星點設計－效應面法優化鳳尾草總黃酮超聲提取工藝

周國梁，劉小胖，俞 浩 ，劉漢珍，郭元新，馬世堂

(1.安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100;2.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038;3.溫州醫學院，浙江 溫州 325000）

鳳尾草為鳳尾蕨科植物鳳尾草(Pteris multifida Poir)的干燥全草，主要功效為清熱解毒，涼血止血，消腫解毒[1]。鳳尾草中的成分較多，其中主要含黃酮類、萜類、甾醇類等化學成分。根據近年文獻報道表明，鳳尾草中黃酮類化合物在抗菌、抗病毒和抗腫瘤等方面具有明顯活性，因此對其研究具有一定的研究價值[2]。均勻設計和正交設計是對試驗設計中常用的的工藝優化方法，但這兩種方法在試驗設計方面精度不夠，不能有效進行數學模型擬合[3]，星點設計試驗方法在試驗設計中具有較高的精確性，采用集數學和統計學方法于一體的效應面優化法優化試驗條件，該方法使用簡便，結果分析較為精確，具有很高的應用性。本研究旨在利用星點設計－效應面法優化鳳尾草中總黃酮提取工藝，為其提取工藝研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

TU－1810PC紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);JA3003電子天平(上海方瑞精密儀器有限公司);SHB－A96型循環多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);KQ－250型超聲波清洗器(合肥金尼克機械制造有限公司)。使用所有試劑均為分析純;水為自制蒸餾水;蘆丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號:100080－201309)。

1.2 藥材

鳳尾草(Pteris multifida Poir)購自安徽亳州滬譙飲片廠(批號:20130615)，經中藥實驗室劉漢珍副教授鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 鳳尾草總黃酮含量測定

2.1.1 藥材的處理 鳳尾草在60～70℃烘箱中恒溫干燥3～4h，粉碎過40目篩，冷凍保存備用。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品2.00mg，置于10mL容量瓶中，采用參考文獻方法[3]制定蘆丁標準曲線，以蘆丁對照品濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標制備標準曲線，得回歸方程為:A=11.72634C －0.07716，r=0.9995，蘆丁在10.0 ～65.0μg/mL 范圍內其濃度與吸光度呈現良好的線性關系。

2.1.3 鳳尾草中總黃酮成分的提取 精密稱取5份鳳尾草粉末各2.00g，置100mL錐形瓶中，在一定乙醇濃度、提取時間、料液比條件下超聲波輔助提取，提取液離心后，抽濾除渣，得提液后，按照2.1.2中的方法測定鳳尾草中總黃酮含量，并計算提取率。每個試驗重復做3次，取平均值。

總黃酮提取率(%)=樣品溶液中的總黃酮量/樣品重×100%

2.1.4 精密度考察 精密吸取2.1.2項下對照品溶液，按照2.1.2條件下連續測定6次，記錄吸光度，計算RSD為1.35%。

2.1.5 樣品穩定性考察 取供試品溶液，在0、1、2、4、6 h按照2.1.2條件下分別測定吸光度，計算RSD為1.33%(n=6)，表明樣品溶液在6小時內穩定。

2.1.6 加樣回收試驗 精密稱定已知含量的鳳尾草樣品2.00g，置9個50ml的錐形瓶中，精密加入濃度為 0.238mg/mL 的蘆丁對照品溶液 1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、2.0、3.0、3.0、3.0mL，作為高、中、低濃度回收率測定用樣品，按2.1.3下方法制備，依照2.1.2下測定方法測定吸光度并計算回收率，結果平均回收率為 98.10%，RSD=1.7%(n=6)，表明方法準確良好。

2.2 單因素提取條件的選擇[4－5]

2.2.1 乙醇濃度的選擇 精密稱取5份鳳尾草粉末各2.00g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入40%、50%、60%、70%、80%和90%濃度的乙醇溶液80mL，加熱溫度為25℃，超聲提取30min。提取液離心，抽濾除渣，得粗提液后，按照2.1.3中的方法測定鳳尾草中總黃酮含量，并計算提取率。結果如圖1所示。

從圖1分析可以看出，鳳尾草中總黃酮提取率并不隨乙醇濃度的升高而增加。在乙醇濃度為60%時，總黃酮提取率出現峰值，之后開始下降。因此確定提取鳳尾草總黃酮乙醇提取濃度范圍為40% ～70%。

2.2.2 提取時間的選擇 精密稱取5份鳳尾草粉末各2.00g，置于100 mL錐形瓶中加入60%乙醇溶液80mL，加熱溫度為25℃，超聲提取時間分別5、10、15、20、25、30min。提取液離心，抽濾除渣，得粗提液后，按照2.1.3中的方法進行鳳尾草中總黃酮含量測定，并計算提取率。結果如圖2所示。

從圖2分析可以看出，鳳尾草中總黃酮提取率并不隨提取時間的增加而增加。在提取時間為20min后，鳳尾草中總黃酮提取率變化不大。因此確定提取總黃酮的最佳提取時間范圍為10min到30min。

2.2.3 液料比的選擇 精密稱取5份鳳尾草粉末各2.00g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入20、40、60、80和100mL濃度為60%的乙醇溶液，加熱溫度為25℃，超聲提20min。提取液離心，抽濾除渣，得粗提液后，按照2.1.3中的方法進行鳳尾草中總黃酮含量測定，并計算提取率。結果如圖3所示。

當液料比為10到40倍數時，隨液料比的增加，鳳尾草中總黃酮提取率也隨之增加，在液料比為50倍時，鳳尾草中總黃酮提取率開始下降，所以料液比最佳范圍選為20～60倍數。

2.3 星點設計試驗

2.3.1 因素水平設計 以單因素試驗結果為依據，乙醇濃度(%)(X1)、提取時間(min)(X2)及液料比(倍數)(X3)為考察因素設計因素水平表[6－10]，設計并建立因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

2.3.2 星點設計試驗分組及結果 根據試驗因素水平設計，按照表1進行星點設計試驗，結果見表2。

表2 星點設計試驗分組及結果Table 2 Composite design experimental group table and result

2.3.3 模型建立及顯著性檢驗 根據表2結果，利用Design Expert 8.0軟件，以總黃酮提取率為指標(Y)，采用線性多元回歸和二項式方程對(X1、X2、X3)因素進行擬合，得出擬合方程如下:

線性多元回歸方程:

多元線性回歸R2=0.8428，P=0.4395＞0.01，結果分析擬合效果不佳，因此線性模型不能采用，故采用二項式方程進行擬合。

二項式方程:

對建立模型進行回歸模型分析，結果見表3。結果分析顯示該模型具有顯著性(P＜0.01)，失擬項不顯著以及模擬相關性較好R2=0.8784，該方程擬合度和可信度均良好，誤差較小，故可用采用此模型對鳳尾草總黃酮的提取工藝進行分析和預測。

表3 回歸模型分析Table 3 The fitted value and F value P

采用F檢驗對二項式方程中的各項系數進行檢驗后，簡化方程，刪除不顯著因素，簡化后方程R2增加，故可以采用簡化方程，簡化方程為:

2.3.4 效應面法優選工藝條件 應用Deseign Expert 8.0軟件制作三維曲面，以鳳尾草中總黃酮提取率為考察量，從三個變量中選擇一個為不變量與另兩個影響因素擬合為三維曲面圖，以擬合目標函數建立數學模型，繪制考察量曲面如下圖6－8，對結果進行分析，經簡化后的二項式模型預測分析，鳳尾草總黃酮提取率最大值為1.831%，最優工藝為:乙醇濃度為63.70%，提取時間25.80min，液料比44.47倍。

2.3.5 最佳提取工藝的驗證 按照優選出的鳳尾草最佳提取工藝制備鳳尾草樣品溶液，即乙醇濃度63.7%，提取時間25.8min，液料比44.47倍，做3組平行試驗，結果平均值與擬合方程預測值相比較，見表5。

表5 驗證試驗預測值與實際值Table 5 Verification experiment predicted and actual values

驗證得到實際值與預測值的偏差率為－0.928%，偏差較小，表明預測值較為準確，模型預測性較好。

3 討論

星點設計－效應面法優化主要需要依靠合理的包括最佳試驗條件的試驗范圍，本試驗設計過程中為了得到合理的較優的試驗條件，首先進行了單因素條件考察，確定了優化條件的范圍，因此在使用星點設計－效應面法之前，建立合理的試驗各因素與水平非常重要[11]。

本試驗設計中采用星點設計法克服了以往正交設計和均勻設計的缺陷，通過采用非線性擬合的中心組合－效應面法研究各因素間相互作用的一種回歸分析方法。該法采用非線性數學模型擬合，在試驗過程中能夠以中心點為中心，連續進行重復性試驗不斷提高試驗精度，因此復相關系數較高，結果顯示預測值更接近真實值[12]。

在提取方法中，本試驗采用超聲波提取法，主要是利用超聲波產生振動能夠引起強烈空化效應和攪拌作用，使藥材植物細胞破裂，藥材細胞中成分能夠快速滲透到溶劑之中，加速了藥材中的有效成分溶出，提取時間縮短，提取效率大幅增加。該法所需設備簡單，使用操作方便，并且在提取過程中溫度較低，能夠防止黃酮類成分的氧化分解，所以比較適合該類成分的提取[13]。

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