商洛綠茶多糖的分離純化及體外抗氧化和抗腫瘤活性研究*

何念武，李丹

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛，726000)

茶葉Camellia sinensis(L.)O.Kuntze為雙子葉植物綱山茶屬植物茶樹的新鮮嫩葉炮制而成，唐代陳藏器在《本草拾遺》中提到:“諸藥為各病之藥，茶為萬病之藥”，說明茶最初是作為藥物來使用的，正如宋代林洪撰的《山家清供》中亦有“茶，即藥也”的論斷一樣，這些都足以證明茶葉有著重要的藥用價值［1］?，F代科學研究表明，茶葉富含多種生物活性成分，諸如茶多酚、茶多糖、咖啡堿、氨基酸、維生素等等［2-3］。醫學營養學研究表明，綠茶具有廣泛的藥理活性，諸如抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖及防治心腦血管疾病等功效［5］。由于茶葉中含有大量茶多酚具有很強的抗氧化活性，是人體自由基的天然清除劑，可以有效阻斷亞硝酸胺等多種致癌物質在體內的合成［6］。同時，它還能吸收放射性物質以達到防輻射的效果，從而保護女性皮膚［7］。目前，有關茶多酚藥理作用的研究已有很多［5］。然而，對其另外一種活性成分茶多糖的研究則遠比不上茶多酚，再加上多糖結構復雜，分離純化難度大等制約因素，從而使得多糖結構與活性研究成為了熱點［8］。

商洛綠茶因所處的獨特地理位置造就了其色香、味濃、耐沖泡的優良品質，當前商洛茶葉正處于蓬勃發展之中，如何從科學的角度去闡述商洛綠茶的藥用價值或營養價值就顯得非常重要。為此，本文就商洛綠茶茶多糖分離純化及其體外活性加以探討，以期為深度開發商洛綠茶的藥用和營養保健價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

商洛綠茶，于2014年6月采自陜西省商洛市商南縣茶園，經商洛學院生物醫藥與食品工程學院王新軍教授鑒定為山茶科山茶屬植物茶樹的新鮮嫩葉。

氮藍四唑(NBT)，上海藍季科技發展有限公司;抗壞血酸(VC)，天津市天力化學試劑有限公司;1.1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、碘化丙啶(PI)、還原型輔酶(NADH)、吩嗪甲硫酸鹽(PMS)、二甲亞砜(DMSO)、BHT(二丁基羥基甲苯)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、2，2-聯氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)、無DNA酶活性的 RNA酶，均購于 Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA);RPMI-1640 細胞培養液，購自GIBCO公司(Grand Island，USA);胎牛血清(FBS)，購于杭州四季青生物公司;其他試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.1.2 儀器

可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;FA1104型電子天平，上海精科天平廠;CO2培養箱，美國Thermo公司;電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;RT6000酶標儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司;高壓滅菌器，上海博訊實業有限公司;TGL-20bR高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 商洛綠茶多糖(SGTPs)的分離純化

商洛綠茶粗多糖的制備參照何念武［8］的方法進行，以熱水浸提-乙醇沉淀法制得。稱取一定量的粗多糖樣品，溶解后過DEAE-52纖維素柱層析，收集不同的茶多糖組分，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量［9-10］。

1.2.2 不同組分的商洛綠茶多糖體外抗氧化活性

參照 Tian［11］，He［12］等方法并加以適當改進，分別在DPPH自由基，超氧陰離子，羥基自由基和ABTS自由基體系上檢測不同組分茶多糖的體外抗氧化活性。將不同組分的樣品多糖和BHT分別用蒸餾水配制成1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mg/mL 的劑量，然后在上述抗氧化體系上進行檢測，所有實驗均重復3次以上。

(1)DPPH自由基:精確吸取不同濃度的茶多糖樣品和BHT溶液各1 mL置于10 mL刻度離心管中，然后加入0.08 mmol/L的DPPH溶液(乙醇為溶劑)3 mL，室溫，避光反應25 min，最后于517 nm測其吸光度值，按照下述公式計算清除率:

IR/%= ［(Ai-Ab)/Aj］× 100

其中，Ai為樣品吸光值(多糖樣品 +DPPH);Aj為陰性對照(DPPH+樣品溶劑);Ab為樣品本底吸光值(樣品 +溶解DPPH的溶劑)。

(2)超氧陰離子:量取不同濃度的茶多糖樣品和BHT溶液各1 mL置于10 mL刻度離心管中，然后加入0.08 mol/L的NBT水溶液1 mL，再加入1 mL的NADH水溶液(濃度為0.5 mol/L)，最后加入0.5 mL的PMS水溶液，室溫下搖勻、反應10 min，而后于560 nm測其吸光度值，按照下述公式計算清除率:

IR/%= ［(Ai-Ab)/Aj］× 100

其中，Ai為樣品吸光值(多糖樣品 +NBT+NADH+PMS);Aj為陰性對照(NBT+NADH+PMS+樣品溶劑);Ab為樣品本底吸光值(樣品 +蒸餾水)。

(3)羥基自由基:參照 Tian［11］，He［12］等方法進行。

(4)ABTS自由基:①ABTS自由基的制備:7 mmol/L的ABTS水溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合;②取不同濃度的茶多糖樣品和BHT溶液各0.5 mL加入含有3.5 mL的ABTS自由基溶液的離心管中，室溫、靜置10 min，最后于734 nm測其吸光度值，按照下述公式計算清除率:

IR/%= ［1-(Ai-A0)/Aj］× 100

其中，Ai為樣品吸光值(多糖樣品 +ABTS);Aj為陰性對照(ABTS+樣品溶劑);A0為樣品本底吸光值(樣品+溶解ABTS的溶劑)。

1.2.3 不同組分的SGTPs對乳腺癌細胞(MCF-7)的生長抑制作用

在體外培養的腫瘤細胞模型上，以MTT法篩選具有抑制 MCF-7細胞生長的活性多糖組分［12-14］。具體而言，取對數生長期細胞，制成細胞懸液，并調濃度至5×104～1×105個/mL，接種于96孔細胞培養板。每孔加90 μL，置37℃，5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，分別加入10 μL用生理鹽水配制而成的不同濃度(0.0、50.0、150.0、200.0 μg/mL)的茶多糖樣品溶液，以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為陽性對照，生理鹽水和培養液作為陰性對照，繼續培養44 h，加入20 μL MTT(5 mg/mL)，4 h后加入SDS三聯液終止反應，在酶標分析儀570 nm處測定吸光值，每個處理設3個重復。按以下公式計算細胞生長抑制率:

2 結果與分析

2.1 商洛綠茶多糖的分離純化

如圖1所示為SGTPs經DEAE-52纖維素柱分離后的結果。洗脫液分別采用0.05、0.15、0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，得到3個單一的洗脫峰。將收集到的 0.05、0.15、0.45 mol/L NaCl洗脫液洗脫部位，減壓蒸餾，透析(分子截留量8 000 Da)3 d，每天換6次水，冷凍干燥，得到SGTPs-1、SGTPs-2、SGTPs-3三個組分。經測定3個組分的總糖含量分別為83.5%，76.8%，89.7%。

圖1 SGTPs的DEAE纖維素柱色譜圖Fig.1 Eluting curve of SGTPs on DEAE-52 column

2.2 SGTPs對DPPH自由基的清除能力

從圖2中可以看出，SGTPs不同組分對DPPH自由基的清除率隨著樣品質量濃度的增加而逐步增加，并且呈現出較好的量效關系。尤其是在高濃度的時候，樣品對DPPH自由基的清除率越接近相同劑量的陽性對照。另外，從圖中還可以發現，SGTPs-2對DPPH自由基的清除能力最弱，SGTPs-3的清除能力最強，SGTPs-1介于二者之間，這可能是因為其多糖含量各異的緣故。

圖2 SGTPs對DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of SGTPs

2.3 SGTPs對超氧陰離子的清除作用

由圖3中可以看出，SGTPs不同組分對超氧陰離子自由基的清除率隨著樣品質量濃度的增加而呈現較為緩慢的增加，但依然呈現出良好的量效關系。另外，從圖中還可以發現，SGTPs-2對DPPH自由基的清除能力最弱，SGTPs-3的清除能力最強，SGTPs-1介于二者之間。當樣品質量濃度達到4.0 mg/mL時，SGTPs-1、SGTPs-2和SGTPs-3對超氧陰離子的清除率分別為52.4%，46.3%，63.7%，而此時相同劑量的陽性對照清除率為100%。由此可見，SGTPs不同組分對超氧陰離子自由基的清除能力要比同劑量的陽性對照低的多。眾所周知，每個人體內都有一定數量的超氧陰離子存在，如若不發生化學變化則對人體無害，但是受到外界刺激或是與羥基結合后的產物會導致細胞DNA損傷，破壞機體功能。研究表明，一定量的SGTPs能夠起到清除超氧陰離子的效果，由此推測長期飲茶可以起到預防超氧陰離子對機體造成的損傷。

2.4 SGTPs對羥基自由基的清除作用

從下圖4中可以看出，SGTPs不同組分對羥基自由基的清除率隨著劑量不斷增加幾乎呈線性遞增的趨勢。當樣品質量濃度從1.0 mg/mL增加到4.0 mg/mL的時候，SGTPs-3對羥基自由基的清除率依次為13.6%，24.5%，35.8%，43.7%，49.4%，55.5%，61.2%;SGTPs-1對羥基自由基的清除率則從8.5%上升到58.3%;而SGTPs-2對羥基自由基的清除率增長最為緩慢，亦是3個組分中清除率最低的一個組分，由此可見這與其多糖含量最低是分不開的。

圖3 SGTPs對超氧陰離子的清除率Fig.3 Superoxide radical scavenging activity of SGTPs

圖4 SGTPs對羥基自由基的清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of SGTPs

2.5 SGTPs對ABTS自由基的清除作用

從圖5中可以看出，隨著質量濃度的不斷遞增，SGTPs不同組分對ABTS自由基的清除率逐漸增加，而且呈現出較好的量效關系。尤其是當濃度為4.0 mg/mL時，樣品對DPPH自由基的清除率接近相同劑量的陽性對照，SGTPs-1，SGTPs-2，SGTPs-3以及BHT對 ABTS自由基的清除率依次為80.4%，75.7%，85.8%和100%。另外，從圖中還可以發現，SGTPs三個組分對ABTS自由基的清除率順序仍然是SGTPs-3＞SGTPs-1＞SGTPs-1。SGTPs-2仍然是活性最弱的。

圖5 SGTPs對ABTS自由基的清除率Fig.5 ABTS radical scavenging activity of SGTPs

2.6 SGTPs不同組分對不同自由基體系的半數有效濃度(EC50)

半數有效濃度(EC50)，即能引起50%陽性反應(質反應)或50%最大效應(量效應)的濃度。半數有效濃度可快速地判斷被試物質對反應體系可能產生的影響或效果，為進一步作慢性毒性研究提供依據。從下表1中可以看出，SGTPs各組分對不同自由基的EC50差異較大，有的組分與陽性對照差距比較小，而有的組分差距較大。其中，3個組分當中SGTPs-3的EC50相比之下是最小的，SGTPs-2則是最大的。另外，從中也可以看出，SGTPs對ABTS自由基的清除作用最好，其次是DPPH自由基，最后是超氧陰離子和羥基自由基?？傮w而言，3個組分總的抗氧化能力順序依次為SGTPs-3＞ SGTPs-1＞SGTPs-2。

表1 SGTPs對各自由基體系的EC50 單位:mg/mLTable 1 The free radical system EC50 of SGTPs

2.7 SGTPs不同組分對MCF-7細胞的生長抑制作用

從圖6中可以看出，SGTPs不同組分對MCF-7細胞均有不同程度生長抑制作用，并且呈現良好的劑量效應關系。而且當 SGTPs濃度在200 μg/mL時，SGTPs-1的抑制率為51.29%，SGTPs-2的抑制率為48.63%，SGTPs-3的抑制率為61.83%，而此濃度下陽性藥物的抑制率為70.71%。另外，3個組分的半數抑制濃度(IC50)依次為 206.55，227.91，157.06 μg/mL，而陽性對照的則是110.64 μg/mL，結果表明SGTPs-3對MCF-7細胞的生長抑制作用最強。同時，在相同時間、相同劑量的條件下，SGTPs處理后細胞的生長抑制率接近于同濃度的陽性藥物(5-FU)，說明商洛綠茶茶多糖對MCF-7細胞又較好的生長抑制作用。

3 結論

(1)通過熱水浸提-乙醇沉淀法制備的粗多糖，經DEAE-52纖維素柱層析純化后得到SGTPs-1，SGTPs-2，SGTPs-3三個組分，多糖含量分別為83.5%，76.8%，89.7%。

圖6 SGTPs不同組分對MCF-7細胞的抑制率Fig.6 The different fractions of SGTPs on the inhibition rate of MCF-7 cells

(2)SGTPs對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基和超氧陰離子均有不同程度的清除能力，其中對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力較強，對另外兩種自由基清除能力相對較弱?？傮w而言，商洛綠茶多糖3個組分對不同自由基的清除能力均呈現良好的量效關系，其中SGTPs-3組分的作用最強，其次為SGTPs-1，最后是SGTPs-2。當質量濃度達到4.0 mg/mL時，SGTPs-3對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基和超氧陰離子的清除率分別為85.4%，85.8%，61.2%和63.7%。

(3)對乳腺癌MCF-7細胞的生長抑制作用研究結果表明，SGTPs3個組分對MCF-7細胞均有一定的生長抑制作用，且伴隨著質量濃度的增加而呈現遞增趨勢。在濃度為200 μg/mL時，SGTPs三個組分的生長抑制率分別為51.29%，48.63%和61.83%。

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