含維生素組合定癇膠囊與定癇膠囊加服維生素組合控制癲癇的療效

常曉波

三二〇一醫院 漢中 723000

癲癇是一種反復發作的慢性短暫性的腦功能失調的綜合征，以反復的神經元異常放電為主要特征［1］。癲癇是神經內科的常見病，其發病率僅次于卒中。癲癇的治療主要是控制癇性發作，目前以藥物控制為主，臨床根據癲癇類型選擇藥物，應不間斷服藥，主張單一用藥，若效果不理想可以兩種及以上藥物聯合應用［2］。近年來重要制劑在癲癇控制中的應用得到較為廣泛的關注，但有效的藥物報道較少［3］。本次研究應用60只大鼠作為實驗材料，對比含維生素組合定癇膠囊與定癇膠囊加服維生素組合用于癲癇控制的療效。

1 材料

1．1 實驗動物 選用60只健康的雄性Wistar作為實驗材料，體質量180～200g，平均（189．2±7．4）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證號14-0122。

1．2 藥物 戊四氮（Pentetrazole，PTZ，北京寰宇科創生物科技發展有限公司，批號：20130511）。菖連定癇膠囊（保定世臣癲癇病醫院，批號：20120211）；維生素：谷維素（上海青平藥業有限公司，批號：20121103），維生素C（四川金藥師制藥有限公司，批號：20131105）；維生素B6（浙江天新藥業有限公司，批號：20130701），磷酸氫鈣（南寧康諾生化制藥有限責任公司，批號：201200706）。含維生素組合菖連定癇膠囊（保定世臣癲癇病醫院，批號：20130207），維生素組合：谷維素10mg／kg，維生素B62mg／kg，維生素C 66 mg／kg，磷酸氫鈣66mg／kg。丙戊酸鈉（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：20130211）。

2 方法

2．1 模型構造 采用戊四氮腹腔注射（ig）法構建大鼠的癲癇模型：每天上午9：00～11：00時給大鼠注射PTZ，劑量為30～40mg／kg。對于出現持續性的Ⅵ級癲癇發作的個體立即注射1mL 7%的水合氯醛搶救。

2．2 分組及用藥 60只大鼠按照隨機數字法分為5組：A組（空白對照組）12只，不注射PTZ和抗癲癇藥物；B～E 組的48只大鼠均應用PTZ構建癲癇大鼠模型：B組（模型對照組）12只，灌服生理鹽水；C組（丙戊酸鈉組）12只，大鼠灌服丙戊酸鈉控制癲癇發作，劑量為15．75mg／kg；D 組（定癇膠囊＋維生素組合）灌服400 mg／kg的菖連定癇膠囊和維生素；E組（含維生素組合菖連定癇膠囊）灌服含維生素組合菖連定癇膠囊，劑量為500mg／kg。研究期間均采用普通飼料喂養，自由飲水。

2．3 大鼠海馬區Bcl-2的表達水平檢驗

2．3．1 大鼠海馬組織的獲?。河盟下热┙浉骨蛔⑸渎樽泶笫?，打開胸腔，經升主動脈快速靜滴200mL 生理鹽水，繼而注射200mL 的4%的多聚甲醛，先快速灌注，再緩慢靜滴，然后取大鼠腦組織。在大腦的視交叉與視乳頭切取冠狀組織，剝離左右海馬。

2．3．2 PCR 檢測：大鼠的Bcl-2引物由上海生物工程公司合成，參照物選擇GAPDH，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。DNA 模板5μL，PCR 緩沖液2μL，dNTP 2μL，MgCl 2 2μL，引物1（upward）0．5μL，引物2（downward）0．5μL，dH2O 7．75μL，Tag 0．25μL，共20μL 配成反應體系。94℃變性5min，94℃1min，5℃1min，72℃1min，順序循環35次，72 ℃延伸5min，產物4 ℃保存。擴增產物在瓊脂糖凝膠板上電泳，在凝膠自動成像儀下成像，觀察、判定結果。2．3．3 Western blot法：使用Western blot檢測大鼠海馬組織中Bcl-2的表達水平：將組織剪開，加入胰蛋白酶消化，離心后收集細胞。使用預冷PBS洗滌將細胞沖洗2遍，裂解細胞后獲取總蛋白。將蛋白定量后經SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉、切膜后加入兔抗鼠Bcl-2抗體（上海億欣生物科技有限公司），4℃孵育過夜，洗滌后加入二抗（羊抗兔抗體），室溫孵育1．5h后洗膜，ECL試劑盒曝光顯影。

2．4 觀察指標 （1）比較4組癲癇大鼠的驚厥發生率和病死率。（2）觀察大鼠的癲癇發作級別的變化，分級標準［4］：未表現出行為發作為0 級，出現節律性點頭或頭部抽搐為1級，出現陣攣性咀嚼者為2級，出現前置陣攣性抽搐和頭部震顫為3級，上身直立者為4級，大鼠跌倒者為5級，出現強直性驚厥者為6級。（3）比較實驗前、用藥1周、2周和4周后大鼠的驚厥持續時間和體質量的變化。（4）比較5組大鼠4周后海馬區Bcl-2的表達水平變化。

2．5 統計學處理 采用SPSS 15．0軟件進行分析，計量資料用±s表示，采用t檢驗和重復測量方差分析；計數資料采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

3 結果

3．1 癲癇大鼠的驚厥發生率和病死率比較 4周后4組癲癇大鼠的驚厥發生率和病死率有統計學意義（P＜0．05）。見表1。

表1 大鼠驚厥發生率和病死率比較 ［n（%）］

3．2 用藥前后大鼠癲癇發作級別的變化比較 與用藥前相比，C～E組大鼠的癲癇發作級別均明顯減輕（P＜0．05）；C～E組大鼠用藥后的癲癇發作級別較B 組明顯減輕（P＜0．05）。見表2。

表2 用藥前后大鼠的癲癇發作級別的變化 （±s）

表2 用藥前后大鼠的癲癇發作級別的變化 （±s）

組別 n 癲癇發作級別用藥前 用藥后B組12 4．1±1．2 3．8±0．9 C組 12 4．2±1．3 1．9±0．4 D 組 12 4．0±1．1 2．0±0．6 E組 12 4．1±1．4 1．8±0．5組間 F＝5．73，P＜0．05時間 F＝6．12，P＜0．05組間＊時間 F＝2．07，P＞0．05

3．3 含維生素組合定癇膠囊與定癇膠囊加服維生素組合對驚厥持續時間和體質量的影響 與用藥前相比，C～E 組大鼠的驚厥持續時間均明顯縮短（P＜0．05）；C～E組大鼠用藥后的驚厥持續時間較B組明顯縮短（P＜0．05）；與用藥前相比，C～E組大鼠的體質量均明顯增加（P＜0．05）；C～E組大鼠用藥后的體質量較B組明顯增加（P＜0．05）。見表2。

表3 大鼠癲癇發作時間和體質量變化比較 （±s）

表3 大鼠癲癇發作時間和體質量變化比較 （±s）

組別 n 驚厥持續時間（min） 體質量（g）用藥前 1周后 2周后 4周后 用藥前 1周后 2周后 4周后B組 12 44．12±9．96 43．15±7．82 42．12±8．01 41．02±8．82 189．23±7．91 198．12±6．98 202．78±9．11 207．23±10．35 C組 12 45．32±10．02 32．14±5．83 28．85±4．02 14．18±2．15 191．82±8．17 218．23±10．25 252．25±15．98 285．12±24．87 D組 12 45．11±9．08 34．17±6．02 30．11±4．78 16．15±2．34 188．79±7．82 215．87±9．95 248．97±14．89 278．98±25．02 E組 12 45．16±9．45 32．08±5．65 27．31±4．52 13．97±2．18 192．13±7．23 220．94±11．24 255．45±17．32 291．82±27．13組間 F＝9．12，P＜0．05 F＝15．32，P＜0．05時間 F＝8．78，P＜0．05 F＝11．08，P＜0．05組間＊時間 F＝2．83，P＜0．05 F＝3．52，P＜0．05

3．4 大鼠海馬區Bcl-2的mRNA 水平和蛋白水平檢測 4周后5組大鼠海馬區的Bcl-2的mRNA 水平比較差異有統計學意義（t＝4．72，P＜0．05），Bcl-2蛋白水平差異有統計學意義（t＝3．97，P＜0．05）。見圖1和圖2。

圖1 大鼠海馬區Bcl-2的蛋白質水平比較

圖2 大鼠海馬區Bcl-2的mRNA 水平比較

4 討論

癲癇是神經元異常放電引起的慢性的反復發作的腦功能失調綜合征，戊四氮腹腔注射是目前較為常用的誘導癲癇動物模型的方法［5］。臨床上的癲癇控制以藥物為主，盡管西藥控制癲癇盡管療效強、見效快，但不良反應較強，臨床應用具有一定的局限性；研究發現，中藥制劑用于癲癇控制長期療效較為穩定，近些年來得到較為廣泛的關注［6］。

中藥制劑治療癲癇的關鍵在于調整患者的功能狀態。維生素C可以有效對抗自由基，有效避免神經元的氧化破壞，同時可以增加細胞內的鈣離子濃度［7-8］。維生素B6的缺乏可導致腦內谷氨酸脫羧酶的活性下降，誘發癲癇發作［9-10］。中藥制劑和維生素聯合應用在癲癇的控制中具有一定的療效。本次研究中，通過腹腔注射，筆者成功構建了48只大鼠的癲癇模型，用藥4周后，灌服丙戊酸鈉、定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合大鼠的驚厥發生率和病死率明顯低于模型對照組大鼠，且癲癇發作級別、驚厥持續時間和體質量均明顯改善，3組服藥的大鼠的療效相當，說明定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合在癲癇控制中療效較為明顯，與丙戊酸鈉相當。癲癇的發生機制較為復雜，研究顯示，癲癇持續發作狀態可以導致神經元的損傷與凋亡，Bcl-2對于海馬內損傷神經元具有一定的保護作用，Bcl-2的表達可以增加細胞對多數DNA 有害因子的抵抗能力［11-13］。與空白對照組相比，48只癲癇大鼠的Bcl-2表達水平均明顯下降，說明癲癇大鼠的Bcl-2表達水平下降。服用丙戊酸鈉、定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合大鼠的Bcl-2表達水平高于模型大鼠組。說明定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合菖連定癇膠囊以及丙戊酸鈉均可有效對抗大鼠海馬神經元的凋亡［14-15］。

本次研究顯示，PTZ引發癲癇的大鼠在經定癇膠囊＋維生素組和含維生素組合菖連定癇膠囊治療后，大鼠的驚厥發生率、病死率和癲癇發作級別均明顯優于模型對照組，前2組大鼠的大腦海馬組織中的Bcl-2表達水平均明顯高于模型組大鼠，灌服定癇膠囊＋維生素組和含維生素定癇膠囊的2組大鼠的驚厥發生率、病死率、癲癇發作級別、警覺持續時間、體質量和Bcl-2表達水平無明顯差異。綜上，中藥制劑應用于癲癇控制療效穩定，不良反應較輕，具有一定的應用價值。

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