硫酸類肝素二糖的質譜裂解規律探析

林江慧，張建偉，張惠芳，高建平，魏 崢

（福州大學糖生物化學研究所，福建福州 350002）

硫酸類肝素二糖的質譜裂解規律探析

林江慧，張建偉，張惠芳，高建平，魏 崢

（福州大學糖生物化學研究所，福建福州 350002）

硫酸類肝素結構決定了它與蛋白之間的相互作用，對硫酸類肝素結構的解析，能夠進一步闡明結構與功能之間的關系。本實驗采用電噴霧離子阱－多級質譜技術（ESI－MSn）在負離子模式（ESI－）下探析了12種硫酸類肝素二糖的裂解規律。實驗發現：二糖中亞硫酸根的位置和數量對其在質譜分析中的穩定性起著決定作用，所含亞硫酸根越多越不穩定；N位亞硫酸根比C—2位和C—6位亞硫酸根更容易丟失。此外，二級質譜表明，同分異構體有其特定的裂解規律。該質譜裂解規律有助于硫酸類肝素二糖同分異構體的鑒定，可為多級質譜在硫酸類肝素結構研究中的應用提供理論依據。

硫酸類肝素二糖；結構；電噴霧離子阱－飛行時間質譜；裂解規律

硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）是高度硫酸化線性糖胺聚糖，廣泛存在于細胞表面和細胞基質中。HS在生物體生長發育、血管生成、凝血、細胞粘附，以及腫瘤轉移中具有重要的生物學活性［1－5］，通過與酶、生長因子、細胞因子及細胞基質蛋白的相互作用調控眾多的細胞信號通路［6－8］。這些重要的生物功能主要是由HS的特殊序列結構與蛋白質間的親和作用以及HS完整鏈的性質決定的［9］。如C—6—O亞硫酸根是它與成纖維生長因子、血管生長因子相互作用的位點，能夠調節腫瘤血管生長［10］。含C—2—O亞硫酸根的硫酸類肝素十糖能抑制FGF－2信號通路［11］。N－非取代葡萄糖胺是病毒黏附、侵入細胞必要的結構［12］。

HS是由重復二糖單元構成的聚糖鏈。二糖是由己糖醛酸（hexuronic acid，HexA）和葡萄糖胺（glucosamine，GlcN）以1～4糖苷鍵連接而成的。其中己糖醛酸可能存在4種結構，2種差向異構體－葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）或艾杜糖醛酸（iduronic acid，IdoA），以及它們C—2—O位被硫酸化的衍生物。而葡萄糖胺的存在形式更為復雜，有N－乙酰葡萄糖胺（N－acetylglucosamin，GlcNAc）、N－硫酸化葡萄糖胺（N－sulfoglucosamin，GlcNS）和N－非取代葡萄糖胺（N－unsubstituted glucosamine，GlcNH），以及它們的C—6—O位和C—3—O位被硫酸化的衍生物。利用肝素酶酶解HS，能得到12種典型的硫酸類肝素二糖［12－16］，此類酶解產物的己糖醛酸中含有△4－，5－不飽和雙鍵。由于HS的結構復雜性，使其結構組分研究極具挑戰。

鑒于HS具有重要的生物功能，測定HS的精細結構是十分必要的。迄今為止，對HS結構測定主要集中在二糖組分的分析，主要采用的方法有毛細管電泳法［17］、聚丙烯酰胺凝膠電泳法［18］和液相色譜［19］法。以上方法都存在靈敏度不高，測定生物來源樣品時雜質干擾較大等缺點。近十幾年來，由于質譜的高靈敏度和高分辨率，使其在硫酸類肝素結構測定中的應用受到重視。目前，已報道了利用多種液相色譜－質譜聯用體系分析硫酸類肝素二糖和寡糖的結構，如熒光標記－反相色譜－質譜體系［2021］、亞硝酸裂解－親水色譜－質譜體系［22］、超壓液相色譜－電噴離子化質譜體系［23－24］，另外也有采用串聯質譜研究硫酸類肝素寡糖中亞硫酸根丟失的規律報道［25］。

本工作應用電噴霧離子阱－多級質譜法對12種硫酸類肝素二糖（肝素酶解產物）進行分析，主要探討亞硫酸根對二糖結構穩定性的影響、同分異構體的區分以及二糖的裂解規律，以期為多級質譜在硫酸類肝素結構研究中的應用提供理論結構信息。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

離子阱飛行時間質譜儀：日本島津公司產品；Mili－Q超純水機：美國Millpore公司產品；離心濃縮儀：德國Christ公司產品；12種硫酸類肝素二糖（肝素酶酶解產物）△HexA－GlcNH（A），△HexA2S－GlcNAc（B），△HexA－GlcNAc（C），△HexA－GlcNAc6S（D），△HexA2S－GlcNH（E），△HexA2S－GlcNH6S（F），△HexA－GlcNH6S（G），△HexA2S－GlcNS（H），△HexA－GlcNS（I），△HexA－GlcNS6S（J），△HexA2S－GlcNAc6S（K），△HexA2S－GlcNS6S（L）：均為英國Idruon公司產品；乙腈：德國Memmert公司產品；乙酸銨：美國Sigma公司產品。

1．2 質譜條件

ESI源，負離子模式，霧化氣流速1．50L／min，干燥氣流速10L／min，加熱模塊溫度200℃，曲形脫溶劑管（CDL）溫度200℃，離子源電壓4．5kV，檢測器電壓1．6kV，累積時間20ms，質量掃描范圍m／z50～700，碰撞能量95％。

1．3 實驗方法

準確吸取10μL 50mg／L肝素二糖溶液，在負離子模式下，手動注入質譜儀進行分析。

2 結果與討論

2．1 二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc負離子模式質譜分析

二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的質譜分析及裂解方式示于圖1。

△HexA－GlcNH準分子離子峰［M－H］－為m／z336．090 8，△HexA－GlcNAc的［M－H］－為m／z378．100 3。為了進一步分析二糖的裂解規律，選擇m／z336．090 8進行二糖△HexA－GlcNH

二級裂解，碰撞能量為95％。而二糖△HexAGlcNAc選擇m／z 378．100 3進行二級裂解。兩種二糖都存在0，2X方式裂解，得到m／z 277．056 3，277．055 4碎片離子，以及0，2X方式裂解碎片失去一分子水后的到m／z259．045 7，259．045 9離子。兩種二糖都存在2Y裂解碎片離子，分別為m／z 175．025 5，175．025 7?！鱄exA－GlcNAc存在特別的裂解方式［MH2O－H］－為m／z 360．087 9。這2個二糖都不含亞硫酸根，在質譜測試中，其結構相對較穩定，不存在鈉加合現象?！鱄exA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的質譜裂解規律差別不明顯，主要原因是其結構非常相似。

圖1 二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的1、2級質譜圖及裂解規律Fig．1 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA－GlcNH and△HexA－GlcNAc

2．2 二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S負離子模式質譜分析

二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S的質譜分析及裂解方式示于圖2。

二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S為同分異構體，準分子離子峰［M－H］－分別為m／z458．057 2和458．057 3。鈉加合得到［M＋Na－H］－分別為m／z480．037 4和480．038 7。一級質譜中，△HexA2S－GlcNAc的2位亞硫酸根斷裂得到m／z 378．991 9離子，△HexAGlcNAc6S失去水分子得到m／z 440．047 8離子，失去6－位亞硫酸根得到m／z 378．992 7離子。這2個二糖的一級質譜存在細微差別，在二級質譜裂解中有自身規律。它們都存在0，2X，0，5X裂解方式，△HexA2S－GlcNAc0，2X斷裂失去一分子水得到碎片離子m／z259．998 2，△HexA－GlcNAc6S0，2X方式斷裂得到碎片離子m／z357．012 1?！鱄exA2S－GlcNAc的2位亞硫酸根裂解，同時發生0，5X斷裂失去一分子水得到碎片離子m／z300．037 3?！鱄exA－GlcNAc6S母離子6位亞硫酸根丟失，同時發生0，5X斷裂失去一分子水得到m／z300．037 3。NAcX方式斷裂失去一分子水得到m／z396．055 2。準分子離子峰失去一分子水［M－H2O－H］－得到m／z440．048 8和440．047 3。

圖2 二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－GlcNAc6S的1、2級質譜圖及裂解規律Fig．2 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNAc and△HexA－GlcNAc6S

不同之處是△HexA2S－GlcNAc存在3Y裂解得到m／z157．018 0，母離子2位亞硫酸根丟失后，失去一分子水得到m／z 360．090 2。而△HexA－GlcNAc6S存在0，2X1Y斷裂產生m／z198．993 0，0，2Z裂解產生m／z342．048 2。

2．3 二糖△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的負離子模式質譜分析

△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的質譜分析及裂解方式示于圖3。

△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS三個二糖互為同分異構體，準分子離子峰［M－H］－分別為m／z 416．045 7、416．046 0和416．046 2。在一級質譜中，由于只含1個亞硫酸根，產生的離子碎片較少，這3個二糖不存在鈉加合現象?！鱄exA2S－GlcNH和△HexA－GlcNH6S存在少量的0，2X方式裂解碎片離子，而△HexA－GlcNS不存在。

△HexA2S－GlcNH選擇m／z416．045 7進行二級裂解。母離子失去一分子水［M－H2OH］－得到m／z398．036 6。0，2X方式裂解得到m／z 357．011 9離子，0，2Z方式裂解得到m／z300．037 4。2位亞硫酸根斷裂同時0，2X裂解后，失去一分子水得到m／z 258．029 1。1Y裂解得到m／z 236．969，1，3Y方式斷裂得到m／z157．016 8?！鱄exA－Glc－NH6S選擇m／z416．046 0進行二級裂解，失去一分子水得到［M－H2O－H］－m／z398．035 5。發生0，2X裂解得到m／z357．012 2，失去一分子水得到m／z338．998 3，0，2Z方式斷裂得到m／z 300．038 1。6位亞硫酸根斷裂同時0，2X斷裂后，失去一分子水得到m／z 258．028 8碎片離子。0，2X1Y斷裂產生m／z198．993 7碎片離子。二糖△HexA－GlcNS選取m／z 416．046 2進行二級裂解，失去一分子水得到［M－H2O－H］－m／z398．035 2，失去亞硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z336．091 5。0，2Z方式斷裂得到m／z 300．039 5，1Y方式裂解失去一分子水得到m／z

137．990 2?！鱄exA2S－GlcNH和△HexA－Glc－NH6S的二級質譜主要區別在于，△HexA2SGlcNH存在3Y裂解方式，而△HexA－GlcNS存在特定的碎片離子m／z137．990 2。

圖3 二糖△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的1、2級質譜圖及裂解規律Fig．3 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S and△HexA－GlcNS

2．4 二糖△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的負離子模式質譜分析

△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的質譜分析及裂解方式示于圖4。

△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S三個二糖互為同分異構體，準分子離子峰［M－H］－分別為m／z496．002 7、496．003 1和496．002 2。二糖分子中含有2個亞硫酸根，使分子結構在質譜測定中不穩定，一級質譜中產生的離子碎片較多，鈉加合得到［M＋Na－H］－分別為m／z 517．983 4、517．984 5和517．984 4?！鱄exA 2S－GlcN 6S

失去1個亞硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z 416．046 1，同時0，2X裂解得到m／z357．011 2。已報道的N位亞硫酸根丟失，比2位、6位亞硫酸根裂解過渡態能壘低12．6～33．5kJ／mol［26］。因此，△HexA2S－GlcNS失去N位亞硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z416．047 0，接著0，2X裂解得到m／z357．011 2。同樣，△HexA－GlcNS6S失去N位亞硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z 416．047 0，0，2X裂解得到m／z 357．019 4?！鱄exA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S出現帶2個電荷的準分子離子峰［M－2H］2－m／z 247．497 9和247．497 8。而△HexA2S－GlcN6S二糖沒有出現，這可能與二糖游離氨基帶正電有關。

圖4 二糖△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的1，2級質譜圖及裂解規律Fig．4 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS and△HexA－GlcNS6S

△HexA2S－GlcNS的二級裂解選取m／z 357．013 2，失去一分子水［M1－H2O－H］－得

到m／z 339．004 9碎片離子。2，4X裂解產生［M1－C2H4O2－H］－m／z 296．994 3，3Y方式裂解得到m／z 157．016 2。雖然△HexA2SGlcNH6S和△HexA2S－GlcNS的母離子不同，但都存在3Y裂解方式?！鱄exA2S－GlcNH6S存在0，2X1Y裂解方式，而△HexA2S－GlcNS有1Y裂解方式?！鱄exA－GlcNS6S有3Y裂解，同時失去一分子水。

2．5 二糖△HexA2S－GlcNS6S和△HexA2S－Glc－NAc6S負離子模式質譜分析

△HexA2S－GlcNS6S和△HexA2S－GlcNAc6S的質譜分析及裂解方式示于圖5。

△HexA2S－GlcNS6S的一級質譜裂解方式較為復雜，準分子離子峰［M－H］－為m／z 575．962 4、鈉加合得到［M＋Na－H］－為m／z 597．944 4，亞硫酸根丟失［M－SO3－－H］－為m／z496．004 6，亞硫酸根丟失鈉加合離子碎片［M－SO3－＋Na－H］－為m／z517．986 6，0，2X裂解碎片為m／z 357．013 2。亞硫酸根丟失帶2個電荷離子碎片［M－SO3－－2H］2－為m／z 247．498 6，鈉加合現象明顯。

二級裂解0，2X裂解碎片離子為m／z 440．047 3，0，2X裂解同時丟失2個亞硫酸根，失去一分子水得到m／z259．042 2，3Y裂解碎片離子為m／z 157．016 6，1Y裂解碎片離子為m／z236．970 9。丟失1個硫酸根，0，2Z裂解得到m／z300．037 4；失去2個硫酸根，同時失去一分子水得到m／z 396．058 3，2Y裂解碎片離子為m／z342．048 7。

二糖△HexA2S－GlcNAc6S的準分子離子峰［M－H］－為m／z 538．013 1，一級質譜碎片較多，出現鈉加合峰m／z559．995 4。6位氧亞硫酸根裂解后得到m／z458．057 8，它的鈉離子加合m／z480．930 8接著失去一分子水，得到m／z 440．047 5，2個電荷離子峰［M－2H］2－為m／z 268．502 8。

圖5 二糖△HexA2S－GlcNS6S and△HexA2S－GlcNAc6S的1，2級質譜圖及裂解規律Fig．5 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNS6S and△HexA2S－GlcNAc6S

二級裂解6－位氧亞硫酸根斷裂，同時0，2X裂解失去一分子水得到m／z339．004 9，2，4X裂解得到碎片離子m／z 296．993 4，3Y裂解得到碎片離子m／z157．016 2。

通過計算12種硫酸類肝素二糖在負離子模式下理論m／z與測試m／z的偏差，可直觀了解質譜測試的精確度，結果列于表1。經計算，偏差范圍在－10．6×10－6～－3．0×10－6之間。

表1 硫酸類肝素二糖的質荷比及偏差Table 1 The m／z and error values of heparan sulfate disaccharide

一級質譜結果表明，含有2個和3個亞硫酸根的二糖都不穩定，易產生亞硫酸根的丟失。除△HexA2S－GlcNH6S外，其他二糖都帶2個電荷碎片離子?！鱄exA2S－GlcNS6S二糖含有3個亞硫酸根，在質譜測試中最不穩定。在一級質譜中，N位亞硫酸根最容易裂解，其次是6位氧亞硫酸根，2位氧亞硫酸根。此外，葡萄糖胺殘基出現環內斷裂。含有1個亞硫酸根的二糖，不論是氧位硫酸化還是N位硫酸化，質譜中的分子結構都比較穩定。在帶1個電荷狀態下，亞硫酸根丟失較多，帶2個電荷下，亞硫酸根丟失較少，亞硫酸根丟失是一個主要的裂解方式。二糖△HexA2SGlcN、△HexA－GlcNS6S和△HexA2S－GlcNS6S容易產生帶2個電荷的準分子離子峰［M－2H］2－，△HexA－GlcNS則沒有。N－乙?；恰鱄exA2SGlcNAc、△HexA－GlcNAc、△HexA2S－GlcNAc6S和△HexA－GlcNAc6S中只有△HexA2S－GlcNAc6S存在帶2個電荷的準分子離子峰，4個帶游離氨基的二糖則沒有，這說明高硫二糖容易出現帶2個電荷的準分子離子峰，同時還與電荷分布有關。

3 結論

分子電荷狀態和陽離子加合現象決定了硫酸類肝素質譜負離子模式中亞硫酸根丟失和糖骨架斷裂。在質譜測試中，二糖中亞硫酸根的位點和數量影響結構的穩定，所含亞硫酸根越多越不穩定。N位亞硫酸根比O位亞硫酸根更容易裂解，二級質譜測定中二糖結構斷裂有相似之處，但也有自身的特點。因此，在分析復雜的生物樣品時，可以利用二級質譜更精確地定性和定量分析同分異構體，這可為生物樣品糖組學的研究提供高精確度的分析手段。

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Study on the Fragmentation Patterns of Heparan Sulfate Disaccharides by ESI－MS

LIN Jiang－hui，ZHANG Jian－wei，ZHANG Hui－fang，GAO Jian－ping，WEI Zheng
（Institute of Glycobiochemistry，Fuzhou University，Fuzhou350002，China）

The structure of heparan sulfate determines its interaction with proteins，therefore the analysis of heparan sulfate can help further clarify structure and function relationships．The characteristic fragmentation pattern of twelve heparan sulfate disaccharide was discussed by electrospray ionization－ion trap mass spectrometry（ESI－MSn）in negative mode．The results show that the position and quantity of sulfate groups in disaccharide determine its stability in MS，moreover，C—2sulfate and C—6sulfate in disaccharide are more stable than N－sulfate．MS2revealed that the disaccharide isomers have a characteristic fragment pattern．The results may contribute to identify the disaccharides isomer of heparan sulfate，which can provide theoretical knowleage to identify the structural of heparan sulfate．

heparan sulfate disaccharides；structure；electrospray ionization－ion traptime flight mass spectrometry；fragmentation patterns

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0111－09

10．7538／zpxb．youxian．2014．0059

2014－03－10；

2014－06－02

國家自然科學基金（21343013）；國家基礎科學人才培養基金項目（1103303）資助

林江慧（1981—），男（漢族），福建寧德人，糖生物化學專業。E－mail：linjianghui＠fzu．edu．cn

魏 崢（1969—），女（漢族），福建福州人，教授，從事糖生物化學、分析化學研究。E－mail：weizheng＠fzu．edu．cn

時間：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0059．html