鹽脅迫對大豆POD、SOD和CAT同工酶的影響

何慶元，向仕華，吳 萍，王松華，李正鵬，祝嫦巍，張曉紅

(1.安徽科技學院 生命科學學院，安徽 鳳陽 233100;2.自貢市農業科學研究所，四川 自貢 643000）

世界農業生產發展所面臨的重要難題之一是土壤鹽漬化，世界灌溉地鹽堿化的面積達1/3左右[1]，占可耕土壤的26%[2]。在我國大豆主產區(東北生態區)土壤鹽堿化也十分嚴重[3]。栽培大豆雖然具有一定的耐鹽能力，但在鹽漬脅迫下，往往導致產量減少，品質降低[4]。

大豆的耐鹽機理復雜，主要包括泌鹽、大分子物質調節、離子攝入和區域化以及酶消除脅迫毒害等。已有的研究表明高鹽離子濃度能夠降低植物水分吸收的能力，Na+通過未知的受體作用，促使活性氧(ROS)分子，如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2.ˉ－)和羥自由基(HO·)等在細胞質中大量累積，最終作用到細胞核的組氨酸激酶受體蛋白(HKT)，對植物造成次級氧化脅迫，損傷膜脂、蛋白質和核酸等，改變細胞代謝，引起對植物的傷害[5－6]。植物為減輕活性氧對胞內生物大分子和細胞膜的傷害，最為重要的一類調節途徑是利用保護酶系統，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等清除活性氧，從而降低鹽脅迫引起的植物傷害作用[7－8]。適量的ROS能夠誘導植物產生對生物和非生物脅迫的保護機制，但過高濃度的ROS導致過度的保護，最終造成對細胞的損傷[9]。本研究分析不同濃度NaCl脅迫對大豆同工酶的影響，為探討大豆對鹽脅迫的響應機理奠定一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試大豆為“南農1138－2”，是奉賢穗稻黃單株選擇獲得的品系，具有高產、廣泛的生態和地區適應性、綜合性狀優良特點，利用該祖先親本育成或衍生了至少45個品種[10]。

1.2 試驗設計

分別選取籽粒飽滿的大豆種子，播種于裝有蛭石的花盆中，置于溫室大棚中，自然光照，待長出真葉后，選取長勢一致的幼苗轉至1/2 Hoagland營養液(pH 5.8)中培養至V2期[11]后，用NaCl脅迫處理。實驗設置5 處理，分別為在 1/2 Hoagland 中分別添加至含 0.000mol/L、0.050 mol/L、0.075 mol/L、0.100 mol/L、0.125 mol/L濃度的NaCl，每個處理3個重復，每個重復1盆，每盆8株。

1.3 測定項目與方法

處理前后以子葉節為分界點，分別測量根長和莖長，根相對生長速率=(處理后根長－處理前根長)/(處理前根長*處理天數)，莖相對生長速率=(處理后莖長－處理前莖長)/(處理前莖長*處理天數)。

培養至V3期，分別采集各株倒二葉(完全展開的復葉)的中間小葉，重復內8株混合取樣，每重復取0.30 g，立即用預冷的0.20 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.8)按料:液=1∶3，充分研磨至均漿，全部轉移至離心管中，4℃ 10000 rpm離心20 min，取上清液，作為待測粗酶液。

酶活性測定:用考馬斯亮藍(G250)法測定可溶性蛋白含量[12]、用愈創木酚法測定POD活性[12]、用鄰苯三酚自氧化速率法測定SOD活性[13]和用紫外吸收法測定CAT活性[12]。酶的活力單位用比活力單位即單位可溶性蛋白在每分鐘吸光度的變化值，即:ΔA/(min·mg)。

同工酶電泳:3種同工酶都采用Tris－HCl緩沖體系，濃縮膠濃度為4%，分離膠為7%。POD和SOD以30V電泳7－8 h，至溴酚藍至膠底端為止;CAT一直用30V電泳9 h。POD同工酶用聯苯胺染色法[14]，SOD同工酶用氯化硝基四氮唑藍(NBT)法[15]，CAT同工酶用改良的鐵染色法[16]。

以子葉節為界剪斷成為根和地上部分，經105℃殺青10 min，80℃烘干至恒重后分別稱取根和地上部分干重。根冠比=根干重/地上干重。

1.4 數據分析

數據用Excel 2003和SPSS 13.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對大豆生長的影響

表1 不同濃度NaCl處理下大豆的根、莖相對生長速率，根和地上部分干重及根冠比Table 1 Soybean’s relative growth rate of root and stem，dry weight of root and aerial part，root/shoot ratio in different NaCl treatments

從表1可知，隨NaCl濃度的升高，根和莖的相對生長速率降低，根和地上部分的干重減少，在沒有NaCl脅迫下，生長最好。并且當溶液中NaCl濃度為0.050 mol/L時，根和莖的相對生長速率以及根干重都沒用顯著的差異，但地上干重顯著減少。當溶液中NaCl濃度達到0.075 mol/L時，相對生長速率受到顯著抑制，生物量顯著減少。當溶液中NaCl濃度高于0.075 mol/L后，大豆根冠比顯著增加，但當溶液中NaCl濃度達到0.125 mol/L后，根冠比和對照沒有差異，這可能是因為在一定濃度的NaCl脅迫下，根的生長比地上部分要多，以期適應脅迫環境，但過高的NaCl濃度嚴重抑制了根和莖的生長，導致根冠比降低。

2.2 鹽脅迫對大豆POD、SOD和CAT同工酶活性影響

表2 不同NaCl處理下大豆的POD、SOD和CAT活性Table 2 Activities of POD，SOD and CAT enzyme of soybean in different NaCl treatments

從表2可知，POD、SOD和CAT活性在不同濃度NaCl脅迫下表現為先升高，后降低，當NaCl濃度為0.050 mol/L時，雖然有一定的增加，但沒有顯著性差異。但當NaCl濃度達到0.075 mol/L及以上時，3種酶的活性都顯著降低，并且隨NaCl濃度的增加，酶活性進一步降低。這可能是在低濃度NaCl下，大豆通過激活了抗氧化酶系統活性，分解鹽脅迫所產生的活性氧(ROS)分子，但過高濃度的NaCl導致抗氧化酶系統過度應急，細胞膜等的損傷，最終酶活性降低。

2.3 鹽脅迫對大豆POD、SOD和CAT同工酶譜的影響

從圖1可以看出在NaCl脅迫下大豆葉片中POD、SOD和CAT同工酶譜分別有8、6和1條酶帶。其中POD酶譜的POD－1到POD－6在5個處理中都有酶帶，只有在NaCl濃度在0.075 mol/L時具有所有的酶帶，在0.100 mol/L時具有POD－8酶帶。這表明當NaCl濃度增加到一定濃度時，會產生新的POD同工酶，但過高的NaCl濃度導致新產生的POD同工酶不表達。SOD酶譜在NaCl濃度從0.000到0.100 mol/L的4個處理都沒有變化，當NaCl濃度達到0.125 mol/L時，檢測不到SOD－3和SOD－5兩條酶帶，過高濃度的NaCl導致部分SOD同工酶不表達。CAT酶譜在5個處理都只有一個相同的酶帶，酶譜沒有差異。

3 討論

Na+和Cl－是競爭性選擇吸收離子，植物會優先吸收Na+和Cl－導致其他營養物質吸收減少[17]，在NaCl脅迫下植物細胞液泡中的H+和環境中的Na+發生交換進入植物細胞質中，過多的Na+和Cl－對植物產生毒害，導致作物產量和品質的降低。植物在一定濃度的Na+刺激下，能夠激活一些抗氧化酶基因的表達[5]，緩解ROS等的危害，但過量的ROS攻擊蛋白質、脂質等生物大分子，使它們氧化降解，最終導致酶失活，增大生物膜透性[18]。植物的抗氧化酶系統具有一定的清除過量ROS能力[19]。本研究表明低濃度(0.050 mmol/L)的NaCl脅迫能夠增強抗氧化酶活性，但NaCl增加到一定濃度后，可能是抗氧化酶的過度應急，最終導致活性降低，和前人研究的結果較為一致。

同工酶是指一組能催化相同的化學反應，但其蛋白質分子結構和理化性質等存在明顯差異的酶。植物在鹽脅迫下同工酶的種類也會產生一定的改變[20]。南農1138－2是基因型高度單一純合的地方品種，同工酶表達的差異是相關基因受到鹽脅迫誘導所致。本研究中POD和SOD同工酶在NaCl脅迫后譜帶產生了一定的變化，可能是在一定濃度NaCl誘導下，植物為緩解鹽脅迫，產生了新的同工酶，但過高的濃度，致使這些種類的同工酶表達受到損傷，最終不表達。然而，酶譜差異的表達還需要進行進一步的深入研究。

[1]張鵬，徐晨，徐克章，等.大豆品種耐鹽性的快速鑒定法及不同時期耐鹽性的研究[J].中國油料作物學報，2013，35(5):572－578.

[2]Ha B K.，Vuong T D，Velusamy V，et al.Genetic mapping of quantitative trait loci conditioning salt tolerance in wild soybean(Glycine soja)PI 4834463 [J].Euphytica，2013，193:79 －88.

[3]劉光宇，關榮霞，常汝鎮，等.大豆不同器官Na+含量與苗期耐鹽性的相關分析[J].作物學報，2011，37(7):1266－1273.

[4]姜靜涵，關榮霞，郭勇，等.大豆苗期耐鹽性的簡便鑒定方法[J].作物學報，2013，39(7):1248－1256.

[5]Deinlein U，Stephan A B，Horie T，et al.Plant salt－tolerance mechanisms[J].Trends in Plant Science，2014，19:371 －379.

[6]王聰，朱月林，楊立飛，等.NaCl脅迫對菜用大豆種子膨大過程中抗氧化系統及滲透調節物質的影響[J].西北植物學報，2012，32(2):0297 －0305.

[7]Foyer C H，Descourvières P，Kunert K J.Protection against oxygen radicals:an important defence mechanism studied in transgenic plants[J].Plant Cell and Environment，1994，17:507 －523.

[8]Bowler C，Montagu M V，Inzé D.Superoxide dismutase and stress tolerance[J].Annual Review Plant Physiology Molecular Biology，1992，43:83 －116.

[9]Van B F，Vranová E，Dat J F，et al.The role of active oxygen species in plant signal transduction[J].Plant Science，2001，161:405－414.

[10]熊冬金，趙團結，蓋鈞鎰.中國大豆育成品種親本分析[J].中國農業科學，2008，41(9):2589－2598.

[11]Fehr W R，Caviness C E，Burmood D T，et al.Stage of development descriptions for soybeans，Glycine max(L.)Merrill[J].Crop Science，1971，11(6):929 －931.

[12]李忠光，龔明.植物生理學綜合性和設計性實驗教程[M].武漢:華中科技大學出版社，2014.

[13]韓少華，朱靖博，王妍妍.鄰苯三酚自氧化法測定氧化活性的方法研究[J].中國釀造，2009，207(6):155－157.

[14]王松華，張，崔元戎，等.鎘對靈芝菌絲抗氧化系統的影響[J].應用生態學報，2008，19(6):1255－1361.

[15]羅廣華，王愛國.植物SOD的凝膠電泳及活性的顯示[J].植物生理學通訊，1983(6):44－45.

[16]董泗建，劉昌玲.一種鑒定過氧化氫酶活性的鐵染色法[J].生物化學與生物物理進展，1996，23(1):86－88.

[17]Taster M，Davenport R.Na+tolerance and Na+transport in higher plants[J].Annual Botanic，2003，91:503 －527.

[18]Sharma S S，Dietz K J.The relationship between metal toxicity and cellular redox imbalance[J].Trends in Plant Science，2009，14:43 －50.

[19]Mittler R.Oxidative stress antioxidants and stress tolerance[J].Trends in Plant Science，2002，7:405 －410.

[20]王秀玲，程序，謝光輝，等.NaCl脅迫對甜高粱萌發及過氧化物同工酶的影響[J].中國農業大學學報，2011，16(1):18－23.