牛奶中β-內酰胺酶來源及其檢測方法研究進展

陳美霞 ，文芳 ，鄭楠 ，楊晉輝 ，張勇 ，陳璐

（1.農業部奶及奶制品質量監督檢驗測試中心（北京），北京100193；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京100193）

0 引言

近些年，牛奶抗生素殘留成為奶及奶制品質量安全的一個重點問題。因為β-內酰胺酶可使β-內酰胺類抗生素降解，導致空間結構破壞或功能喪失，從而可避免牛奶中殘留抗生素的檢出[1]。因此，不法商家人為地向奶中添加β-內酰胺酶使抗生素降解，避免抗生素的檢出。β-內酰胺酶的添加不僅掩蓋了抗生素殘留的事實，同時引入了抗生素降解產物及β-內酰胺酶殘留所帶來的風險[2]。為了規范奶產品安全生產及奶制品質量安全，我國已將β-內酰胺酶列入非食用添加劑名單并要求進行全國監測。本文從牛奶中β-內酰胺酶殘留的原因、現狀、風險及檢測方法等方面進行綜述，為β-內酰胺酶研究提供參考。

1 β-內酰胺酶結構與功能

β-內酰胺酶，英文名稱為β-Lactamase，是細菌代謝過程產生的一種蛋白質，可特異性分解β-內酰胺類抗生素。目前發現并報道的β-內酰胺酶有200多種。根據β-內酰胺酶的等電點、結構、水解產物、是否受克拉維酸抑制等，可以將β-內酰胺酶分為五大類：（I）CEP-N 酶（頭孢菌素酶），（II）PEN-Y 酶（青霉素酶），（III）BSD-Y 酶（廣譜酶），（IV）EBS-Y 酶即 ESBLS（超廣譜酶），（V）金屬酶（金屬β-內酰胺酶）[3]。β-內酰胺酶對抗生素的作用主要有水解和非水解兩種方式[4]。大多數β-內酰胺酶的活性位點具有一個縱行溝狀結構，該結構疏松易彎曲，利于底物的結合?？股卅?內酰胺環上的羰基碳可以不可逆的結合在該活性位點處的絲氨酸上，使抗生素β-內酰胺環解開，造成抗生素降解，避免抗生素的檢出。另外一些抗生素如金屬酶，它們是利用二價金屬離子與組氨酸或半胱氨酸結合，并與抗生素羰基中的酰胺鍵相互作用，抑制抗生素發揮作用，避免抗生素的檢出。目前國際上研究比較活躍的是超廣譜β-內酰胺酶和頭孢菌素酶。

2 β-內酰胺酶殘留的風險

2.1 β-內酰胺酶在牛奶中殘留的內源性因素

研究表明，許多微生物可以產生β-內酰胺酶[5]。其中，革蘭氏陽性菌可以產生青霉素酶和頭孢素酶2種β-內酰胺酶；而革蘭氏陰性菌產生的β-內酰胺酶卻種類繁多，截至目前，已報道有200多種。目前關于牛體內或牛奶內產β-內酰胺酶的微生物是否會造成牛奶中β-內酰胺酶殘留主要存在以下兩種觀點。

高延玲等[6]及謝磊等[7]認為微生物產生的β-內酰胺酶在牛奶中殘留率比較高。2010年高延玲等[6]在已查明無人為β-內酰胺酶添加的情況下對140批生鮮乳進行檢測，β-內酰胺酶檢出率達52.9%。與之類似，2014年謝磊等[7]對北京市10家養殖場的593份生鮮乳進行分析，內源性β-內酰胺酶殘留陽性檢出率達28.7%。這可能與貯存時間延長、抗菌藥物不合理使用等因素促進細菌產β-內酰胺酶增加有關[6-7]。

然而，張鑫瀟等[2]及劉琴等[8]認為在無外源β-內酰胺酶添加的情況下，微生物產生的β-內酰胺酶殘留量及殘留率很低，幾乎無法檢測到。他們分析可能是牛奶采集方式、牛奶成分、消毒方法、包裝儲存方式等情況不適合產β-內酰胺酶的微生物生存。因此，張鑫瀟等[2]及劉琴[8]等認為基于目前的認識和實踐，牛奶中檢出的β-內酰胺酶是外源性添加的。

2.2 β-內酰胺酶在牛奶中殘留的外源性因素

β-內酰胺類抗生素因其抗菌譜廣、價格便宜廣泛應用于畜牧生產中，如治療乳房炎及其他細菌感染等疾病[9-11]。但是由于使用不當，如濫用、誤用尤其是不按說明經過休藥期處理等原因，出現了牛奶中抗生素殘留的問題[12-13]。由于抗生素存在的普遍性，國家出臺相應法規要求牛奶中抗生素“不得檢出”，并要求對所有生鮮乳進行抗生素含量檢測，超標者不得出售。因此，不法商家便在牛奶中添加抗生素降解劑，避免“有抗奶”的檢出。崔生輝等[14]、Guay等[15]通過實驗證明這些“抗生素分解劑”的主要成分正是β-內酰胺酶。另外，由于國內大多數乳品企業對抗生素超標的牛奶采用降價收購的政策，使得1噸“有抗奶”和“無抗奶”價格相差近千元。在利益的驅動下，不法商家會在牛奶中添加抗生素降解劑生產人造“無抗奶”[1]，從而導致牛奶中β-內酰胺酶的殘留。同時，隨著科學技術的發展，純化β-內酰胺酶的工藝已經非常成熟，目前具有一定生產規模的β-內酰胺酶生產廠家不少于30家[2]。

雖然微生物可以產生β-內酰胺酶，可能在牛奶中殘留。但是，目前對市場和消費者危害最大的并不是內源性β-內酰胺酶，而是人為添加的β-內酰胺酶。甚至有人認為，正是這些外源性降解劑的添加使得假“無抗奶”大量充斥市場。

2.3 牛奶中β-內酰胺酶殘留的風險

雖然目前還沒有關于β-內酰胺酶殘留實際危害的報道，但是，牛奶中殘留的β-內酰胺酶對人體健康及奶業健康發展而言存在一定的風險。

以青霉素為例，約74%的病人對其過敏。究其機理，一方面，青霉素降解產物——青霉素噻唑酸可與蛋白結合形成抗原導致過敏；另一方面，青霉素在內部β-內酰胺環開環后會高度聚合形成高聚物導致過敏[2]。而郭宗儒等[16]及彭司勛等[17]指出，β-內酰胺酶可催化青霉素開環生成青霉素噻唑酸。因此，從原理上講，β-內酰胺酶有引起人體過敏的風險。另外，因為β-內酰胺酶分解其他β-內酰胺類抗生素的降解產物中有許多是抗生素的類似物，而其分解物的危害尚不清楚，因此長期飲用含β-內酰胺酶處理的牛奶，也存在使人產生耐藥性、降低對傳染病的抵抗能力的風險[2]。另外，濫用解抗劑可能會引入其他的致病菌、致癌物質，長期飲用解抗劑處理的奶對身體的傷害不言而喻。

同時，不法商家添加以β-內酰胺酶為主要成分的解抗劑來掩蓋抗生素使用的事實，擾亂市場，不利于我國奶業的健康可持續發展。

2.4 β-內酰胺酶在牛奶中的殘留現狀

2007年崔生輝等[14,18]對市售的38份牛奶樣品進行檢測，60%以上樣品呈β-內酰胺酶陽性。2010年高延玲等[6]對42個奶牛養殖場和養殖小區的140批生鮮乳進行檢測，β-內酰胺酶檢出率達52.9%。2012年寧波市公布的《2012年下半年寧波市乳制品評價性抽檢結果通報》中顯示該市出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心對608批次奶及奶制品進行檢測，β-內酰胺酶呈陽性的達40批次。2013年農業部對西部地區某省異地抽檢時發現12份樣品中唯一一份不合格的原因便是β-內酰胺酶超標[19]。2014年謝磊等[7]對北京市10家養殖場共計593份生鮮乳進行檢測，有28.7%的樣品呈β-內酰胺酶陽性。

不管這些檢出的β-內酰胺酶是內源性還是外源性造成的，如此高的檢出率足以說明牛奶中β-內酰胺酶殘留的嚴重性，說明β-內酰胺酶的問題不容小覷。這警示我們需要加強牛場牛奶衛生、運輸以及儲存、市場銷售流通等各環節的管理，減少牛奶中β-內酰胺酶的殘留。

3 β-內酰胺酶主要檢測方法

3.1 微生物法

微生物法是在實驗室檢測β-內酰胺酶使用比較廣泛、發展最早的一種方法。它的原理是選擇對抗生素敏感的細菌為指示劑，根據抑菌圈的大小判斷酶的多少。主要有顯色培養法[20]、三維試驗法[21]、紙皮擴散法[22]、聚合酶鏈式反應法[23]、杯碟法[24]等。其中最為常用的是杯碟法（表1）。

2014年李欣南等[28]針對微生物法檢測β-內酰胺酶中常用的杯碟法的操作要點及注意事項進行了梳理，為實際檢測工作提供參考。

雖然目前實驗室中微生物法使用比較廣泛，但費時費力，不適合現場及快速檢測工作。

3.2 碘量法

碘量法也是目前比較常用的一種檢測方法。它是基于β-內酰胺酶分解抗生素后的降解產物與碘發生氧化還原反應進行β-內酰胺酶檢測的方法。中華人民共國藥典（2005版）中推薦使用碘量法對青霉素酶活性進行檢測[29]。同時，目前市場上許多快速檢測試劑盒也是基于碘量法進行的設計。

Sykes等[30]和Novick等[31]利用碘量法對β-內酰胺酶進行檢測，根據15～20 min后酶將抗生素完全降解后產生的吸光度值的變化進行β-內酰胺酶的定量，該方法檢測限為0.001 U?；诘饬糠ㄩ_發的優爾齊TMβ-內酰胺酶殘留定性及定量檢測試劑盒，定量檢測限為1 U/mL，借助酶標儀30 min內即可出檢測結果[32]。張鑫瀟等發現碘量法可用于生鮮奶及奶制品中β-內酰胺酶的檢測，但是檢測限比較高[2]。2010年謝巖黎等[33]的研究表明當β-內酰胺酶濃度大于30 U/mL時，可通過直接碘量法對β-內酰胺酶進行定性分析，通過間接滴定法進行定量分析。

表1 杯碟法在檢測牛奶中β-內酰胺酶的應用

碘量法在β-內酰胺酶檢測工作中使用比較廣泛，目前也有幾款基于碘量法檢測β-內酰胺酶的試劑盒面市，適合進行現場及大批量篩選工作；但是某些方法檢測限較高，需降低檢測限，提高靈敏度。

3.3 酸定量法

酸定量法的原理是β-內酰胺類抗生素在β-內酰胺酶的作用下分解，生成酸性產物引起牛奶pH發生變化，使相應指示劑變色或使碳酸鹽溶液釋放二氧化碳引起壓力變化，通過pH計測量牛奶pH變化、觀察指示劑變色或壓力測量計測定壓力變化等手段實現對牛奶中β-內酰胺酶的定量。

1947年Henry等[34]利用青霉素酶分解青霉素產生酸性產物青霉素噻唑酸引起二氧化碳釋放導致壓力變化的原理，通過壓力測量計定量二氧化碳的變化實現對β-內酰胺酶的定量檢測。2005年張春輝等[35]以酚酞為指示劑，通過酸定量法對產β-內酰胺酶的菌株進行選擇，陽性率達97%。朱融融等[36]通過雙pH計同時檢測建立了牛奶中青霉素酶的檢測方法，檢出線性范圍為0.5～3.5 U，檢出限為0.4 U。2009年馬潔等[37]通過利用酸度計檢測牛奶pH的變化,實現對β-內酰胺酶的定量，該方法在牛奶中的檢測限為15 U/mL，同時得到β-內酰胺酶米氏常數為0.0351 mmol/L。

根據壓力變化測定β-內酰胺酶的酸定量法因費時較長、操作復雜、影響因素較多、所需設備復雜等原因在實際中很少用到；而用pH計測定的方法操作簡便，結果重復性也比較好，但是可能會出現假陽性和假陰性的情況。因此，酸定量法在實際檢測工作中使用并不廣泛。

3.4 頭孢菌素顯色法

頭孢菌素顯色法原理是顯色頭孢菌素在β-內酰胺酶的作用下解環降解，顏色發生改變表征β-內酰胺酶的存在及含量。

1972年Callaghan等[38]結合其之前（1967）[39]的實驗方法，選擇頭孢硝噻吩為顯色頭孢菌素，通過檢測顏色的變化定性、定量多種材料中的β-內酰胺酶。其中定性方法方便易行，可在1 min內判斷結果；定量方法用紫外分光光度計就可以完成，檢出限為10 μg/mL。但是該方法可能會因頭孢硝噻吩與蛋白結合，導致假陽性結果出現。1980年Schindler等[40]發現4-2-吡啶偶氮-N，N-二甲氧基苯胺（PADAC）可以用于檢測β-內酰胺酶實現對產該酶菌株的選擇，并可實現對β-內酰胺酶抑制劑的分析。1982年Jorgensen[41]等以PADAC為顯色頭孢菌素，通過檢測β-內酰胺酶進行產β-內酰胺酶菌株的選擇，發現PADAC可以有效的用于嗜血桿菌和淋球菌產生的大量Ⅲ型β-內酰胺酶檢測，但是對腸桿菌、克雷伯氏菌、擬桿菌及葡萄球菌產生的β-內酰胺酶檢測不靈敏，而頭孢硝噻吩對后者產生的β-內酰胺酶檢測更為靈敏。1987年Guay[15]等發現氯汞苯甲酸（pCMB）可以屏蔽牛奶中內源性的β-內酰胺酶，并用PADAC作為顯色頭孢菌素。因為PADAC不與蛋白質結合，所以可以實現對β-內酰胺酶更加靈敏的檢測。另外,2010年陳號等[42]通過重復Callaghan等（1972）的實驗方法發現20 min內可實現對牛奶中20 U/mLβ-內酰胺酶的檢測，但是，定量方法沒有重復出來。

雖然用頭孢菌素顯色法檢測β-內酰胺酶的研究及報道較早，但是因該方法需要使用特殊的頭孢菌素，價格比較昂貴，所以在實驗室中使用頻率不高。

3.5 現代儀器檢測法

高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等因其分離效率高、分析速度快、適用范圍廣等優點，目前廣泛應用于食品中危害因子的檢測，并有許多危害物質檢測的國家標準陸續出臺。

2008年林楠等[43]利用高效液相色譜儀檢測牛奶中青霉素被β-內酰胺酶降解的產物青霉素噻唑酸，以此來判斷β-內酰胺酶的存在與含量，在牛奶中的檢測限為4 U/mL，只需30 min即可出檢測結果。2009年衛生部發布的《食品中可能違法添加的非食用物質名單（第二批）》中關于β-內酰胺酶的檢測，中國檢驗檢疫科學院食品安全所推薦使用液相色譜法。同年，韓奕奕等[44]對β-內酰胺酶進行檢測，實驗表明，SNAP雙流向酶聯免疫間接檢測法對β-內酰胺酶加標試樣的檢出限可以達到0.001 IU/mL。2010年孫漢文等[45]利用快速高分離液相色譜-串聯質譜（RRLC-MS/MS）檢測添加β-內酰胺酶后氨芐青霉素的酶解率實現對β-內酰胺酶的定性和定量，牛奶中檢測限為4 U/mL。2010年Xu等[46]開發了一種依賴基質輔助激光解吸/電離傅立葉變換質譜（MALDI-FTMS）的β-內酰胺酶檢測方法，該法是通過檢測青霉素被β-內酰胺酶降解后的產物青霉素噻唑酸來實現對β-內酰胺酶的定量。牛奶中檢測限為0.006 U/mL。2015年Zhou等[47]開發了一種檢測牛奶中β-內酰胺酶的HPLC方法，該法通過HPLC檢測與β-內酰胺酶孵育后剩余的青霉素G的量間接實現對β-內酰胺酶的定量及活性檢測，牛奶中檢測限為0.6 U/mL。

現代儀器檢測法可對β-內酰胺酶進行高通量定量檢測，故?？捎糜趯嶒炇叶糠治?，但是因為需要專門人員進行操作、前處理比較復雜、所需設備比較昂貴等原因，在一些小實驗室使用頻率不高，且不適用于現場檢測。

3.6 生物傳感器法

生物傳感器由生物活性物質（如核酸、抗原、抗體、酶、完整細胞等等）構成的生物功能敏感原件，配合適當的信號轉換器組合而成。工作原理是待測物質進入生物傳感器并與之部分或全部原件發生反應，產生一定的物理信號（如顏色、電、熱、光等）經特定方法或轉化器轉換成可定量或可處理的信號，實現對目標物質的定性或定量。

2007年Liu等[48]利用納米金材料設計了一種檢測β-內酰胺酶的傳感器，可利用比色法實時檢測β-內酰胺酶的活性。2010年Rubtsova等[49]開發了一種基于辣根過氧化酶設計的寡核苷酸微陣列，可用于臨床光譜β-內酰胺酶的常規檢測。2013年Zhou等[50]開發了一種檢測β-內酰胺酶的溫度生物傳感器，該傳感器的原理是加入定量的青霉素G與β-內酰胺酶孵育，取混合液注入溫度傳感器系統中，根據溫度變化得出青霉素G的量，最后根據未反應的青霉素G的量實現對β-內酰胺酶的定量。該方法檢測限為1.1 U/mL。2014年Li等[51]開發了一種檢測β-內酰胺酶的近紅外熒光探針，該探針是將特定的頭孢菌毒固定在半菁骨架上制作而成，該探針本身信號很弱，但在β-內酰胺存在的情況下與之反應，釋放熒光基團使信號顯著升高，根據信號變化實現對β-內酰胺酶的定量，該方法在牛奶中檢測限為0.02 nmol/L。

生物傳感器通常具有體積小、靈敏度高、選擇性強、抗干擾能力強、響應快及可重復使用等優點，因此近些年研究較熱。目前已有多款基于傳感器原理設計的試劑盒或試紙條面市，可實現對牛奶中β-內酰胺酶的檢測。

3.7 其他

1996年Liang等[52]在研究β-內酰胺類抗生素時指出可以利用電化學發光方法檢測生物基質中的β-內酰胺酶。2002年Hujer[53]等通過構建對SHV-1和CMY-2型β-內酰胺酶特異性的多克隆抗體進行酶聯免疫分析（ELISAs），發現該方法至少可以對95%的SHV及AmpC型β-內酰胺酶實現靈敏、特異性地檢測，并可以對實驗室及臨床分離出的β-內酰胺酶實現相對定量分析。2009年河南省獸藥監察所發明了一種生鮮奶及奶制品中β-內酰胺酶檢測試劑盒，可實現快速檢測[54]。2013年Wang[55]等基于最優化的單克隆抗體開發了一種檢測β-內酰胺酶的雙抗體酶聯免疫方法，在牛奶中檢測限達4.17 ng/mL。

雖然這些方法沒有具體分類且使用頻率不高，但仍可以用于β-內酰胺酶的檢測。并且這些方法可以與其他方法結合，有望生產出適合現場檢測的快速、高靈敏檢測產品。

4 結束語

目前針對牛奶中β-內酰胺酶的檢測方法有許多，如微生物法、碘量法、酸定量法、頭孢菌素顯色法、現代儀器檢測法、生物傳感器法及其它法等。但沒有一款集靈敏度、便攜性、高通量、易操作、經濟于一身的方法，更沒有一款這樣的產品面市。另外，目前絕大多數方法是基于牛奶中總的β-內酰胺酶檢測，無法區分內、外源β-內酰胺酶。因此，建立一種可區分內、外源性β內酰胺酶，同時又可高通量、高靈敏的、方便快捷的β-內酰胺酶檢測技術具有重要意義。

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