hTfR基因在體外神經干細胞的表達研究

岳四海 郭永坤

鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經外科 鄭州 450007

干細胞是臨床再生替代治療極其重要的資源，干細胞移植治療多種疾病的有效性和潛能日益受到重視，有著廣闊的應用前景［1-5］。分子影像學，特別是MR 的發展使在活體狀態下示蹤移植干細胞成為現實。MR 具有極其精細的組織分辨率、空間分辨率、無游離輻射和非侵襲性等特點，通過MR報告基因介導的分子成像可以監測移植細胞的分布、動態遷移的過程以及與宿主的整合情況。其中人轉鐵蛋白受體（human transferrin receptor，hTfR）報告基因在MR 分 子成像中受到高度重視和廣泛的關注［6］。本實驗通過構建hTfR 慢病毒表達載體，為下一步以hTfR 為報告基因的活體干細胞MR 分子成像奠定基礎，以期為今后臨床活體示蹤干細胞提供一種新的途徑和方法。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 質粒和菌株：pENTR221-hTfR質粒購于廣州復能基因有限公司；pLENTI6．3 載體由中國人民解放軍北京軍區總醫院楊志軍教授惠贈；E．coli DH5a 感受態細菌購于天根生化科技（北京）有限公司；小鼠神經干細胞胚胎來源CD1，小鼠神經干細胞由中國人民解放軍北京軍區總醫院楊志軍教授惠贈。

1．1．2 主要試劑：T4連接酶、限制性內切酶和堿性磷酸酶購自NEB 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自OMEGA 公司；DAN Maker購自天根生化科技（北京）有限 公 司；lipofectamine 2000、Opti-MEM培養液、293T 細胞、B27、Neurobasal培養基、多聚賴氨酸均購于Sigma公司；DMEM 培養基、DMEM／F12（1∶1）培養基購于Hyclone公司；兔抗人轉鐵蛋白受體（hTfR）單克隆抗體購于Epitomics公司。

1．2 方法

1．2．1 PCR 引物的設計和合成：根據Genbank收錄的hTfR序列（BC001188）設計引物，在上游引物的5＇端加入Bamh1酶切位點和Kozak序列，下游引物的5＇端加入BamH1酶切位點。上游引物序列：5＇-CGC［GCCACC］ATGAT-GGATCAAGCTAGAGATCAGC-3＇（下劃線部分為BamH1酶切位點，括號內部分為Kozak 序列）；下游引物序列：5＇-CGCTTAAAACTCATTGCAATGTCCCAAC-3 ＇（下劃線部分為BamH1酶切位點）。引物送北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1．2．2 PCR 擴增hTfR 基因和膠回收：為保證基因克隆的正確率，采用具有高保真性和高擴增效率的PfuDAN 聚合酶。以pENTR221-hTfR基因質粒為模板，擴增hTfR。PCR反應條件為：94°C預變性3min，94°C變性45s，60°C退火45s，72°C 延伸4 min，共25 個 循環，72°C 延伸10 min。PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按照試劑盒說明書回收目的基因。

1．2．3 重組質粒pLENTI6．3-hTfR-IRES-EGFP的構建：對空載體pLENTI6．3和PCR 的回收目的產物分別用BamH1進行酶切，反應條件為：37°C，4h；在酶切反應2h時用NEB的堿性磷酸酶進行去磷酸化反應，以減少載體自連產生假陽性克??；對酶切載體進行1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收；酶切目的片段的純化，根據PCR 清潔試劑盒說明書進行。將去磷酸化的酶切載體和目的片段按5∶1的摩爾比例，用T4DNA 連接酶進行連接反應，4 ℃，連接過夜；次日連接產物轉化E．coli DH5a感受態細菌，涂布氨芐（Amp）抗性LB平板，37 ℃搖菌過夜培養。

1．2．4 克隆鑒定：轉化后，挑取單菌落，用上述設計合成好的PCR 的引物，進行PCR 擴增檢測陽性菌落，反應條件為：94℃預變性3min，94變性45s，60℃退火45s，72℃延伸4 min，共25個循環，72°C 延伸10min；PCR 產物行1%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定。挑取陽性菌落接種于5mL Amp 抗性的LB培養基中，37℃220r／min搖菌過夜培養；按質粒提取試劑說明書提取質粒，并行BamH1酶切，反應條件為：37℃，4h，酶切產物1%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定。酶切鑒定符合理論值的質粒菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1．2．5 慢病毒顆粒的包裝：接種293T 細胞，次日觀察細胞密度，達到80%融合率時用制備的重組質粒pLenti6．3-hTfR-IRES-EGFP與PLP1、PLP2、PLP-VSVG 在轉染試劑lipofectamine 2 000下共轉染293T 細胞。培養6h后，更換完全培養液DMEM ＋10%FBS。轉染48h后收集病毒上清，0．45μm 的濾器過濾；將病毒原液在50 000g下超速離心2 h，收集沉淀，重懸于opti-MEM 培養液中，取部分濃縮病毒液進行滴度測定，其余分裝成小管保存于-80 ℃，用于下一步實驗。

1．2．6 NSCs復蘇培養及慢病毒的感染：將凍存的細胞從液氮中取出，快速轉入到37 ℃水浴中，邊解凍，邊振蕩，待細胞解凍；將細胞轉移到2倍體積的神經干細胞培養基中，1 000 r／min，離心3min，去上清；神經干細胞培養基重懸細胞，調整細胞濃度，按1×106Cells／（6 mL·瓶）接種于25cm2的培養瓶，37 ℃，5%CO2培養箱中培養。取生長狀態良好的第7代NSCs，接種到12孔板中培養3h后，每孔加入MOI值為10的病毒稀釋液，設置空載體和空白細胞作為對照組。感染12h后半量換液一次，以后每24h半量換液1次，72h后倒置熒光顯微鏡下觀察感染情況。

1．2．7 Western blot檢測TfR 蛋白的表達水平：將1×106個過表達hTfR 的NSCs用200μL×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液重懸，煮沸5～10min直接裂解，提取總蛋白，設置EGFP-NSCs組和NSCs組作為對照。各組取15μL 蛋白上樣，經10%SDS-PAGE 凝膠電泳、半干轉法將蛋白樣品轉移到PVDF膜、5%BSA 封閉1h，兔抗人hTfR 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔多克隆抗體（1∶2 000），室溫孵育1h，化學熒光檢測。

2 結果

2．1 hTfR 基因的擴增 以pENTR221-hTfR 為模板，經PCR 擴增后，1%的瓊脂糖凝膠電泳可見1條長約2 283bp的亮帶，與理論值一致。見圖1。

2．2 重組載體酶切鑒定和測序 提取菌落陽性克隆8的質粒，行BamH1酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示：酶切圖譜有11條長約2 283bp的亮帶。見圖2。送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序結果顯示：hTfR 基因序列正確，無突變或缺失。以上結果表明pLENTI6．3-hTfRIRES-EGFP 重組慢病毒表達載體構建成功。

圖1 hTfR PCR 產物電泳結果圖

圖2 pLENTI6．31-hTfRIRES-EGFP重組慢病毒表達載體BamH1酶切后電泳圖

2．3 hTfR 在NSCs中的熒光表達 慢病毒感染48h后可見部分細胞開始有微弱綠色熒光出現，其后綠色熒光逐漸增強，72h可見幾乎每個神經球都有綠色熒光，部分神經球熒光比較強，表明hTfR慢病毒成功高效的感染NSCs。見圖3。

圖3 hTfR 在NSCS中的熒光表達

2．4 Western blot檢測hTfR 蛋白的表達水平 目的條帶出現在相對分子量為90u區域附近，與理論值一致，hTfRNSC組蛋白表達量明顯高于EGFP-NSC 組和NSC 組，對照組hTfR 的表達量很低，結果顯示實驗組細胞的hTfR 的表達水平明顯增加。見圖4。

圖4 Western blot檢測hTfR 蛋白的表達結果1．hTfR-NSC組；2．EGFP-NSC組；3．NSC組

3 討論

hTfR 是一種廣泛分布于細胞膜的跨膜糖蛋白，但其表達具有明顯的組織分布差異性，在高增殖的基底上皮細胞和腸上皮細胞等有較高水平的表達，也在非增殖的細胞中表達，如腦毛細血管內皮細胞、肝細胞、胰腺、睪丸細精管等。hTfR位于人的第3 號染色體，編碼區（CDS）長2 283bp。hTfR 的表達主要受細胞內鐵的水平進行轉錄后水平的調節，hTfR mRNA3＇端非編碼區存在5個連鎖作用的鐵效應元件（five iron response elements，IRE）是hTfR 表達調控的關鍵結構，這些鐵的效應元件被2種RNA 結合的鐵調節蛋白（iron regulatory proteins，IRP）識 別，并 控 制mRNA的穩定性［7］。當細胞內鐵不足時，IRP-1 結 合IRES 增加了TfR mRNA 的穩定性，因此TfR 的mRNA 被翻譯，增加了細胞表面的TfR。

目前，干細胞活體非侵襲性示蹤的分子影像學技術主要有光學成像、核素成像和磁共振成像（MRI）等。相比其他技術，MRI有著極其精細的空間分辨率和組織分辨率，對深層組織成像無困難，且無電離輻射，已廣泛用于臨床；對于移植的干細胞，MRI還可以獲得移植周圍組織的解剖和生理信息，包括移植灶周圍的水腫和炎癥，這些為臨床醫生提供了更多的信息，有助于了解細胞移植治療的各個方面［8］。以報告基因為基礎的MRI具有MR 信號不會或很少受干細胞分裂的影響，且報告基因的表達產物可以反映干細胞的功能和活力等優點［9-10］。目前，用于MRI的報告基因有β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶、轉鐵蛋白受體、鐵蛋白、富含賴氨酸蛋白等，其中轉鐵蛋白受體的報告基因應用最為廣泛［11］。hTfR 是細胞膜上的受體蛋白，與特異性配體轉鐵蛋白（Tf）結合介導Fe的細胞內轉運。在MR 的分子影像中，將hTfR 基因導入干細胞，干細胞過表達hTfR，與Tf連接的磁性氧化鐵即Tf的分子探針，通過轉鐵蛋白受體介導的內吞作用轉運到細胞內。這樣干細胞內磁性氧化鐵納米顆粒的蓄積，實現了MRI信號的逐步放大，提高了對干細胞信號的敏感性，從而獲得MR T2WI上特征性的低信號［12］。Wang 等［13］應用轉鐵蛋白受體（TfR）作為報告基因，轉鐵蛋白偶聯的超小順磁性氧化鐵納米顆粒的復合物（Tf-USPIO）作為MR 的報告探針，對小鼠MDA-MB-231 細胞的乳腺癌的動物模型靜脈注射Tf-USPIO 分子探針，發現腫瘤MR T2的弛豫時間比較對照組顯著縮短，表明轉鐵蛋白受體為報告基因成功進行了MR活體分子成像，可以對內皮抑制素基因的表達和治療進行了活體動態監測。目前的研究表明，TfR 報告基因介導的Tf-USPIO 分子探針的細胞轉運和蓄積，能夠對TfR 進行MR基因顯像和示蹤，并可以檢測TfR 的表達水平［14-16］。

與其他病毒載體系統相比，慢病毒可以穩定高效的感染分裂和非分裂細胞，無明顯免疫反應，同時能夠轉染廣泛的組織等優點，近年來被廣泛用于基因的轉導載體［17-20］。因此通過慢病毒介導的基因轉導，使報告基因在靶細胞穩定的表達，從而達到長期檢測的目的。本實驗中，只擴增了hTfR 編碼區2 283bp，去除了細胞內Fe對的調控。采用高保真的Pfu DNA 聚合酶擴增目的片段，減少了堿基的錯配或突變。對于重組質粒的鑒定，首先進行了簡單快速的菌落PCR 初步篩選鑒定，用初步篩選的陽性克隆，搖菌、小提質粒、酶切鑒定和基因測序，結果證實pLENTI6．3-hTfR-IRES-EGFP重組慢病毒表達載體的構建成功。本實驗應用慢病毒包裝系統包裝出含有hTfR 基因的高滴度病毒，高效地感染到NSCs中。Western blot分蛋白證實了hTfR 的過表達。

干細胞低水平表達hTfR，且受細胞內IRE 的負反饋調節［8］，無法實現以hTfR 為標記物的MR 分子影像成像。因此，如果利用轉基因的方法，將hTfR 基因導入干細胞內，使其過表達hTfR，因而干細胞可攝取較多的磁性氧化鐵納米顆粒，使其在MR T2WI信號特異性減低，從而達到對移植后干細胞長期無侵襲性的活體示蹤。我們構建的pLENTI6．3-hTfR-IRES-EGFP重組慢病毒載體，還帶有EGFP 報告基因，通過組織冰凍切片的熒光顯微鏡檢測，進行離體狀態下的EGFP報告基因熒光成像，從而達到活體和離體檢測的相互印證。本實驗為下一步進行NSCs體外、體內的MR 分子成像研究奠定了基礎。

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