同位素稀釋－氣相色譜－三重四極桿串聯質譜法分析食用油中18種多環芳烴

許 婷，湯 樺，陳大舟，李 蕾

（1．北京化工大學環境有害化學物質分析北京市重點實驗室，北京 100029；2．中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京 100013）

同位素稀釋－氣相色譜－三重四極桿串聯質譜法分析食用油中18種多環芳烴

許 婷1，湯 樺2，陳大舟2，李 蕾1

（1．北京化工大學環境有害化學物質分析北京市重點實驗室，北京 100029；2．中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京 100013）

建立了同位素稀釋氣相色譜－三重四極桿串聯質譜測定食用油中18種多環芳烴的方法，同時對前處理過程中固相萃取柱的選擇、凈化條件及離子源溫度等條件進行了優化。樣品與環己烷以1∶1（V／V）混勻后，采用分子印跡固相萃取柱串聯石墨化碳黑柱濃縮與凈化，多反應監測掃描模式下進行質譜檢測。結果表明：線性范圍為1～200μg／kg時，該方法線性關系良好（R2＞0．999），檢出限為0．03～0．27μg／kg，定量限為0．10～0．89μg／kg；添加水平在5、10、50μg／kg時，前處理回收率為67．9％～100．8％，精密度（n＝3）為0．5％～8．7％。應用該方法檢測市場上常見的食用油，未發現食用油中多環芳烴含量超標的現象。該方法可靠性高、速度快、靈敏度高，可用于食用油中多環芳烴的準確檢測和標準物質定值。

同位素稀釋質譜（ID－MS）；多環芳烴（PAHs）；食用油；分子印跡固相萃取柱（MISPE）；氣相色譜－三重四極桿質譜（GC－MS／MS）

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類由2個或2個以上芳香環組成的，具有致畸、致癌、致突變性的一類有機化合物，屬于較為常見的食品和環境污染物［1］。在食用油中，多環芳烴從小環到多元環分布較為廣泛，長期攝入含有多環芳烴的食用油會危害人們的健康。目前，歐盟規定將食用油中苯并［a］芘與4種多環芳烴的總量（PAH4，苯并［a］蒽、屈、苯并［b］熒蒽、苯并［a］芘的總和）［2］作為食品中多環芳烴含量的指標，其限量分別為2μg／kg和10μg／kg。在我國則將苯并［a］芘作為食用油中多環芳烴含量的指標，其限量為10μg／kg。食用油基體復雜，含有甘油三酯、脂肪酸、游離自醇、石蠟等干擾物，且其中的多環芳烴含量較低，通常為痕量或超痕量級，因此，檢測難度大、檢測流程復雜，尤其是在樣品前處理過程中，降低檢查干擾物含量、提高檢測靈敏度已成為食用油中多環芳烴檢測迫切需要解決的問題。

檢測食用油中多環芳烴的前處理技術通常包括液液萃?。↙LE）［39］、超聲［10］、超臨界流體萃?。⊿FE）［11］、微波輔助萃?。∕AE）［12］、固相微萃?。⊿PME）［13］、凝膠滲透色譜（GPC）［10］、固相萃?。⊿PE）［3－9，14］等。其中，固相萃取因具有簡單、方便、節省時間等優點，被廣泛應用于前處理凈化中，但常見的固相萃取柱填料對食用油中多環芳烴的選擇性較差，凈化能力不完全。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）填料的發展使這一問題得到了改善。分子印跡聚合物對某個或某類化合物具有特異性選擇，目前正逐漸應用于固相萃取及固相萃取前處理技術中。分子印跡固相萃?。∕ISPE）［15］技術可以大幅提高對目標化合物的選擇性及分離效率，能同步完成前處理步驟的提取與凈化。但是，分子印跡技術的特異性強，對于由2～6個不同個數的芳香環組成的多環芳烴的選擇和凈化效果差別較大，仍具有一定的局限性。目前，用于多環芳烴分子印跡柱的填料只能對部分四元環及其以上的多環芳烴具有較好的選擇性，而對小環多環芳烴的選擇性則較差，這是將分子印跡技術應用于食用油中多環芳烴檢測的較大障礙。

食用油中多環芳烴的檢測方法主要有液相色譜法（LC）［3，11］、氣相色譜－質譜法（GC／MS）［4，7，10，14］、氣相色譜－三重四極桿串聯質譜法（GC－MS／MS）［8］等。相比其他技術，GCMS／MS在多反應監測離子掃描（MRM）模式下，具有更高的靈敏度和選擇性，能更大程度地排除基體干擾和基質效應。

本研究采用分析印跡固相萃取柱串聯石墨化碳黑柱對樣品提取與凈化，建立同位素稀釋－氣相色譜－三重四極桿質譜同時測定食用油中18種多環芳烴的檢測方法，旨在為食用油中多環芳烴的準確檢測和標準物質定值提供參考。

1 實驗部分

1．1 儀器裝置與試劑材料

Trace GC氣相色譜（配有AS3000自動進樣器）、TSQ Quantum XLS三重四極桿質譜儀：美國Thermo－Fisher公司產品；DB－EUPAH氣相毛細管色譜柱（20m×0．18mm×0．14μm）：

美國J＆W公司產品；XS205電子天平（最大量程為81g，分辨率為0．01mg）、UMX5高精密度分析天平（最大量程為5．1g，分辨率為0．1μg）：瑞士Mettler Toledo公司產品；Vortex－Genie2T斡旋混合器：美國Scientific Industries公司產品；N－EVAPTMⅢ氮吹儀：美國Oganomation Associates公司產品；Visiprerptm DL固相萃取裝置、SupelMIPTMSPE－PAH固相萃取柱（0．5mg／1mL）、SupelCarbTMSPE固相萃取柱（1g／6mL）：美國Supelco公司產品。

環己烷、異辛烷、乙酸乙酯（色譜純）：美國Fisher Scientific公司產品；丙酮（色譜純）：美國J．T．Beaker公司產品。16種US EPA PAHs標準混合溶液：由中國計量科學研究院提供；二苯并［a，i］芘、二苯并［a，e］芘（DBaeP）標準品：德國Dr．Ehrenstorfer GmbH公司產品；16種多環芳烴同位素內標：由美國Cambridge Isotope公司提供，其中，D14－二苯并［a，i］芘為D8－甲苯作為溶劑的200mg／L標準溶液，13C6－DBaeP為正壬烷甲苯溶液（80∶20，V／V）作為溶劑的100mg／L標準溶液；D10－蒽：美國ACROS Organics公司產品；D12－苯并［a］蒽：德國Dr．Ehrenstorfer GmbH公司產品。所有標準品的純度均在98％以上。

食用油：購自北京超級市場；空白油樣：為對市場上的食用油進行篩選測定后，選出不含有18種多環芳烴或含量低于2μg／kg的食用油樣品。

1．2 實驗條件

1．2．1 色譜條件 載氣（He，純度＞99．999％）流速：1．0mL／min，保持10min，再以5mL／min升至1．7mL／min；進樣口溫度300℃，不分流進樣；進樣量1μL；程序升溫：初始溫度70℃，保持1min，以30℃／min升至200℃，再以3℃／min升至225℃，然后以4℃／min升至266℃，再以5℃／min升至300℃，最后以10℃／min升至320℃，保持10min。

1．2．2 質譜條件 電子轟擊離子源（EI源）；離子源溫度280℃；電子能量70eV；燈絲發射電流35μA；電子倍增檢測器電壓1．7kV；碰撞氣（氬氣）壓力0．160Pa；傳輸線溫度300℃；四極桿分辨率：Q1、Q3均為0．7。檢測方法：在MRM模式下，針對18種PAHs設定不同的檢測窗口，分別測定其離子強度。相應的檢測參數列于表1。

表1 18種多環芳烴的保留時間和選擇離子反應監測條件Table 1 The retention time and SRM parameters of 18 PAHs

1．3 樣品處理

1．3．1 樣品制備 在0．5mL食用油中加入0．5mL 10μg／kg的18種多環芳烴內標混合溶液，以環己烷作為溶劑，準確稱量，渦旋1min，保證食用油與溶劑及內標充分混合。

1．3．2 固相萃取 用3mL環己烷對串聯固相萃取柱活化，串聯時，分子印跡柱在上，石墨化碳黑柱在下，柱子保持濕潤狀態。上樣1mL，控制流速，用3mL環己烷淋洗，除去食用油中的雜質，使用空氣泵將柱子抽至近干，將串聯柱的位置調換，即分子印跡柱在石墨化碳黑柱下面，用干凈的安瓿瓶接收洗脫液，用8mL甲苯乙酸乙酯溶液（5∶95，V／V）洗脫目標化合物，將串聯固相萃取柱抽干。

1．3．3 氮吹濃縮 在40℃水浴溫度下溫和氮吹，濃縮至200μL后，轉移至2mL小樣品瓶中，上機檢測。

1．4 實驗質量控制

研究過程中發現，小環多環芳烴（2～3個環）在實驗器皿中及固相萃取柱上均有殘留，由于食用油中多環芳烴的含量較低，因此對廣泛存在于實驗室中的小環多環芳烴進行干擾排除和空白監測就顯得尤為重要。在實驗過程中，所用的器皿均水洗烘干后，再用丙酮潤洗，實驗前再用環己烷潤洗。石墨化碳黑柱用15mL甲苯少量多次洗滌，分子印跡柱采用6mL環己烷少量多次洗滌，且所用試劑均為色譜純。對于玻璃器皿，400℃焙烘10h后備用，使用前用丙酮潤洗。測定樣品的同時進行全程空白實驗，進行比較和扣除。

2 結果與討論

2．1 前處理條件的優化

2．1．1 固相萃取柱的選擇 分子印跡固相萃取柱與傳統固相萃取柱相比，具有選擇性高、特異性強等特點。因此，采用多環芳烴分子印跡固相萃取柱對食用油中的多環芳烴進行提取與凈化，能夠特異性識別多環芳烴，有效去除基體中的雜質。將分子印跡柱應用于本研究的18種多環芳烴的凈化，能夠較好的保留大環多環芳烴，回收率均在73％～95％之間，結果示于圖1。但對于小環多環芳烴（2～3個環）和萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽及部分4個環的多環芳烴（即熒蒽、芘）的選擇性則較差，回收率為19％～51％。

石墨化碳黑固相萃取柱填料的平面片層結構對大環多環芳烴具有永久性吸附作用，但卻可以成功地吸附保留上樣及淋洗過程中損失的小環多環芳烴，使用適當的溶劑可將一定量的小環多環芳烴洗脫下來。因此，本研究使用石墨化碳黑固相萃取柱串聯分子印跡固相萃取柱對食用油中18種多環芳烴進行提取與凈化。

2．1．2 固相萃取凈化方式的優化 與傳統的固相萃取凈化方式相同，本研究的串聯固相萃取柱提取與凈化步驟包括活化固相萃取柱、上樣、淋洗雜質、洗脫目標化合物?？紤]到石墨化碳黑柱對大環多環芳烴具有永久性吸附的作用，因此串聯時分子印跡柱與石墨化碳黑柱的相對位置會對結果產生較大影響。

圖1 分子印跡固相萃取柱（MISPE）及串聯固相萃取柱對18種多環芳烴回收率的比較Fig．1 The recoveries of 18 PAHs on MISPE and coupled columns

采用3mL環己烷對固相萃取柱進行活化，將分子印跡柱置于石墨化碳黑柱上方，上樣1mL后，采用3mL環己烷淋洗［16］，除去油脂

等雜質。使用空氣泵將串聯柱抽真空至近干，同時調換固相萃取柱的位置，使分子印跡柱置于石墨化碳黑柱下方，采用8mL甲苯乙酸乙酯溶液（5∶95，V／V）將目標化合物洗脫下來，濃縮后上機檢測。結果表明，采用分子印跡柱串聯石墨化碳黑柱提取和凈化時，18種PAHs回收率在72％～105％之間。小環多環芳烴及個別4元環芳烴的回收率有所提高，且整體回收率均有提高的趨勢，這是由于在上樣和淋洗時，串聯固相萃取柱比單獨分子印跡柱的流速慢，使得目標化合物能很好的吸附于固相萃取柱上，達到更好的提取目的。

2．1．3 濃縮過程的優化 前處理中最后一步、也是重要的一個步驟為氮吹濃縮過程。當沒有基質化合物吸附多環芳烴時，氮吹至近干的濃縮過程會引起小環多環芳烴78％～98％的損失及部分4元環芳烴（如熒蒽、芘、苯并［a］蒽、屈）20％～48％的損失。為了減少小環多環芳烴的損失，氮吹濃縮過程在40℃水浴中，溫和平緩吹至200μL，這樣可將多環芳烴在氮吹時的損失控制在4％以內。

2．2 GC－MS／MS條件的優化

2．2．1 掃描時間的優化 掃描時間的縮短可以使色譜峰上掃描點數增加，使峰型更加平滑。但掃描時間過短，會使質量軸發生偏差，導致不能很好的選擇定性與定量離子。以苯并［a］芘為例，掃描時間過短時（0．067s），質量軸偏差了m／z0．25。因此，本研究最終將掃描時間設定為0．10s，此時的靈敏度及峰型均能達到較佳狀態。

2．2．2 進樣口溫度和離子源溫度的優化 在儀器優化過程中發現，進樣口溫度較高會降低小環多環芳烴的響應強度，但卻可以增加大環多環芳烴的響應強度。因此，本研究對比了進樣口溫度分別為260、280、300℃時苯并［a］芘的響應強度，每個溫度條件下連續進樣3針后取平均值，根據所得色譜圖的響應強度可知，當進樣口溫度為300℃時，苯并［a］芘有相對較強的響應值，因此，最終選擇300℃作為進樣口溫度。

除進樣口溫度外，離子源溫度也會對不同多環芳烴的響應強度產生影響。本研究考察了離子源溫度為260、280、300℃時苯并［a］芘的響應值，每個溫度條件下連續進樣3針后取平均值，根據所得色譜圖的響應強度可知，隨著溫度的升高，苯并［a］芘的響應強度增強，當離子源溫度升高至300℃時，苯并［a］芘的相對響應值最強。但在實驗中發現，離子源的加熱棒在300℃時較易損壞，且會加速離子源老化，因此選擇280℃作為分析過程中的離子源溫度。

圖2 更換襯管前后對18種多環芳烴重復性的影響Fig．2 Effect of lined tube replacement on the RSD of 18 PAHs

2．2．3 襯管對儀器精密度的影響 襯管，尤其是應用于基質樣品分析后的襯管，長期使用不僅會降低儀器的靈敏度，還會影響儀器的精密度。實驗對比了使用4個月后與新更換的襯管對儀器精密度的影響，結果示于圖2?？梢钥?/p>

出：換襯管前，使用各個目標化合物的峰面積來計算的RSD為16％～35％，以目標化合物與相應內標峰面積的比值計算重復性時，RSD為1％～15％；更換新襯管后，精密度明顯提高，以峰面積考察時，RSD為2％～15％，比值考察重復性時，RSD為0．3％～9％。同時，在優化前處理過程中發現，以苯并［a］芘為例，襯管使用5個月后，或進樣600針以后（包括300針左右的基質溶液和300針的標準溶液），靈敏度降低了68．4％，此時應更換襯管。

2．3 方法驗證

2．3．1 標準曲線及檢出限 采用稱量法分別配制濃度為1、2、5、10、20、50、100、200μg／kg的系列標準溶液，以各物質的質量濃度為橫坐標，各物質定量離子響應的峰面積與相應內標響應的峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，各物質線性關系良好，相關系數R2均大于0．999。以3倍信噪比計算最小檢出限（LODs），18種多環芳烴的LODs為0．03～0．27μg／kg；以10倍信噪比計算方法定量限（LOQs），LOQs的范圍為0．10～0．89μg／kg，詳細結果列于表2。

2．3．2 前處理過程的回收率和精密度 取空白油樣樣品，分別添加濃度相當于5、10、50μg／kg的18種多環芳烴混合標準溶液，上機前加入混合同位素內標溶液，得到相應的回收率。在該濃度添加水平下，18種多環芳烴的回收率為67．9％～100．8％。按優化的方法分別對3種不同添加濃度的樣品進行檢測，每種添加濃度的樣品重復測定3次，結果列于表3。結果表明，在高、中、低3個濃度添加水平下重復測定3次所得的18種多環芳烴的精密度為0．5％～8．7％。

2．4 實際樣品檢測

采用本實驗的方法測定從市場上采集的4種食用油中的多環芳烴，包括菜籽油、橄欖油、大豆油、花生油，每個樣品平行測定3次，結果列于表4。結果表明，所采集的4種食用油中的多環芳烴中，苯并［a］芘的含量均小于2μg／kg，符合我國對食用油中多環芳烴限量的要求；且除二苯并［a，e］芘、二苯并［a，i］芘未檢出外，其他16種多環芳烴的方法精密度（n＝3）為0．73％～8．11％。

表2 18種多環芳烴的線性方程、檢出限與定量限Table 2 Linear equation，LODs and LOQs of the 18 PAHs

表3 18種多環芳烴的回收率及精密度Table 3 Recovery and relative standard deviation（RSD）of spiked edible oil

表4 實際樣品中多環芳烴的含量檢測Table 4 PAHs concentrations in edible oil samples collected at the Beijing market

3 結論

采用同位素稀釋氣相色譜－三重四極桿質譜法測定食用油中18種PAHs。食用油樣品與環己烷混勻后，添加同位素稀釋劑，通過分子印跡固相萃取柱串聯石墨化碳黑柱提取與凈化后，進行濃縮，多反應選擇離子掃描方式檢測，可以在很大程度上排除基質的干擾，能顯著提高測定的選擇性和靈敏度。該方法簡單、準確、可靠、靈敏度高，可用于食用油樣品中痕量PAHs的準確檢測和標準物質定值。

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Determination of 18 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Edible Oils by Isotope Dilution GC－MS／MS

XU Ting1，TANG Hua2，CHEN Da－zhou2，LI Lei1
（1．Beijing Key Laboratory of Environmentally Harmful Chemical Analysis，Beijing University of Chemical Technology，Beijing100029，China；2．Division of Metrology in Chemistry，National Institute of Metrology P．R．China，Beijing100013，China）

A method for the determination of 18PAHs in edible oils was developed by ID－GC－MS／MS．The oil samples were mixed with cyclohexane in the ratio of 1∶1（V／V）and then cleaned up by molecularly imprinted solid－phase extraction（SPE）catridge coupled to graphitized carbon blacks solid－phase extraction cartridge．Identification and quantification were performed using GC－MS／MS in MRM mode．In the method，the pre－treatment and GC－MS／MS conditions were optimized，such as the selection of SPE columns，clean－up conditions on the tandem columns，the temperature of the ion

isotope dilution mass spectrometry（IDMS）；polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）；edible oil；molecularly imprinted polymers solid－phase extraction（MISPE）；gas chromatography－tandem mass spectrometry（GC－MS／MS）

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0120－08

10．7538／zpxb．youxian．2014．0053

2014－03－11；

2014－04－26

國家質檢總局“雙打”重點產品檢驗鑒定技術方法驗證評價項目（2012104001）資助

許 婷（1988—），女（漢族），江蘇人，碩士研究生，化學專業。E－mail：xuting1477＠126．com

李 蕾（1962—），女（漢族），福建人，教授，從事物理化學和環境痕量分析化學研究。E－mail：lilei＠mail．buct．edu．cn

時間：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0053．html

source．The method shows satisfactory linearity（R2＞0．999）over the range assayed（1－200μg／kg），and the LODs range from 0．03to 0．27μg／kg，and the LOQs range from 0．10to 0．89μg／kg．The pre－treatment recoveries using this method at three spiked concentration levels（5，10，50μg／kg）range from 67．9％to 100．8％．The RSD is in the range of 0．5％－8．7％．The proposed analytical method has been successfully applied for the analysis of 18PAHs in edible oils obtained from Beijing market．The results indicate that all the detected edible oil samples meet the requirement of China and EU regulation．This indicates that the developed method is suitable for the simultaneous determination and valued of 18PAHs in edible oils．