江群體單倍型多樣性最低, 推測可能與太湖流域悠久的圩田開發歷史[29]有關, 原有水生資源的不斷破壞, 導致遺傳多樣性降低, 可能也是廖小林等[30]認為草魚群體存在“隱蔽瓶頸效應”現象[31]的原因。長江水系中上游群體的遺傳多樣性水平較低, 推測與其特殊的水文條件和水利設施有關[32]。長江流域部分野生群體呈現相對較低的單倍型多樣性水平, 可能還受各江段原種場運營管理模式及常年增殖放流等因素影響; 盡管李樹華等[13]在相關研究中未發現放流模式對野生群體的遺傳多樣性和遺傳結構產生明顯的影響, 但是近年來長江流域的增殖放流對草魚野生種質資源的影響應該受到重視。在研究中肇慶群體的單倍型多樣性最高, 與宋曉等[12]研究發現中國土著群體中珠江群體單倍型多樣性最高相符, 與我們前期研究中發現肇慶群體等位基因數最多相吻合[19], 這可能與珠江流域溫暖適宜的水域環境有關。長江下游2個群體(HJ和JJ)分布于長江干流, 擁有廣闊的水域環境及適宜的水文條件, 可能導致其單倍型多樣性略高于嫩江群體和長江上游群體, 與宋曉等[12]的部分研究結果相似。

3.3 我國草魚系統演化和群體間遺傳分化

本研究4個優勢單倍型在石首群體中均有分布, 可為草魚起源于第三紀后期的上新世的長江中游[1]提供分子證據, 而長江于早更新世晚期才從三峽東西貫通[33], 草魚從而由中游擴散分布于整個長江水系。4個優勢單倍型分為2支并具一定地域性分布, 推測是在地貌變化和種群演化兩方面因素影響下形成。2個分支的分化時間推算發生于第四紀更新世晚期, 可能是冰期和間冰期交替導致地理隔離與融合造成[34]單倍型分化。2個分支內表現地域性差異, 其分化時間與中國主要水系形成時期(1.2—1.0百萬年前)[33]相吻合, 這可能是物種在擴散中的選擇和保留; 其中一個分支由長江中游經長江下游往珠江水系方向演化, 而另一個分支則由長江中游向長江上游和經過江河平原向古嫩遼河擴散演化, 這符合對珠江水系和黑龍江水系草魚種群的起源推測[1]。

長江、珠江和黑龍江水系的草魚在經歷長期的演化過程后發生了顯著遺傳分化。在長江水系內部, 下游3個群體間遺傳距離最近, 遺傳分化不顯著, 與李思發等[9]、張四明等[10]及Zhao等[11]的研究結果相符合; 中游的石首群體與下游和上游2個群體遺傳距離接近, 大部分群體間存在顯著遺傳分化, 與Zhao等[11]研究發現長江水系不同江段無顯著遺傳分化不盡相同, 群體間遺傳距離與地理距離呈正相關, 與我們基于微衛星標記的研究結果相符[19]。肇慶群體與長江下游3個群體間的遺傳距離較近, 與除九江群體外的其他群體呈極顯著的遺傳分化。一方面支持珠江水系草魚起源于長江中下游草魚種群擴散的說法[1], 也可能與靈渠溝通湘江(長江支流, 有草魚產卵場分布[9])和漓江(珠江支流)有關; 另一方面說明珠江水系草魚種群在長期的適應過程中累積了特異的遺傳資源。相對其他群體, 嫩江群體與長江上游2個群體的遺傳距離最近, 在優勢單倍型上也具有明顯的共享現象; 根據相關文獻[35, 36], 兩者的地貌及河流坡降等方面具有相似之處, 而Zhang等[37]發現水文情勢與草魚的繁殖行為密切相關, 是否相近的環境導致群體間的遺傳相似還有待進一步研究。

木洞、萬州、肇慶及嫩江4個群體呈現相對較高的核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數, 這可能是在種群進化中平衡選擇[38]的結果, 通過保留更多遺傳多樣性, 維持種群較高的適合度。以上4個群體的中性檢驗[39]顯示可能經歷不同程度遺傳瓶頸效應, 與我們利用微衛星的研究結果相符[19], 推測在草魚種群演化過程中, 地貌變化促進草魚物種擴散并造成單倍型分化的同時, 氣溫變化、環境惡劣也抑制了草魚種群過度繁衍。

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GENETIC VARIATION ANALYSIS BASED ON D-LOOP SEQUENCES OF WILD POPULATIONS OF GRASS CARP () IN CHINA

FU Jian-Jun1, 2, WANG Rong-Quan3, Shen Yu-Bang1, XUAN Yun-Feng3, XU Xiao-Yan1, LIU Cheng-Chu2and LI Jia-Le1

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Postdoctoral Research Station of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Key Laboratory of Conventional Freshwater Fish Breeding and Health Culture Technology Germplasm Resources, Ministry of Agriculture, Suzhou Wujiang Area Aquaculture Limited Company, Suzhou 215221, China)

In this study we analyzed the genetic variations in the mtDNA D-Loop sequences of eight wild populations of grass carp () including six populations (Hanjiang, Wujiang, Jiujiang, Shishou, Mudong, and Wanzhou) from the Yangtze River, the Zhaoqing population from the Pearl River, and the Nenjiang population from Heilongjiang River. A total of 34 variable sites and 34 haplotypes were detected in 424 individuals, and the haplotype diversity ranged from 0.474 to 0.708 among the eight populations. The pairwise population K2P genetic distances were between 0.0020 and 0.0049. The genetic distance between the three populations from the lower reach of the Yangtze River was the closest and their genetic differences were insignificant (>0.05). The Zhaoqing population also showed a close genetic distance with the three populations from the lower reach of the Yangtze River; and it did not have significant genetic differences compared to the Jiujiang population (>0.05). The Nenjiang population displayed a close genetic distance with the two populations from the upper reach of the Yangtze River. The genetic difference between the Nenjiang population and the Wanzhou population (>0.05) was insignificant. Furthermore we observed an extreme significant correlation between the genetic distance and the geographic distance (<0.01). The AMOVA analysis suggested that there were highly significant differences between populations (<0.01), and that the genetic variation among different watersheds in China accounted for 26.24% of the total variation. The haplotypes divided into two major branches which exhibited remarkable evolutionary differences (ST=0.644,<0.01), and this branching might originate in the late Pleistocene.

; Wild population; D-Loop sequence; Genetic variation

10.7541/2015.46

Q346+.1

A

1000-3207(2015)02-0349-09

2014-04-21;

2014-09-11

現代農業產業技術體系建設項目(編號: CARS-46-04); 國家科技支撐計劃項目-大宗淡水主養魚類新品種選育(編號: 2012BAD26B02); 上海市重點學科建設項目(編號: Y1101)資助

傅建軍(1986—), 男; 浙江金華人; 博士; 研究方向為水產動物種質資源與遺傳育種。E-mail: jjfu@shou.edu.cn

李家樂, 教授, 博士生導師; 研究方向為水產動物種質資源與遺傳育種。E-mail: jlli2009@126.com