HPLC法同時測定茶葉中兒茶素類和咖啡因的含量

張　琪，徐維玲，李翠芹，*

（1.教育部藥用資源與天然藥物化學重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710062；2.西安鴻生生物技術有限公司，陜西西安710065）

ZHANG Qi1，XU Wei-ling2，LI Cui-qin1，*

（1.Key Laboratory of the Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Xi’an Honson Biotechnology Limited Company，Xi’an 710065，China）

HPLC法同時測定茶葉中兒茶素類和咖啡因的含量

張琪1，徐維玲2，李翠芹1，*

（1.教育部藥用資源與天然藥物化學重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710062；2.西安鴻生生物技術有限公司，陜西西安710065）

為了建立了一種等度洗脫茶葉中6種兒茶素類沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）及限量成分咖啡因（CAF）的高效液相色譜（HPLC）定量測定的方法，采用漢邦BenetnachTM C18（5μm×4.6mm×250mm）色譜柱，流動相為甲醇∶水∶磷酸（28∶72∶0.1，v/v/v），流速為0.8mL·min-1，UV檢測波長為280nm，柱溫為30℃。結果表明GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF分別在0.10～1.00、0.16～1.00、0.10～1.00、0.05～0.50、0.10～1.50、0.10～2.00和0.02～1.00mg·mL-1內線性關系良好，相關系數在0.9984～0.9999間；平均加樣回收率為100.89%（EGCG），99.07%（CAF）；樣品分析中，除GC的分離度RS＞1外，其他6個成分RS均＞2。該方法簡單、快速、準確、重現性好，可用于兒茶素類和咖啡因的定量檢測。

兒茶素類，表沒食子兒茶素沒食子酸酯，咖啡因，HPLC

ZHANG Qi1，XU Wei-ling2，LI Cui-qin1，*

（1.Key Laboratory of the Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Xi’an Honson Biotechnology Limited Company，Xi’an 710065，China）

茶多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、調血脂和降血糖等藥理作用，被廣泛應用于食品、醫藥保健品、功能性飲料和化妝品中[1-3]。茶多酚產品的開發和應用前景十分誘人，是近些年來研究的熱點。兒茶素類是茶多酚中的主成分，也是其主要的藥理活性物質，占茶多酚含量的60%～80%[4]。其中幾種主要兒茶素表兒茶素（EC）、兒茶素（C）、表沒食子兒茶素（EGC）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）是茶葉品質和茶多酚產品質量控制的重要指標，尤其是含量最高活性最強的指標性成分EGCG[1]。CAF是存在于茶葉中最主要的嘌呤類生物堿，過多攝入會對人體產生諸多不利影響[5-6]，控制咖啡因的含量也是質量控制重要指標之一[7]?？焖儆行У臏y定兒茶素類和咖啡因的含量已成為茶葉品質認定和茶多酚產品質量控制首當其沖的問題。關于HPLC法分析測定茶多酚中兒茶素類和咖啡因的含量已有很多文獻報道，大多采用梯度洗脫[8-17]，易出現基線不平、重復性差、分析時間較長和檢測設備要求高[11，18-22]等問題。

本研究以綠茶中EC、C、EGC、GC、EGCG、ECG和CAF為研究對象，采用等度洗脫同時測定綠茶中6種主要兒茶素類和咖啡因的含量，建立了一種快速、準確、重復性好且成本低廉的HPLC法分析測定茶葉中兒茶素和咖啡因含量的方法，適合大批樣品分析，易于推廣使用，為茶多酚產品開發利用和質量控制提供強有力的技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

12種商品綠茶均購自西安輕工茶葉批發市場，所有茶葉樣品經陜西師范大學生命科學學院植物學教研組鑒定；對照品C、EC、GC、EGC、EGCG和ECG均購自成都曼斯特生物科技有限公司，批號依次為13050702、13022906、12101105、12092908、12052801、12091603，純度＞98%；對照品CAF購自貴州迪大生物科技有限公司，批號58-08-2，純度≥99%；甲醇、磷酸均為色譜純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水自制。

LC-2010A高效液相色譜儀、UV檢測器、日本島津液相工作站日本島津公司；Milli-Q Reference超純水儀美國Millipore公司；萬分之一分析天平Sartorius科學儀器北京有限公司；恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電器有限公司；TCX-600S型超聲波清洗機濟寧天宇超聲機械設備有限公司；注射器、0.22μm濾頭濾膜等。

1.2實驗方法

1.2.1對照品的制備分別精密稱取對照品C、EC和GC各5.0mg，對照品EGC、EGCG、ECG和CAF各10.0mg，以甲醇為溶劑定容在5mL容量瓶中搖勻，分別制成1.0mg·mL-1和2.0mg·mL-1標準儲備液。分別吸取C、EC、GC、EGC和CAF標準儲備液400μL，ECG和EGCG標準儲備液200μL用甲醇稀釋定容于5mL容量瓶中，制成混合對照品溶液。

1.2.2試樣的制備精密稱取1.00g綠茶粉末（過80目篩）置于錐形瓶中，各加入25mL 70%甲醇，70℃水浴鍋中提取30min，抽濾，將濾液定容于100mL容量瓶中，過0.22μm微孔濾膜后進樣。

1.2.3色譜條件色譜柱：漢邦BenetnachTM C18色譜柱（5μm×4.6mm×250mm）；檢測波長：280nm；流動相為甲醇∶水∶磷酸（28∶72∶0.1，v/v）；流速：0.8mL·min-1；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

1.2.4線性關系和線性范圍的考察將標準儲備液分別稀釋成一系列濃度梯度的標準工作液，過0.22μm微孔濾膜后依次進樣10μL。以對照品含量為橫坐標，相對應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得到7種對照品的回歸線方程和線性范圍。

1.2.5樣品含量的測定按照1.2.2項下方法制備樣品溶液并適當稀釋，按照1.2.3項下方法進樣，用外標法計算各物質含量，每個樣品重復3次。

2　結果與分析

2.1色譜條件的選擇

以甲醇-水-磷酸為流動相，流速為0.8mL·min-1，可快速有效分離EC、C、EGC、GC、EGCG、ECG和CAF，結果見色譜圖，圖1（a、b）分別為混標色譜圖和樣品色譜圖。兒茶素類含多個酚羥基，水溶液呈酸性，堿性條件易被氧化，加酸不僅能防止拖尾改善峰形，還能抑制其水解和氧化褐變。結果證明目標成分對磷酸選擇性良好，該色譜條件下，目標成分與其他雜峰分離良好。

圖1?。╝）兒茶素類和咖啡因對照品色譜圖，（b）西鄉綠茶樣品色譜圖Fig.1?。╝）The HPLC chromatogram of the mixture of catechins and CAF standards，（b）the HPLC chromatogram of the sample Xixiang green tea

2.2兒茶素類和咖啡因的線性關系和線性范圍

GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF保留時間、回歸方程、相關系數和線性范圍如表1所示。結果表明，在給定的濃度范圍內線性關系良好。

2.3方法學考察

2.3.1精密度實驗將混合對照品溶液按照1.2.3項下方法連續進樣5次，進樣量10μL?？疾旆迕娣e的一致性，結果GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF峰面積RSD值分別為0.24%、0.15%、0.22%、0.25%、0.57%、0.11%和0.12%。

2.3.2重復性實驗取同一份樣品（西鄉綠茶）按

表1　兒茶素類和咖啡因線性關系和線性范圍（n=5）Table.1　The calibration curves and linear ranges of catechins and CAF（n=5）

1.2.2項下試樣制備方法制5份供試品溶液，按照1.2.3項下方法依次進樣，分別考察這7種化合物峰面積變化。GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF峰面積RSD值分別為2.95%、0.68%、2.28%、1.55%、1.61%、2.18%和0.51%

2.3.3穩定性實驗取1.2.2項下西鄉綠茶供試品按1.2.3項下色譜條件分別在0、4、8、12、24h進樣一次。記錄各物質峰面積，結果GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF 24h內峰面積RSD值分別為0.49%、2.25%、2.91%、0.74%、0.73%、3.33%和0.52%，表明EGC、C和EC在24h內基本穩定，GC、EGCG、ECG和CAF在24h內穩定性良好，能滿足測定要求。

2.3.4加樣回收率實驗同份供試品溶液按1.2.3項下色譜條件依次進樣，測定樣品中EGCG和CAF的含量。分別加入EGCG和CAF對照品儲備液90μL和50μL，充分混勻后再次進樣測定，計算回收率和RSD值。結果見表2，EGCG平均回收率100.89%，RSD值為2.00%；CAF平均回收率99.07%，RSD值為2.37%，表明EGCG和CAF的加樣回收率良好。

表2　EGCG和CAF加樣回收率實驗結果Table.2　The recovery test results of EGCG and CAF

圖2　不同茶葉樣品色譜疊加圖Fig.2　The HPLC chromatogram of various tea samples

表3　茶樣中兒茶素類和咖啡因的含量（±SD，n=3）Table.3　The contents of catechins and caffeine in tea samples（±SD，n=3）

表3　茶樣中兒茶素類和咖啡因的含量（±SD，n=3）Table.3　The contents of catechins and caffeine in tea samples（±SD，n=3）

注：“ND”表示not detected。

商品綠茶含量（mg·g-1）GC　EGC　C　EGCG　CAF　EC　EGC福建天山綠茶　7.27±0.15　21.14±0.24　ND　26.04±0.20　12.80±0.48　5.49±0.73　5.06±0.79廣西綠茶　6.07±0.24　14.19±0.07　ND　25.76±0.01　13.96±0.33　4.78±0.73　7.24±0.96杭州綠茶　9.61±1.17　12.08±0.48　ND　20.53±0.43　14.44±0.43　2.13±0.07　5.15±1.00四川雀舌　16.99±0.35　21.36±0.28　ND　28.65±0.10　21.65±0.03　2.81±0.22　13.18±0.16西鄉綠茶　15.08±0.50　20.59±0.67　ND　38.61±0.93　20.02±0.38　4.79±0.33　7.83±1.07浙江有機綠茶　7.38±0.35　17.24±0.61　ND　27.00±0.35　13.69±0.38　4.25±0.25　4.85±0.83紫陽綠茶　15.31±0.67　16.61±0.49　2.24±0.62　38.23±0.24　18.94±0.68　3.98±0.69　8.23±0.82浙江麗水綠茶　13.46±1.87　15.06±0.17　1.97±0.24　31.91±0.33　17.07±0.37　3.72±0.59　6.91±0.77湖北神農綠茶　21.26±0.37　9.35±0.33　2.62±0.10　13.38±0.78　5.67±0.09　3.40±0.64　5.81±0.57福建鐵觀音　6.04±0.12　20.49±0.33　ND　26.28±0.78　12.08±0.48　5.00±0.50　5.71±0.48有機鐵觀音　25.90±0.41　18.38±0.50　1.88±0.19　28.79±0.03　13.43±0.67　4.07±0.22　5.99±0.51西湖龍井　18.15±0.59　16.28±0.56　ND　39.58±0.49　18.49±0.34　4.42±0.09　11.22±0.86

2.4樣品測定結果

研究中發現，兒茶素類和咖啡因的分離測定對甲醇和水的比例比較敏感，本研究確定的色譜條件分離效果好，方法穩定。圖2為不同茶樣色譜疊加圖，除GC分離度＞1，其他5種兒茶素和咖啡因的分離度均＞2。盡管12種市售綠茶中所含化合物及其含量各有差異，但在該色譜條件下均能得到很好的分離測定，有力地論證了該法的可靠性。結果顯示該方法顯著優于劉小喬[12]和劉錦文[23]建立的方法，三種方法都采用甲醇-水-磷酸洗脫劑系統，本文建立的方法不僅采用簡單且應用性強的等度洗脫，還改善了劉小喬和劉錦文方法出現的酯型兒茶素嚴重拖尾的問題。同時，也解決了現行國標方法中EC和EGCG難分離的問題[10，12，24]。

表3為12種樣品茶葉中GC、EGC、C、EGCG、CAF、EC和ECG的含量，其中EGCG均為含量最高的組分。該結果表明，不同綠茶中兒茶素類和咖啡因的含量差別很大，6種兒茶素的含量也差別很大，這可能與綠茶的產地、日照、溫度、采摘季節，葉子的老嫩及茶樹品種的不同有關[25]，EGCG為綠茶中含量最高的兒茶素，這一結果也與Bansal等[8，16-18，20，26]研究結果一致。

3　結論

綠茶提取物成分復雜、干擾成分很多，國家標準[7，24]和一些前人相關研究多用梯度洗脫。本文建立的HPLC法，采用常用、低毒、且價格低廉的洗脫劑甲醇-磷酸-水進行等度洗脫，操作簡單，重現性好且對檢測設備要求低；通過線性實驗、精密度實驗、重復性實驗、穩定性實驗、加樣回收實驗和12種商品綠茶樣品含量的測定驗證了該方法的可靠性。該方法用時短，在26min內可完成7種成分的分離測定，快速、準確、分離度好，重復性高，可用于兒茶素類成分和咖啡因的分析測定，為茶葉的品質認定和指紋圖譜研究，以及茶多酚產品的質量控制提供基礎，適合推廣使用。

[1]Bansal S，Syan N，Mathur P，et al.Pharmacological profile of green tea and its polyphenols：a review[J].Medicinal Chemistry Research，2012，21（11）：3347-3360.

[2]張曉夢，倪艷，李先榮.茶多酚的藥理作用研究進展[J].藥物評價研究，2013，36（2）：157-160.

[3]匿名.茶多酚市場十分誘人[J].國內外香化信息，2003（6）：8.

[4]Wang LY，Qin PY，Hu Y.Study on the microwave-assisted extraction of polyphenols from tea[J].Frontiers of Chemical Engineering in China，2010，4（3）：307-313.

[5]姚永宏，柴友榮，李中林，等.降低茶葉咖啡堿的研究進展[J].西南農業學報，2009，22（6）：1799-1802.

[6]趙卉，杜曉.低咖啡堿茶的研究進展[J].華中農業大學學報，2008，27（4）：564-568.

[7]中華人民共和國輕工行業標準.食品添加劑茶多酚[S]. QB2154-1995.

[8]El-Shahawi M S，Hamza A，Bahaffi S O，et al.Analysis of some selected catechins and caffeine in green tea by high performance liquid chromatography[J].Food Chemistry，2012，134（4）：2268-2275.

[9]王麗麗，陳鍵，宋振碩，等.茶葉中茶多酚檢測方法研究進展[J].茶葉科學技術，2013（4）：6-12.

[10]周順珍，龔雪，周國蘭，等.HPLC法測定茶葉中兒茶素及咖啡堿[J].化學分析計量，2013，22（5）：27-29.

[11]郭宇姝，張沂，朱新生.茶多酚的提取分離與含量測定方法進展[J].解放軍藥學學報，2007，23（2）：121-124.

[12]劉小喬，李忠岐，高靜，等.茶多酚中兒茶素類的HPLC分析[J].光譜實驗室，2012，29（5）：2611-2615.

[13]谷勛剛，蔡繼寶，張正竹，等.HPLC-DAD分析紅茶兒茶素類物質和咖啡因的方法研究[J].安徽農業大學學報，2010，37（1）：5-10.

[14]吳白乙拉，包俊杰.用HPLC方法對中國茶葉中茶多酚等成分含量的定量分析[J].內蒙古民族大學學報：自然科學版，2009，24（1）：34-37.

[15]鄧永亮，馮雷，呂才有.一種快速檢測茶葉中兒茶素的HPLC方法[J].西南農業學報，2011，24（3）：932-935.

[16]孫曉莉，劉帥華，汪雷，等.高效液相色譜法同時測定五指山綠茶中5種兒茶素類成分[J].植物研究，2011，31（3）：377-380.

[17]王增明，郭慶東，謝芳，等.HPLC測定茶多酚中兒茶素類及咖啡因含量[J].中國藥學雜志，2011，46（21）：1674-1676.

[18]何昱，洪筱坤，王智華.茶多酚中兒茶素類及咖啡因的含量測定[J].中成藥，2003，25（10）：53-56.

[19]康海寧，陳波，韓超，等.HPLC法測定茶葉水提液中五種兒茶素和咖啡堿及其用于茶葉分類的研究[J].分析測試學報，2007，26（2）：211-215.

[20]高俊，夏濤，朱博，等.HPLC-PDA對茶葉中茶氨酸、兒茶素和生物堿的同時分離檢測研究[J].安徽農業大學學報，2008，35（3）：324-328.

[21]蔡明瑛，倪輝，李利君，等.液相色譜檢測烏龍茶水浸提物及其單寧酶水解產物中的兒茶素[J].中國食品學報，2013，13（5）：207-215.

[22]張戎睿，王舒雅，王富濟，等.HPLC法同時檢測茶葉中八種兒茶素[J].黑龍江醫藥，2011，24（5）：681-683.

[23]劉錦文，李紅玉，石瑞君，等.高效液相色譜法測定茶多酚中EGCG和ECG的含量[J].食品工業科技，2010，31（11）：372-374.

[24]中華人民共和國國家標準.茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[S].GB/T 8313-2008.

[25]朱紅.茶樹鮮葉中茶多酚含量變化的研究[J].四川農業大學學報，1998，16（3）：59-62.

[26]肖俊松，袁英髦，張愛雪，等.茶葉中茶多酚和生物堿的測定及聚類和線性判別分析[J].食品科學，2010，31（22）：343-348.

Simultaneous determination of some selected catechins and caffeine in tea by performance liquid chromatography

The contents of six catechins（GC，EGC，C，EGCG，ECG and EC）and limited composition caffeine were investigated by HPLC method with Hanbon BenetnachTMC18column（5μm×4.6mm×250mm）at 30℃and the UV detection wavelength was 280nm.The mobile phase was methanol-water-phosphorus acid（28∶72∶0.1，v/v/v）isocratic elution system，and the flow rate was 0.8mL·min-1.The results showed that the linear ranges of GC，EGC，C，EGCG，ECG，EC and caffeine were 0.10～1.00，0.16～1.00，0.10～1.00，0.05～0.50，0.10～1.50，0.10～2.00 and 0.02～1.00mg·mL-1respectively，and the correlation coefficients were ranged from 0.9984～0.9999.The average recoveries of the two most abundant compositions EGCG and CAF were 100.89%and 99.07%，respectively.The resolutions of the six object components were more than 2，except GC.The method was simple，rapid，accurate，reproducible and ideal for routine analysis of catechins and caffeine.

catechins；EGCG；caffeine；HPLC

TS201.2

A

1002-0306（2015）04-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.002

2014－06－04

張琪（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥物質基礎分析。

李翠芹（1969-），女，博士，副教授，研究方向：中藥物質基礎分析和生化分子藥理學。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BA106B06）；中央高?；究蒲袠I務費專項資金資助（GK201303009）。