肺炎支原體實驗室診斷研究進展

李冬梅

天津市河北區婦女兒童保健中心檢驗科　300142

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肺炎支原體實驗室診斷研究進展

李冬梅

天津市河北區婦女兒童保健中心檢驗科300142

摘要肺炎支原體是呼吸道感染的主要炎癥，近幾年，我國臨床實驗室對肺炎支原體的病因進行了研究，發現在患者的呼吸道感染中，肺炎支原體的發病率呈上升的趨勢。據統計資料顯示，我國的肺炎支原體患者的發病率占患有肺炎的13%~20%，其發病率以兒童多見。本文首先肺炎支原體進行概述，然后分析了肺炎支原體病變的特征，接著敘述了肺炎支原體的實驗室檢測以及診斷方法，最后根據其診斷方法進行了研究。

關鍵詞肺炎支原體實驗室診斷研究進展

目前，肺炎支原體是非典型肺炎的主要病因之一，是引起呼吸道感染的主要炎癥，兒童發病率較為常見。近幾年，成年人肺炎支原體的發病率也隨之增加，據統計顯示，在肺炎支原體發病率中，成年人的感染率迅速增加。但是肺炎支原體與其他病原體感染的肺炎，差別不大，并且對治療肺炎和呼吸道感染的一般藥物具有一定的耐藥性。所以，實驗室對肺炎支原體進行準確的診斷，對于治療肺炎支原體有著非常重要的意義。

1肺炎支原體概述

肺炎支原體是一種缺少細胞壁，而且在形態上具有多形性，并可以通過除菌濾器，在沒有生命的培養基中可以繁殖最小的原核細胞微生物，而無細胞壁只有細胞膜，呈革蘭染色陰性，形狀一般為細絲狀。支原體的黏膜作用以及免疫應答影響著支原體的感染發病機制。支原體是通過滑行運動的方式到黏膜組織內，通常隱藏在細胞間的隱窩內，因為支原體具有特殊的結構，主要結構有粘附因子，可以利用粘附因子粘附在細胞表面，它是一種蛋白，這種蛋白是一種免疫原，它可以促使體內機體發生免疫應答，是對支原體進行診斷的一種重要的抗原體。

肺炎支原體是呼吸道感染的主要炎癥，通過呼吸道飛沫進行傳播的，除了引起肺炎等呼吸道疾病之外，還可能會引起其他的并發癥，例如腦膜炎、脊髓炎、心包炎、腎炎以及腦干炎等[1]。據相關統計分析，肺炎支原體每3~5年流行1次，主要在不同群體中流行，發病特點表現為間接性，而且時間長，播散緩慢，在地區中流行的時間可持續為幾個月甚至長達1年，有時候還能造成爆發性流行。全年均有發病的現象，但在冬季發病相對率較高。

對肺炎支原體的臨床治療可選擇：(1)對微生物蛋白質合成的大環內酯類抗生素進行干擾和抑制；(2)在核糖體30S中，阻止肽鏈的延伸與蛋白質的合成，對DNA復制的四環抗生素進行抑制；(3)在核酸DNA中，對其復制的喹諾酮類抗生素進行抑制[2]。

2肺炎支原體的病變

肺炎支原體的病變主要在肺部出現，有漿液纖維素性胸膜炎變化，在胸腔中積液時會有纖維性滲出物出現，導致支氣管和縱隔淋巴結腫大、充血甚至出血。據有關報道，肺炎支原體還可以導致體內器官功能不全，因此應加強對肺炎支原體的重視[3]。肺炎支原體的病變主要體現在心肌乏力或心包積液。其病程長的患者肺部的病變尤為明顯，表現為組織增生，甚至還會出現包囊化的壞死灶。肺炎支原體組織的病變在不同程度上會呈現不同的變形性顆粒與不同的脂肪變性等，肺門淋巴結甚至會出現反應性的增生；皮組織有萎縮現象，出現纖維素性肺炎支原體和淋巴細胞性肺炎支原體等，這些典型的病例會呈現多方面的變化。

3對肺炎支原體進行實驗室檢測

3.1分離培養目前世界衛生組織推薦的對支原體感染診斷的標準方式就是培養肺炎支原體的分離方式。支原體的基因很小，新陳代謝能力緩慢，所以繁殖相對來講較為緩慢，每2~6h繁殖1次；其繁殖離不開葡萄糖和膽固醇；經過重復繁殖，繁殖后形狀類似“荷包蛋”，顯示為陽性。對肺炎支原體分離采用的一般的培養方式，是利用痰、肺泡沖洗液、咽拭子以及胸腔積液，在培養基上對肺炎支原體進行分離培養，但因為支原體沒有合成的能力，培養系統應發揮其作用進行添加促進其合成的物質，例如脂肪醇等物質。但是這種方式的不足點是靈敏度不高，而且培養的時間比較長，一般在20d左右，技術的要求性比較高，不能達到快速診斷的目的，所以在臨床中采用這種方式較少[4]。

3.2直接檢測直接檢測采用的方式一般為免疫熒光方法，先取患者呼吸道分泌物，再采用鼠抗人單克隆抗體，以及異硫氰酸熒光素對羊抗鼠標記的抗體對支原體進行檢測，通過利用顯微鏡觀察細胞內被標記的支原體有沒有被感染[5]。采用這種方式方便快捷，但不足點是在臨床中還沒有找到和合適的視野，或者是未能取到感染細胞而導致被檢測忽略而導致被檢測忽略而漏檢，因而造成判斷不準確。另外，在檢測中，細胞內的其他病原體可能會進行干擾，也會造成判斷不準確。所以這種方式因各種因素容易受到干擾，不能準確的進行判斷，而影響最終的判斷結果。

3.3基因檢測基因檢測可采用培養增強套式PCR法，這是PCR結合支原體檢測的方法，選取肺炎支原體患者一定量的痰液以及咽拭子，在支原體專用液體培養基中進行培養，1d后取出這些培養液在進行下一步的培養，并進行兩次擴增，兩次培養中的反應條件是一樣的，利用紫外檢測儀對第2次培養中擴增的產物進行觀察其結果，因為它有與陽性一樣的條帶，所以判斷為陽性。通過實驗采用以上兩種方法同本方法進行對照，陽性率分別為26.4%，26.8%和27.4%，由此可見，PCR方式不僅靈敏度準確，而且陽性率也高，但不足點是操作比較復雜，而且費時。有條件的實驗室可以采用這種方法對支原體進行檢測。采用這種方式的不足點是，由于培養增強套式PCR的方法由于具有敏感的特點，在對支原體進行的過程中可能會出現假陽性或者是假陰性的現象，導致這種現象的因素主要體現在：作為檢測的標本已經被污染；由于細菌的種類繁多，難免會出現交叉現象，還有就是基因的相似性，這種基因看起來很像似，但它們是不同種類，這樣對判斷會造成影響，容易誤判為陽性的結果；在實驗的標本中存在種類繁多的蛋白，有的蛋白會阻止PCR的擴增，而導致漏撿的現象發生[6]。

3.4藥敏檢測藥物檢測可采用抗菌藥物敏感性實驗，目前關于對藥敏分析的報道相對較少，因為支原體傳統的培養方法培養起來比較復雜，而且耗用的時間也長，對其要求相對較高[7]。近幾年，我國有臨床試驗研發了支原體的快速培養同藥敏結合的一種藥敏試劑盒，1~2d內就可以出結果。這種藥敏試劑盒在對支原體進行檢測時，起了一定的作用，對于檢測支原體常用到的藥物，其中具有四類抗生素分別為：喹諾酮類、大環內酯類、林克酰胺類以及四環素類，它都可以提供，而且采用這種方法進行檢測的要求不高，不需要高端和復雜的儀器設備。通過對60例肺炎支原體患者的陽性標本進行藥敏實驗，結果顯示，大環內酯類抗生素的敏感率中，阿奇霉素占44.3%，紅霉素占34.6%，耐藥率較高。據北京的一家醫院報道，70例肺炎支原體患者，其中大環內酯類的耐藥率達到了70%，這需要實驗室對支原體藥敏進行多次檢測[8]。支原體藥敏的檢測可以指導臨床合理使用抗生素，減少肺炎支原體的發生，同時還可以使耐藥株的產生有效減少。

4肺炎支原體的診斷方法

4.1病原學診斷病原學診斷是一種分離性培養，是對支原體感染進行診斷的一種經典方法，也是至今最為可靠的方法。在同一種培養基中，支原體的成長過程與培養基中血清的種類密切相關，根據實驗表明，加入豬血清到培養基中，其生長過程最好，馬血清僅次于豬血清，最后是牛血清。在培養基中加入15%的馬血清，進行4~5d的培養，發現培養基由原來的紅色逐漸變為黃色，而且菌液清澈有光澤、沒有菌膜現象，也沒有渾濁現象。

染色檢查是以菌種培養物進行涂片，革蘭陰性，但其不足點是著色不佳，常吉母薩氏法染色。經過甲醇進行5min的固定之后，用常吉母薩氏法染色過夜，油鏡鏡檢為：支原體菌體的顏色呈現為藍紫色，形狀為細小的弧狀、桿狀、球狀和絲狀以及和等典型的多中形狀。

結合小兒肺炎支原體，試驗應用肺炎支原體被動凝集法和快速培養法，針對小兒支原體肺炎在不同病程中的應用價值，經試驗表明，被動凝集法和快速培養法的靈敏度分別為50.03%與83.33%，特異度分別為100%與94%，以及陽性率分別為23.3%與42.3%(P<0.05)，科學合理地對檢測試劑進行慎重選擇，在對小兒肺炎支原體的臨床診斷中，肺炎支原體被動凝集法與快速培養法具有非常重要的意義[9]。

4.2生物學診斷在肺炎支原體感染中的應用中，通過對比肺炎支原體抗體檢測法和熒光定量檢測法，將兩種檢測的方法進行結合，具有互補作用，可以相互間取長補短，這樣可以使肺炎支原體感染的初檢率得以提高。采用熒光定量檢測法與血清學檢測法對肺炎支原體咽拭子和血清標本經肺炎支原體核酸進行檢測，結果顯示，采用與血清學檢測法對肺炎支原體檢測中，其敏感性與特異性均高于血清學檢測法，由此可見，熒光定量檢測法對該病狀的診斷和治療具有重要的意義。

4.3免疫學診斷目前來看，血清學的診斷技術在臨床中的應用相對較多，主要有間接血凝實驗、顆粒凝集法、酶聯免疫吸附法、螢火抗體實驗、直接補體結合實驗和代謝抑制試驗等方法。

試驗將酶聯免疫吸附法和顆粒凝集法對肺炎支原體進行檢測，對兩種方法的應用價值進行評價，經分析，顆粒凝集法對肺炎支原體進行檢測，其靈敏度與特異性均為97%，用酶聯免疫吸附法對肺炎支原體進行檢測，其靈敏度和特異性均為88%，由此可見，顆粒凝集法的敏感度與特異性均相同，說明重復性好，但不足點是操作比較復雜。

經以上分析，通過酶聯免疫吸附法和顆粒凝集法對肺炎支原體進行檢測，發現兩者的陽性檢出率具有一定的差異性，酶聯免疫吸附法的陽性率呈現最高，為62%顆粒凝集法的陽性率為56%。酶聯免疫吸附法可同時定量檢測可進一步提高診斷率。

4.4聯合性診斷用酶聯免疫吸附法對肺炎支原體進行檢測，肺炎支原體的DNA采用聚合酶聯反應法進行檢測，并對兩種實驗方法的效果進行分析。

采取酶聯免疫法對患者進行檢測，試驗室同時做相應的檢測輔助診斷，并提出“肺炎支原體感染臨床診斷要結合冷凝集試驗、痰及細菌培養、血細胞分析以及血尿常規檢查等多項檢查進行輔助確診，避免出現漏診現象”的結論。

對患者血清中的抗體采用酶聯免疫法進行檢測，同時對感染肺炎支原體的患者進行相應的冷凝集試驗、痰及細菌培養、血細胞分析以及血尿常規檢查等進行檢查[10]。為了對患者方便診斷與治療，需要對患者肺炎支原體感染進行及時檢測，另外，對于難治的肺炎支原體，做出了詳細的臨床研究，并對其做出了較為詳細的講解。

隨著人們對肺炎支原體的認識以及實驗研究的不斷深入，肺炎支原體的實驗方法也在不斷更新。肺炎支原體的實驗檢測方法有很多種，都有著一定的優勢與不足。目前我國對肺炎支原體的實驗室檢測還沒有制定統一的診斷標準，所以臨床可以根據情況選擇不同的方法進行檢測。結合本文中給出的不同方法對肺炎支原體的檢測，要利用其互補作用，需要相互補充，為臨床的早期診斷和早期治療提供有效的依據。

以上所述，對肺炎支原體的診斷方法有很多，對患者進行早期診斷與治療，可有效縮短其病程。另外，采用聯合診斷，還可以使檢測敏感度與早期診斷率明顯提高。實驗室檢測主要采用病原學診斷、生物學診斷和免疫學診斷以及聯合性診斷方法。隨著科學與醫學的不斷發展，肺炎支原體的診斷理念逐漸由原來的二級預防轉為一級預防，可以更好地為患者服務，使患者的健康質量進一步得到保障。

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(編輯楊陽)

收稿日期2015-04-24

中圖分類號：R563.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)17-2305-03