縫隙連接蛋白及其在牙髓組織中的表達和作用

閆勝男, 劉富萍, 李 賀, 王舒煜, 張 琦 綜述; 張志民 審校

(吉林大學口腔醫學院, 吉林 長春 130000)

縫隙連接蛋白及其在牙髓組織中的表達和作用

閆勝男, 劉富萍, 李 賀, 王舒煜, 張 琦 綜述; 張志民 審校

(吉林大學口腔醫學院, 吉林 長春 130000)

縫隙連接作為電突觸的結構基礎及相鄰細胞間的通訊通道，近年來倍受關注, 其主要組成蛋白——縫隙連接蛋白參與了多種疾病的發生發展，從而為預防和治療疾病提供了重要的依據。本文就縫隙連接蛋白及其在牙髓組織中的表達和作用作一綜述。

縫隙連接蛋白; 縫隙連接; 炎癥; 牙髓組織

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.12.013

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(12): 754]

縫隙連接蛋白(connexin,Cx)廣泛存在于哺乳動物的細胞內，目前已發現的人類基因編碼的Cx有21種亞型，主要根據其分子量大小進行命名，如分子量為26、32、43 KD者，則命名為Cx26、Cx32、Cx43[1]。Cx除參與細胞自身的生長、分裂、分化及凋亡等過程外，其所介導的縫隙連接通道(gap junction channel,GJC)在調節細胞間的信息交流過程中也有重要作用。臨床上很多研究均發現，Cx可調節基因的表達及細胞遷移，與細胞生長、分化、創面愈合、瘢痕形成、心血管疾病、腫瘤及神經系統等多種疾病的發生密切相關。目前，關于Cx與牙生長、發育及齲損發生發展等的關系在國外已有初步研究，國內尚未有這方面的報道。本文就Cx及其在牙髓組織中的表達和作用作一綜述。

1 縫隙連接(gap junction，GJ)概述

1.1 GJ的結構

GJ是指相鄰細胞間的跨膜通道，其所構成的細胞縫隙連接通訊(gap junction intercellular communication, GJIC)能夠調節各種生理過程。自Robertson[2]于1963年首先詳細描述了細胞間存在著一個呈六角形排列的格子(lattice)，即縫隙連接以后，許多學者都對其結構和功能進行了大量研究，到上世紀80年代對GJ的認識已相當深入。GJ由一對連接小體(hemichannel)組成，兩個連接小體分別貫穿于相鄰細胞相對的細胞膜中，每個連接小體均由6個連接蛋白(connexin)分子聚合而成(6個鏈接蛋白分子呈環行排列，并在中間形成小孔)。6個相同的連接蛋白可組成連接小體的同源聚合體，而6個不同的連接蛋白則可組成連接小體的異源聚合體。一對連接小體相互對合，即可利用各自的小孔共同構成孔道結構，即縫隙連接通道，可允許小分子物質和離子自由進出[3]。Cx及其介導的縫隙連接結構如圖1[4]所示。

連接蛋白分子結構包括4個跨膜區域，4個細胞外環(EL1～2)和1個細胞內環(CL)，兩端分別是胞內側的氨基(NT)和羧基(CT)

圖1 Cx及其介導的縫隙鏈接結構

1.2 GJ的功能

GJ可在細胞間傳遞離子、小分子等代謝物質及次級信使，且具有傳導快、低阻抗、延擱時間短等特點。近期研究發現，GJ并不僅是細胞間物質傳遞的通道，除參與細胞間活動的協調、信息傳遞以及神經脈沖的傳導生成、蔓延和調控過程外，還可過濾電信號，與細胞的代謝和分化、物質的運輸和電興奮的傳導等均有密切關系；其在胚胎發育、形態發生、組織再生及腫瘤中均起著重要的作用[3，5]。目前已證實，采用化學方法抑制GJIC的功能后，可影響細胞周期；在小鼠脂肪細胞培養中使用GJ阻滯劑18-α甘草次酸、庚醇或生胃酮時，能抑制克隆過程中的細胞有絲分裂過程；在人類肺成纖維細胞培養中使用順鉑，則可誘導GJC在細胞的 G1/S 期時關閉，從而使p53表達增多并誘導細胞早衰[4]。

2 Cx的作用

2.1 Cx的結構

Cx是一種跨膜蛋白，首先在細胞的內質網中合成并在高爾基體聚合成半通道，然后再通過高爾基體轉運至細胞膜。目前在哺乳動物體內已發現的Cx有20余種亞型，它們共享1個分子結構，即4個跨膜區域、2個細胞外環和1個細胞內環，兩端分別是胞內側的氨基和羧基，通常在細胞膜的特定區域以六聚體形式形成GJC及連接蛋白半通道，并允許分子量小于1 KD 的小分子物質如 Ca2+、NAD+、ATP等自由通過，從而形成縫隙連接的細胞間通訊功能(GJIC)[4-6]。

2.2 Cx的非通訊功能

臨床研究發現，Cx43表達可影響縫隙連接的形成和功能，如Cx43表達上調可增強縫隙連接的通訊功能[7]。目前已證實，Cx43在心肌缺血預處理中有心肌保護作用[1]。近年來，對Cx家族的研究范圍已經擴展到心臟以外的其他器官。臨床研究表明，在腫瘤(如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和其他癌癥)的組織中，可觀察到Cx的表達缺乏或異常，根據已有的相關研究成果猜測，Cx可通過傳輸信號分子及調節細胞增殖、遷移和凋亡而抑制腫瘤的生長，并認為這種對癌癥的影響行為可能取決于Cx本身，而不是細胞間的耦合[8]。有學者將新生小鼠的純化施萬細胞與坐骨神經膠質生長因子2(GGF2，Nrg1的同種類型)共同培養時發現，在初代培養中可見Cx32表達上調；若敲除小鼠施萬細胞中的Cx32基因，則僅對促進細胞有絲分裂的GGF2因子有較小的回應，也未增加施萬細胞間的電耦合[5]。以上結果說明，Cx32的表達異常與否與細胞分裂有直接作用，并進一步證實Cx本身對癌癥有影響作用。另有研究發現，阻止Cx43表達能降低小鼠P19癌細胞系神經元的發育成熟速度，表明Cx43在神經系統成熟中起核心作用[9]。目前已明確，Cx43除對大腦細胞的遷移有影響作用，還能加速傷口肉芽組織的形成和重塑，從而促進組織愈合[2]。

2.3 Cx在炎癥中的作用及可能的機制

炎癥是一系列復雜的病理過程，包括細胞因子、生長因子、趨化因子的釋放，以及中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等炎細胞由血液向組織間隙的遷移，這些過程均需要細胞間通訊功能的協調和參與，而縫隙連接所形成的跨膜通道則可為鄰近細胞提供直接的物質信息交換途徑[10]。在缺氧環境、細胞因子和其他因素的作用下，有學者假設線粒體Cx43可激活白細胞并使活性氧ROS大量生成。大量ROS可以激活氧化還原反應敏感的信號轉導通路和轉錄因子,使之參與炎癥反應的始動。這些轉錄因子包括NF-KB、activator protein(AP)-l, 它們可通過對粘附分子和炎癥性細胞因子進行調控而引起基因表達編碼蛋白，以適應機體的缺氧和炎癥反應；而炎癥反應又可激活內皮細胞、白細胞、血小板，從而使這些活化的細胞通過表達粘附分子和促炎癥反應因子引起內皮細胞的損傷和功能障礙[11-12]。以上過程可能就是Cx43的表達在炎性疾病中的作用機理。

3 Cx與牙髓組織

3.1 牙髓組織

牙髓是來源于外胚間葉的疏松結締組織，位于牙本質所形成的髓腔內，具有形成牙本質、營養、感覺、防御和修復等功能。牙髓組織中含有細胞、神經、血管、淋巴管和其他細胞外基質，可分為4層，即靠近牙本質的成牙本質細胞層、緊鄰成牙本質細胞層的乏細胞層(又稱Weil層)、無細胞內側的多細胞層和牙髓中央區的固有牙髓(也稱髓核)。牙髓中的細胞主要有成牙本質細胞、成纖維細胞、組織細胞、未分化間充質細胞及樹突狀細胞等[13]。其中，成纖維細胞是牙髓中的主要細胞，故又稱牙髓細胞，具有合成膠原蛋白、膠原蛋白酶、蛋白聚糖及糖胺聚糖等功能。當前期牙本質受到刺激時，牙髓多細胞區的成纖維細胞(dental pulp fibroblasts，DPFs)可分化為成牙本質細胞并形成修復性牙本質[14]；若刺激進一步加重，則可使牙髓組織充血，甚至發展為牙髓炎；當牙髓由于感染等發生炎癥時，則難以完全的修復性再生，這對臨床牙髓病的治療具有參考價值[13]。

3.2 Cx在牙髓組織中的表達及定位

Koling等[15]采用冷凍斷裂實驗及電子顯微鏡觀察發現，GJ存在于成牙本質細胞間及成牙本質細胞與鄰近成牙本質細胞層的細胞間。大量GJ可通過提供細胞間信號分子通道，以維持統一的細胞活動，并使之形成均勻一致的前期牙本質層，在牙齒發育過程中起重要作用[13]。Beyer等[16](1989)研究發現，Cx43在成纖維細胞中有表達。近年來有研究發現，成纖維細胞中除表達Cx43外，還有其他Cx的表達。Fried等[17]采用免疫組化的方法研究時發現，老鼠牙髓組織在發育過程中及受傷時均有Cx26、Cx32、Cx43的表達；在早期分化階段，即成釉細胞合成和分泌釉基質蛋白時有Cx32和Cx43的表達，其中Cx32主要在上皮細胞中表達，而Cx43則廣泛分布于上皮細胞和間充質細胞中，并同時還表達于分化期和功能型(即能分泌牙本質基質)的成牙本質細胞中。而在成年老鼠的牙中，僅觀察到Cx26和 Cx43在成牙本質細胞層呈或低或高水平的表達，并未發現有Cx32的表達。

3.3 Cxs在牙髓組織中的作用

Cxs是以分子量為基礎命名的跨膜蛋白家族，在不同的組織中均有表達，最初以形成細胞間通道——縫隙連接而聞名。GJ所介導的細胞間通訊功能在維持和調節正常牙體組織生長過程中有重要作用[17]。Fried等[18]報道，在老鼠牙髓的發育期、發育完成期及病理狀態下均有Cx的表達，說明Cx可能與牙髓組織的生長、發育及病理生理等過程有關。Ibuki N等[14]研究發現，在牙髓組織中有Cx32和Cx43的雙重表達，特別是在多細胞區的DPFs中Cx32表達更強烈；從而可推測：牙髓多細胞區的DPFs可產生一些蛋白質并能誘導牙髓多細胞區的細胞分化為成牙本質細胞,而Cx32在多細胞區的高表達則說明其可保護牙髓組織免受來自牙本質小管的各種刺激,以防齲損的發生。Centeno等[17]通過控制幼鼠飲用水中的氟濃度以模擬氟斑牙的形成，經半定量RT-PCR技術和堿性磷酸酶活性測定發現，氟能改變小鼠切牙牙髓組織中不同類型Cxs的表達水平及堿性磷酸酶(ALP)活性；提示，相關Cxs的表達可能參與調整離子和小分子物質在細胞間傳遞的滲透率，并通過控制和維持體內蛋白質的基因表達平衡來適應體內氟含量的增高，從而影響牙的礦化。

3.4 Cx43

目前，研究Cx43相關的報道較多。Imad About等[19]研究發現，在牙發育中，Cx43主要定位于上皮細胞和間葉細胞，并與細胞的分化程度相關。Cx43在正常恒牙的成牙本質細胞及其分化過程中均有表達，而在齲損的成牙本質細胞中的表達量則明顯上調，說明其可能與修復性牙本質的形成有關?，F已證實，Cx43介導的縫隙連接在硬組織形成過程中起重要作用，它們在組織發育過程中可允許小于1.2 KD的小分子包括細胞內Ca2+自由通過。有研究發現，Cx43的表達上調先于牙的發育及骨的形成，若在小鼠胚胎時期禁止Cx43的表達，則可導致所有類型骨的發育和礦化且出現嚴重缺陷，并可使牙的發育和萌出延遲；提示，Cx43在骨髓、牙髓干細胞的分化及礦化過程中起著重要的作用[20]。

Murakami等[21](2001)研究發現，Cx43在小鼠切牙的成牙本質細胞和牙髓細胞中均有表達，表明Cx43在年輕成牙本質細胞中高度表達。Murakami[22]采用免疫電鏡檢測成牙本質細胞中的Cx43時發現，在細胞胞體間及細胞代謝過程中均存在由Cx43介導的縫隙連接；同時還發現，這種結構只存在于成牙本質細胞的代謝過程中，而在施萬細胞或神經纖維中則未發現此結構。近年來有學者還發現[23]，Cx43在細胞循環中可能是一種負調節蛋白，可通過其負調節作用而抑制細胞的過度繁殖。另有研究發現，老鼠牙髓組織細胞間所存在的由Cx43介導的GJ與堿性磷酸酶活性有關，當牙本質敏感及疼痛時，成牙本質細胞中有Cx43的表達并伴隨有信號傳導及ATP釋放；說明Cx43在牙髓激惹狀態中有重要作用，并可作為牙髓細胞生長、分化及磷酸酶活性等的標志[24-25]。

4 小結

GJ是細胞間物質交換特有的跨膜通路，Cx作為組成此通路的主要蛋白近年來備受關注，并在不同組織和器官中均發現有不同類型的Cx的存在；而且其表達異常與生長、發育及多種疾病的發生發展相關。關于Cx與疾病的關系，在心肌缺血及腫瘤方面的研究較多，并發現Cx在參與疾病發生發展的過程中有不同的機制。迄今為止，已有國外學者發現牙髓組織中也含有Cx43、Cx32和Cx26，并發現這些Cx與牙髓組織的發育、分化及病理生理過程關系密切。但關于Cx是否參與牙髓炎癥的發生、發展及其具體作用機制，目前尚未有學者研究報道，如果能明確Cx的作用機制，將會在攻克牙髓炎方面邁進一大步。

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Connexin proteins and research progress on connexins of dental pulp

YAN Sheng- nan, LIU Fu- ping, LI He, WANG Shu- yu, ZHANG Qi, ZHANG Zhi- min

(SchoolandHospitalofStomatology,JilinUniversity,Changchun130000,China)

Gap junction has attracted more and more attention in recent years because it plays the basic roles in electrical synapse structure and intercellular channel of communication. Connexins, the main composite proteins of gap junction, have been reported to be involved in the development of many diseases. This article reviews the research progress on connexins and the relationship between connexins and dental pulp.

connexin; gap junction; inflammation; dental pulp

2015-03-31

國家自然基金項目(81170945)

閆勝男(1989-)，女，漢族，河南商丘人。碩士生(導師：張志民)

張志民，E-mail：zhangzm1964@sina.com

R780.2

A

1005-2593(2015)12-0754-04