普羅帕酮對兔心室肌細胞動作電位的影響及對快鈉電流的使用依賴性阻滯作用

李晶，鄭霄云，周剛，趙籥陶，楊震

基礎與實驗研究

普羅帕酮對兔心室肌細胞動作電位的影響及對快鈉電流的使用依賴性阻滯作用

李晶，鄭霄云，周剛，趙籥陶，楊震

目的：探討普羅帕酮對兔心室肌細胞動作電位（AP）的影響及對快鈉電流的張力性阻滯和使用依賴性阻滯作用。

方法：選取10只成年新西蘭大白兔，急性分離兔心臟，應用消化酶消化分離獲得單個心室肌細胞（n=10），采用微電極技術記錄AP的最大舒張期電位、0相最大上升速率（Vmax）、AP振幅，以及復極化20%、50%和90%時的動作電位時程（依次簡寫為APD20、APD50和APD90）。應用全細胞膜片鉗技術檢測兔心室肌細胞快鈉電流的I-V曲線及不同頻率下的峰值電流，并用10 μmol/L普羅帕酮溶液灌流干預，最后進行統計分析。

結果：與普羅帕酮灌流前相比，普羅帕酮灌流后，兔心室肌細胞最大舒張電位無明顯變化[（-80±6）mV vs （-82±5）mV，P＞0.05]，AP振幅顯著降低[（95±12）mV vs （125±10）mV，P＜0.05]，Vmax明顯減慢[（330±43） V/s vs （420±54）V/s，P＜0.05）]，APD20[（8±2）ms vs （6±2）ms，P＞0.05]、APD50[（16±3）ms vs （12±3）ms，P＞0.05]和APD90[（86±14）ms vs （85±12）ms，P＞0.05]無顯著變化。普羅帕酮干預后，快鈉電流的I-V曲線較干預前明顯上移，峰值電流下降[（3 001±383）pA vs （4 193±378）pA，P＜0.05]。分別予0.06、1、2、5、10 Hz頻率刺激，普羅帕酮干預前快鈉電流均未顯示出使用依賴性阻滯作用，第10個刺激與第1個刺激誘發的快鈉電流之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。普羅帕酮干預后，在2、5、10 Hz頻率刺激下，阻滯率分別為（22±11）%、（38±14）%和（52±17）%，與普羅帕酮灌流前及普羅帕酮在0.06 Hz和1 Hz刺激時的阻滯率間的差異有顯著統計學意義（P＜0.05），三組間兩兩比較差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

結論：普羅帕酮減慢AP的Vmax，降低AP振幅，對APD無顯著影響。普羅帕酮對快鈉電流不但有張力性阻滯作用，更有顯著的使用依賴性阻滯作用，這樣不但減輕了對QT間期的影響，也可減少心動過緩的發生。

普羅帕酮；動作電位；快鈉電流；張力性阻滯；使用依賴性阻滯

Methods: A total of 10 adult New Zealand white rabbits were sacrificed and 10 individual ventricular myocytes were isolated by enzyme digestion method. Microelectrode technologies were used to record AP-related parameters: maximum diastolic potential （MDP）, maximum rate of rise of the action potential upstroke （Vmax）, action potential amplitude （APA） and action potential duration at 20%, 50% and 90% （APD20, APD50and APD90）. INa-Twas measured, I-V curves and peak currents at different frequencies were detected by whole cell patch clamp before and after propafenone perfusion at 10 μmol/L.

Results: There was no statistical difference in MDP at before and after propafenone perfusion as （-80 ± 6） mV

vs （-82 ± 5） mV, P＞0.05. After perfusion, APA was significantly decreased as （95 ± 12） mV vs （ 125 ± 10） mV, P＜0.05, the Vmax slowed down as （330 ± 43） V/s vs （420 ± 54） V/s, P＜0.05, while APD20, APD50and APD90were unchanged as （8 ± 2）ms vs （6 ± 2） ms, P＞0.05, （16 ± 3） ms vs （12 ± 3） ms, P＞0.05 and （86 ± 14） ms vs （85 ± 12） ms, P＞0.05. After propafenone perfusion, I-V curve of INa-Twas shifted upward and the peak current was decreased as （3001 ± 383） pA vs （4193 ± 378） pA, P＜0.05. Before perfusion, when stimulated at 0.06 Hz, 1 Hz, 2 Hz, 5 Hz and 10 Hz, there were no significant use-dependent block in INa-T, and no real difference in INa-Tbetween the 10thand 1stpulse, P＞0.05. After perfusion, no significant usedependent block was observed when stimulated at 0.06 Hz and 1 Hz, P＞0.05, while at 2 Hz, 5 Hz and 10 Hz, propafenone perfusion demonstrated significant use-dependent block upon INa-Twith the inhibition fractions of （22 ± 11）%, （38 ± 14）% and （52 ± 17）% respectively, those were significantly different from the inhibition fractions at either 0.06 Hz or 1Hz, P＜0.05. When the inhibition fractions were compared by each 2 conditions, all P＜0.05.

Conclusion: Propafenone may slow down the Vmaxof AP, reduce APA and without the impact on APD; the effects on INa-Tis not only in tonic block, but also more obviously in use-dependent block in isolated ventricular myocytes of New Zealand rabbit. Such influences minimized the impact on QT interval and meanwhile, decreased the incidence of brad arrhythmia.

（Chinese Circulation Journal, 2015,30:679.）

普羅帕酮是臨床常用的Ⅰc類抗心律失常藥物，能直接穩定心肌細胞膜，用于多種心律失常治療[1-3]，其電生理效應主要是降低單相動作電位（AP）的0相最大上升速率（Vmax）、延長有效不應期（ERP）。然而普羅帕酮對動作電位時程（APD）的影響卻存在爭議[4-7]，需要進一步研究明確。使用依賴性阻滯是鈉通道藥理作用的重要電生理學特征[8]，膜片鉗技術是心臟電生理學研究的重要手段[9]，目前國內鮮有研究以急性分離的心室肌細胞系統評估普羅帕酮對鈉通道的張力性阻滯和使用依賴性阻滯作用。本研究以急性分離的兔心室肌細胞作為材料，采用全細胞膜片鉗技術，以普羅帕酮進行灌流，檢測AP的相關參數以及快鈉電流的張力性阻滯和使用依賴性阻滯的變化，探討普羅帕酮的電生理效應。

1 材料與方法

兔心室肌細胞的分離：選取成年新西蘭大白兔（1.8～2.3 kg）10只（寧夏醫科大學動物中心提供，SPF級），先經甲苯噻嗪肌肉注射鎮靜，后穿刺耳緣靜脈給予肝素鈉（200 IU/kg）抗凝，然后以氯胺酮經耳緣靜脈注射麻醉（35 mg/kg），迅速切除心臟，置于無鈣臺氏液中。游離主動脈根部，迅速將其懸掛于已經充灌無鈣臺氏液的灌流系統中，無鈣臺氏液灌流10～15 min以洗凈殘存血液。所有的灌流液在37℃用95%氧氣-5%二氧化碳發泡，調整流速維持灌注壓于75 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。然后以酶液（Ⅰ型膠原酶0.5 g/L、蛋白酶0.05 g/L、小牛血清白蛋白0.4 g/L+無鈣臺氏液）灌流心臟。20 min后取下，剪離左心室心肌，用眼科剪剪碎，再用尼龍網過濾細胞，并在室溫下儲存在KB液[（L-谷氨酸50.0，氯化鉀40.0，磷酸二氫鉀20.0，?；撬?0.0， 氯化鎂 3.0，氫氧化鉀70.0，乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸 0.5，4-羥乙基哌嗪乙磺酸 10.0，葡萄糖 10.0，單位均為mmol/L，用氫氧化鉀調pH值至7.4）]中。只有耐鈣、桿狀、有著清晰橫紋且沒有自發性收縮的細胞才被選作實驗細胞。

AP的記錄：在37℃下進行?？缒る妷菏褂? mmol/L 氯化鉀充灌的微電極（Sutter，美國）進行記錄，阻抗在20～40 MΩ。通過記錄電極起搏細胞，周長穩定為1 s，脈寬1 ms，起搏電壓為閾電位的120%。藥物灌流和沖洗時間足以達到穩態的藥物效應。檢測分析AP的最大舒張期電位、0相Vmax、AP振幅以及復極化20%、50%和90%的動作電位時程（APD20、APD50和APD90）。數據由檢測10個心室肌細胞取得的AP平均值獲得。

快鈉電流檢測：使用硼硅玻璃電極（Sutter，美國），充灌電極內液時阻抗≈ 1.0 ～2.0 MΩ。細胞外液組分為（單位mmol/L）：氯化鈉 10，氯化銫130，氯化鎂1.0，氯化鈣1.0，4-羥乙基哌嗪乙磺酸5.0，葡萄糖10.0，氯化鈷 0.3，用氫氧化鈉調定PH值至7.4。電極內液組分為（單位mmol/L）：氯化鈉 10.0，氟化銫110.0，氯化銫20.0，乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸5.0，鎂-三磷酸腺苷5.0，4-羥乙基哌嗪乙磺酸5.0，用氫氧化鈉調定pH 值至7.4。在倒置顯微鏡（Olympus，日本）下，利用三維液壓微操縱器（Narishige，日本）使得電極尖端接近細胞，補

償液接電位，向細胞壁施壓后負壓吸引，直到形成高阻封接（封接阻抗＞1 GΩ），給予快電容補償，然后吸破細胞膜，形成全細胞記錄，補償慢電容和串聯電阻，待破膜電壓穩定后，記錄電流。全細胞電流用Axopatch 200 A放大器（Axon，美國）進行記錄，在5 kHz的低通電流濾過，經Digidata 1 200 A/D的脫線界面在5 kHz予以數字化處理。數據由檢測10個心室肌細胞取得的快鈉電流的平均值獲得。

普羅帕酮干預和灌流：先以空白細胞外液灌流細胞池，記錄快鈉電流，然后以細胞外液為母液配制10 μmol/L普羅帕酮（Sigma，美國）溶液[5]，用蠕動泵以2 ml/min流速灌流細胞池，3 min后記錄各種刺激條件下的快鈉電流。

普羅帕酮對快鈉電流I-V曲線的影響：在電壓鉗模式下，從鉗制電壓-80 mV逐步除極至+30 mV，階躍+10 mV，維持時間100 ms，刺激頻率1.0 Hz，以空白細胞外液灌流時最大電流作為標準，求得標化電流，并以刺激電壓作為橫坐標，標化電流作為縱坐標，制作I-V曲線。

普羅帕酮對快鈉電流的張力性阻滯：鉗制電位-90 mV持續15 s后階躍至-30 mV，持續20 ms，誘發快鈉電流。

普羅帕酮對快鈉電流的使用依賴性阻滯：鉗制電壓-90 mV持續15 s后，由階躍至-30 mV的一串10次連續脈沖刺激（持續20 ms）誘發。頻率分別為0.06、1、2、5、10 Hz（前后兩個刺激的間隔時間分別為15 s、1 s、500 ms、200 ms和100 ms）。以第1個刺激與第10個刺激誘發的快鈉電流的差值與第1個刺激下快鈉電流的比值求得阻滯分數，以阻滯分數來評價使用依賴性阻滯作用。

2 結果

普羅帕酮對兔心室肌細胞AP的影響（圖1）：10 μmol/L普羅帕酮灌流后較灌流前兔心室肌細胞最大舒張電位無明顯變化[（-80±6）mV vs（-82±5）mV，P＞0.05]，AP振幅顯著降低[（95±12）mV vs （125±10）mV，P＜0.05，圖1B]，Vmax明顯減慢[（330±43）V/s vs （420±54）V/s，P＜0.05，圖1C]，APD20[（8±2）ms vs （6±2）ms，P＞0.05]、APD50[（16±3）ms vs （12±3）ms，P＞0.05]和APD90[（86±14）ms vs （85±12）ms，P＞0.05]均無顯著變化（圖1D）。

圖1 普羅帕酮對兔心室肌細胞動作電位的影響（n=10）

普羅帕酮對快鈉電流I-V曲線的影響及張力性阻滯作用（圖2、圖3）：檢測快鈉電流后制作I-V曲線，結果顯示普羅帕酮灌流前后翻轉電位相同，均為-30 mV，I-V曲線明顯下移（圖2B）。在-90 mV鉗制電位下，快鈉電流峰值由（4 193±378）pA減低為（3 001±383）pA（P＜0.05，圖3B）。

圖2 普羅帕酮對快鈉電流I-V曲線的影響（n=10）

圖3 普羅帕酮對快鈉電流的張力性阻滯作用（n=10）

不同頻率下普羅帕酮對快鈉電流使用依賴性阻滯作用的影響（圖4）：普羅帕酮灌流前即空白細胞外液灌流時，以0.06、1、2、5、10 Hz刺激，快鈉電流未顯示使用依賴性阻滯作用，即第10個刺激與第1個刺激誘發的快鈉電流無統計學差異（P＞0.05，圖4A）。普羅帕酮灌流后，當以0.06 Hz和1 Hz刺激時，亦未顯示出使用依賴性阻滯作用 [分別為：（3 101±313）pA vs （3 078±313）pA，P＞0.05；（3 122±321）pA vs （3 118±315）pA，P＞0.05]；但當以2、5、10 Hz頻率刺激時，第10個刺激較第1個刺激誘發的快鈉電流顯著下降[依次為：（2 474±343）pA vs （3 124±315）pA，P＜0.05；（1 989±398）pA vs （3 208±320）pA，P＜0.05；（1 525±545）pA vs （3 174±318）pA，P＜0.05，圖4A]，阻滯率分別為（22±11）%、（38±14）%和（52±17）%，與普羅帕酮灌流前10 Hz刺激時和普羅帕酮灌流后0.06、1 Hz刺激時阻滯率之間的差異以及三種狀態下兩兩比較的差異，均有顯著統計學意義（P＜0.05，圖4B）。

3 討論

本研究采用全細胞膜片鉗技術對普羅帕酮對兔心室肌細胞的AP的影響進行了探討，結果表明普羅帕酮灌流后兔心室肌細胞靜息電位無明顯變化，AP振幅降低，Vmax明顯減慢，這與國外報道一致[5-7]。AP的振幅和Vmax與心肌的傳導緊密相關，AP振幅降低、Vmax下降促使激動在心肌間的傳導減慢，甚至傳導阻滯，在房室結和希氏束-浦肯野系統可表現為A-H間期和（或）H-V間期延長，是普羅帕酮抗心律失常的機制之一。

本研究結果還表明，普羅帕酮對APD無明顯影響，普羅帕酮灌流后APD20、APD50和APD90無顯著變化。關于普羅帕酮對APD的影響目前報道不一。Burashnikov 等[5]的研究表明，普羅帕酮對心室肌細胞的APD90沒有影響，但會選擇性延長心房肌細胞的APD90。Lemmens等[6]的研究則表明，普羅帕酮可以縮短乳頭肌和浦肯野纖維的APD。Koller等[7]的研究則表明，普羅帕酮延長APD90。生理條件下，普羅帕酮的電生理效應主要是由抑制快鈉電流和快速激活的延遲整流鉀電流（IKr）引起，其中對APD的影響主要通過IKr介導[10]。與以往研究不同的是，本文采用微電極技術在細胞水平對普羅帕酮對APD的影響進行了探討，結果顯示APD90無變化，提示在本研究的刺激頻率和濃度條件下，普羅帕酮在抑制快鈉電流使得快鈉電流相關參數如Vmax顯著減低的同時，對IKr無顯著影響。在臨床工作中，普羅帕酮的這種作用可以使其在有效抗心律失常的同時，不明顯延長QT間期，減少了尖端扭轉型室速的發生。但其在不同濃度和刺激頻率下的效應仍有待進一步研究證實。

本研究結果還顯示，普羅帕酮對快鈉電流具有顯著的張力性阻滯作用，普羅帕酮灌流后峰值電流明顯下降。更為重要的是，在頻率為2、5、10 Hz

刺激時，普羅帕酮對快鈉電流具有明顯的使用依賴性阻滯作用，且頻率越快，阻滯作用越明顯。

圖4 不同頻率刺激下普羅帕酮對快鈉電流的使用依賴性阻滯作用（n=10）

顧名思義，“使用依賴性阻滯”的含義是依賴于鈉通道“使用”的一種阻滯作用，而鈉通道的“使用”意味著鈉通道的開放，即鈉通道開放（即“使用”）越多，藥物對鈉通道的阻滯作用就越明顯。這直觀地反映出使用依賴性阻滯的頻率依賴性特征，即在一定頻率范圍內，其頻率越快，藥物的阻滯作用就越明顯，電生理學機制之一是心肌不應期與頻率相關，頻率較快時不應期長，阻滯作用更顯著，這是多種藥物抗心律失常作用的基礎和研究熱點[11,12]。

與以往研究不同的是，本研究以急性分離的兔心室肌細胞作為標本，通過直接檢測其快鈉電流，顯示了普羅帕酮使用依賴性阻滯的頻率依賴性特點，表明使用依賴性阻滯只有在頻率達到一定閾值時方才顯現。這提示在臨床應用中，當患者心率較慢時，普羅帕酮沒有明顯作用，這不啻是一種良好的安全保護作用，避免在心率較慢時進一步減慢心率和導致傳導阻滯。而在心率較快時，則可較為顯著地起到減慢心率和傳導，從而減少和抑制快速性心律失常的發生，具有顯著的臨床價值。

總之，本研究結果表明，普羅帕酮不但對AP有明顯抑制作用，使其振幅降低、Vmax減慢，且對快鈉電流有顯著的張力性阻滯和使用依賴性阻滯作用。這是普羅帕酮發揮其抗心律失常作用的機制，具有重要的臨床指導價值，值得進一步研究探討。

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Effects of Propafenone on Action Potential of Rabbit Ventricular Myocytes and the Use-dependent Block of Transient Sodium Current

LI Jing, ZHENG Xiao-yun, ZHOU Gang, ZHAO Yue-tao, YANG Zhen.
Department of Geriatrics, Beijing Hospital, Beijing （100730）, China

Objective: To study the effects of propafenone on action potential （AP） of rabbit ventricular myocytes with the tonic block and use-dependent block of transient sodium current （INa-T）.

Propafenone; Action potential; Transient sodium current; Tonic block; Use-dependent block

2015-01-07）

（編輯：朱柳媛）

100730 北京市，北京醫院 老年醫學部（李晶、周剛、趙籥陶）；中日友好醫院（鄭霄云）；寧夏醫科大學總醫院（楊震）

李晶 副主任醫師 碩士 主要從事老年心血管疾病診療 Email：jing-li2000@126.com 通訊作者：楊震 Email: yangzhen080@163.com

R54

A

1000-3614（2015）07-0679-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.016